一种哺乳动物细胞无血清培养基.pdf

公开了一种适合哺乳动物细胞，包括杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，尤其293细胞，生长的无血清培养基。还公开了驯化该培养基的方法。

1.  一种适合哺乳动物细胞生长的无血清培养基，其特征在于，该无血清培养基包括：
氨基酸成分，包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺；
维生素成分，包括生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醇盐酸盐、核黄素、盐酸硫氨、维生素B₁₂、腐胺二盐酸盐、维生素C、维生素E；
盐类，包括碳酸氢钠、氯化钙、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、氯化钠磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、丙酮酸钠；
脂类，包括油酸、胆固醇、乙醇胺、亚油酸、硫辛酸、脂质混合物；
微量元素，包括氯化钴、亚硒酸钠、氯化镍、氯化锰、乙二胺四乙酸钠盐、七钼酸铵、氯化铝、硫酸铬钾、硫酸铜、硝酸铁、硫酸亚铁、硫酸锌；
蛋白质包括胰岛素、牛血清白蛋白、转铁蛋白；和
二巯基乙醇；Pluronic F68、D-葡萄糖。

2.  如权利要求1所述的无血清培养基，所述哺乳动物细胞选自杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢细胞。

3.  如权利要求2所述的无血清培养基，其特征在于，所述哺乳动物细胞是293细胞。

4.  一种驯化哺乳动物细胞的方法，其特征在于，在权利要求1所述的培养基中培养哺乳动物细胞。

5.  如权利要求4所述的方法，所述哺乳动物细胞选自杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢细胞。

6.  如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞是293细胞。

一种哺乳动物细胞无血清培养基
技术领域
本发明涉及细胞培养、生物制药领域，更具体地涉及哺乳动物细胞培养基成分。
背景技术
重组DNA技术的发展已使蛋白质药物大规模生产、取代从生物原料提取成为可能；毫无疑问，随着人类基因组学和蛋白组学研究的开展，会有更多的基因功能得到鉴别，与之相应的将是会有更多的蛋白质药物出现并用于临床试验和疾病治疗。
蛋白质药物的生物合成有若干途径可以选择，包括哺乳动物细胞培养、微生物发酵、转基因动物和转基因植物。就目前来讲，微生物发酵主要用于不需要修饰的蛋白质药物生产，而大规模动物细胞培养主要用于翻译后需要糖基化等修饰的蛋白质的生产。虽然转基因动物、植物在蛋白质药物生产方面有大幅度降低生产成本的可能，但技术研发过程复杂，技术市场取向目前尚不能同大规模动物细胞培养相比。另外，蛋白质修饰物种之间的差异也可以对影响药物的功能和免疫反应程度造成影响。
经典的蛋白质药物研发过程需要一个相对漫长的过程。在药物结构和基本作用机理比较明确后，需要进一步对蛋白质分子改构，以期在药物代谢、毒性、抗原性等方面进一步改善。如果能够在药物研发的早期能够对大量变构品种筛选，不但可以大幅度提高药物研发速度，而且可以节省大量人力物力资源，也可能由于筛选范围的扩大而筛选出最佳变构体。另外，蛋白组学研究领域也面临多品种同时表达的通量瓶颈。
外源基因在动物细胞中的表达方式基本上有两种，即稳定表达和瞬时表达。在稳定表达方式中，外源基因整合到宿主细胞的染色体成为细胞的遗传特征的一部分，有丝分裂后在后代细胞中仍旧保留。由于高产稳定表达细胞株的建立和筛选需要耗费大量的时间和人力物力，一般在蛋白质药物结构最终决定之后采用，以利于大规模商业化生产的需要。在瞬时表达方式中，外源基因不需要整合到宿主细胞的染色体上，虽然后代细胞在有丝分裂后仍旧保留或自我合成外源基因表达目标蛋白质。显而易见，相对于稳定表达来说，瞬时表达具有更好的灵活性，更适合药物早期筛选阶段的多品种制备。293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞而得到的细胞系，适合外源蛋白质的瞬时表达。原始的293细胞是通过贴壁生长的方式生长的，通过驯化293细胞已经可以在悬浮环境中生长。
细胞培养基是细胞生长的关键原料。早期的培养基大多添加动物血清，利用其中的多种细胞因子刺激细胞分裂。动物血清的使用对蛋白质表达有若干不利因素，如产物纯化难度加大、来源限制、批次间生物活性差异(导致过程不稳定性)、生物污染(如疯牛病)等。因此，研究含已知成分的无血清培养基成为细胞培养领域中一项重要工作。一般来说，每一个细胞株都有其独特的营养需求，没有任何一种培养基会充分满足所有细胞株的需要或发挥细胞的最大工作潜力，针对具体生产过程配置并优化培养基成分是现代大规模细胞培养过程研究的主要任务之一。
发明简述
因此，本发明提供了一种能够适合哺乳动物悬浮生长的无血清培养基，可以用于外源蛋白质基因的规模化表达。
在本发明的一个方面，公开了一种适合哺乳动物细胞生长的无血清培养基，包括：
氨基酸成分，包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺；
维生素成分，包括生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醇盐酸盐、核黄素、盐酸硫氨、维生素B₁₂、腐胺二盐酸盐、维生素C、维生素E；
盐类，包括碳酸氢钠、氯化钙、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、氯化钠磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、丙酮酸钠；
脂类，包括油酸、胆固醇、乙醇胺、亚油酸、硫辛酸、脂质混合物；
微量元素，包括氯化钴、亚硒酸钠、氯化镍、氯化锰、乙二胺四乙酸钠盐、七钼酸铵、氯化铝、硫酸铬钾、硫酸铜、硝酸铁、硫酸亚铁、硫酸锌；
蛋白质包括胰岛素、牛血清白蛋白、转铁蛋白；和
二巯基乙醇；Pluronic F68、D-葡萄糖。
在该方面的一个具体实施方式中，哺乳动物细胞选自杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢细胞。优选哺乳动物细胞是293细胞。
在本发明的另一个方面，提供了一种驯化哺乳动物细胞的方法，包括在上述培养基中培养哺乳动物细胞。在该方面的一个优选实施例中，哺乳动物细胞选自杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢细胞。在另一个优选例中，哺乳动物细胞是293细胞。
在该方面的另一个方面，还公开了一种配置该无血清培养基的方法。

