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突变的葡萄糖脱氢酶
技术领域
本发明涉及表现出改进的底物特异性的突变的葡萄糖脱氢酶。本发明的突变的葡萄糖脱氢酶可以合适地用于葡萄糖传感器、葡萄糖测定试剂盒等，并且在生物化学、临床医学等领域中有用。
背景技术
近年中，将多种酶用作生物传感器元件。已经将葡萄糖氧化酶(GODs)实际用作测量血糖水平的传感器元件，用于诊断糖尿病的目的。但是，GODs的问题是它们受到样品中溶解的氧的影响。因此，不受样品中溶解的氧影响的葡萄糖脱氢酶(GDHs)引起了注意，作为GODs的替代。
作为GDHs，报道了一种需要NAD(P)⁺作为辅酶(E.C.1.1.1.47)，一种需要pyroloquinoline quinone(PQQ)作为辅酶(PQQGDH；E.C.1.1.99.17)，等等。需要NAD(P)⁺作为辅酶的GDH的问题是作为传感器元件，需要在测定系统中加入NAD(P)⁺。相反，对于辅酶结合型GDHs，如PQQGDH，不需要在测定系统中加入辅酶。
此外，传感器元件需要表现出稳定性，当它们连续使用或保持在室温中时不丧失传感器的功能。
由于来源于在高温下生长的嗜热细菌的酶通常表现出高稳定性，并且在长期储存中甚至也表现出高稳定性，预期可以连续使用，并且因此可以将它们用作传感器元件。但是，尽管已经报道来源于嗜酸热原体和硫磺矿硫化叶菌的GDHs是来源于嗜热细菌的耐热GDHs，但两者都需要NAD(P)⁺作为辅酶。
另一方面，由一种中度嗜热的细菌，即洋葱伯克霍尔德氏菌产生的耐热GDH是FAD结合型GDH，并且其酶学特征如最优反应温度、热稳定性和底物特异性已经得到阐述(专利文件1)。这种GDH通常作为异寡聚物存在，由高度抗热的催化亚基(α-亚基)和电子转移亚基(β-亚基)，即细胞色素C和功能未知的γ-亚基组成，其最优反应温度是45℃。这些亚基被温度高于50℃的热处理解离，以释放最优反应温度为75℃的α-亚基单体。α-亚基单体是耐热的，甚至在60℃热处理30分钟后表现出80％或更多的残留活性。也已经分离了编码这些亚基的基因(专利文件1和2)。
但是，辅酶结合型GDHs通常表现出广泛的底物特异性，并且也与麦芽糖、半乳糖等，以及葡萄糖反应。当它们作为监测糖尿病患者的血糖水平的葡萄糖传感器施用，并且糖尿病患者具有严重症状以至于必须进行腹膜透析时，存在可能获得比真实血糖水平更高的值的可能，因为在透析物中含有大量的麦芽糖。来源于洋葱伯克霍尔德氏菌的GDH也表现出除葡萄糖之外，对麦芽糖和半乳糖的反应性。
通过导入氨基酸取代突变而改变GDH的底物特异性的技术是本领域公知的。例如，作为所述突变的GDHs，存在来源于大肠杆菌(专利文件3和4)、乙酸钙不动杆菌(乙酸钙葡糖杆菌)(专利文件5)和鲍氏不动杆菌(专利文件6-8)的公知的PQQGDHs，它们需要pyroloquinoline quinone作为辅酶。
[专利文件1]美国专利申请No.2004/0023330
[专利文件2]国际专利公开WO03/091430
[专利文件3]日本专利公开(Kokai)No.10-243786
[专利文件4]日本专利公开No.2001-197888
[专利文件5]日本专利公开No.2004-173538
[专利文件6]日本专利公开No.2004-313172
[专利文件7]日本专利公开No.2004-313180
[专利文件8]日本专利公开No.2004-344145
发明公开
本发明的一个目的是提供表现出对葡萄糖的改进的底物特异性的FAD结合型GDH。
本发明的发明人进行了多项研究，以获得上述目的。结果，他们发现通过在特定位点修饰来源于洋葱伯克霍尔德氏菌的FAD结合型GDH，可以降低其对除葡萄糖之外的糖类的反应性，同时保持对葡萄糖的反应性，因此完成了本发明。
也就是说，本发明提供了以下内容。
(1)表现出对葡萄糖的改进的底物特异性的突变的葡萄糖脱氢酶，其是具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列或包括在除以下列出的位置外的位置取代、缺失、插入或添加一个或多个氨基酸残基的SEQ IDNO：13的氨基酸序列，并且具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白，并且其具有以下列出的任意氨基酸取代突变(数字代表氨基酸序列中的位置，氨基酸残基代表在该位置取代后的氨基酸残基，“+”表示同时包括两种氨基酸取代)：
(A)472Arg，472Asn，472Asp，472Cys，472Glu，472GIy，472His，472Ile，472Leu，472Met，472Phe，472Pro，472Ser，472Trp，472Tyr，472Val，
(B)475Asp，475Cys，475Glu，475Gly，475His，475Met，475Phe，475Ser，475Tyr，475Val，
(C)472Arg+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，
472Asn+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，
472Asp+475(His，Phe，Ser，Val)，
472Cys+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser)，
472Glu+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，
472Gly+475(Asp，Cys，Gly，Met，Phe，Ser，Tyr)，
472His+475(Cys，Glu，His，Met，Phe，Ser，Tyr)，
472Ile+475(Asp，Cys，Glu，Gly，His，Met，Phe，Ser，Tyr)，
472Leu+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，
472Met+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser)，
472Phe+475(Asp，Glu，Gly，His，Met，Phe，Ser，Tyr)，
472Pro+475His
472Ser+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser)，
472Trp+475(His，Phe，Ser)，
472Tyr+475(Asp，His，Phe，Ser)，
472Val+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser)。
(2)前述突变的葡萄糖脱