附图简述
图1.显示了实施例1 293细胞在本无血清培养基中的驯化适应过程。
图2.显示了实施例2 293细胞在本无血清培养基中的生长动力学过程。
具体实施方式
本发明利用细胞培养多孔板(如96孔板)作为细胞生长容器，以摇床作为传动装置实现流体混合，达到增加培养数量、实现高通量培养基成分优化的目的。
本发明利用活细胞对刃天青的还原反应所导致的605nm光密度降低值来反应培养中活细胞密度，可以简便地用于活细胞密度终点检测，活细胞浓度检测范围在0.05-10×10⁶细胞/ml之间。此外，由于刃天青的氧化还原反应不影响细胞的代谢，因此不象与核或细胞器结合的试剂那样，测试后造成细胞死亡。
本文所述的高通量细胞培养方法和活细胞检测方法可以高效率地应用于细胞培养基筛选和培养基成分优化。常规的正交实验需要进行大量的重复实验，若采用常规实验设备如转瓶或发酵罐将受到实验室规模等的限制，对大量浓度变量同时实验是不可能的，而分批实验也会由于细胞接种质量和细胞计数差异等因素使批次结果间失去可比性。而本发明在一块96孔板中就可进行几组甚至几十组实验，而且培养规模小、速度快，结合简便的细胞浓度检测方法，大大节约了研究成本，对于细胞培养条件的研究是一个重要的进步。
下文提供了实施例进一步说明了本发明。这些例子不是为了限制本发明的范围。
实施例
实施例1：无血清培养基配置(1升)
根据下表1配制了培养基：
表1.动物细胞无血清培养基成分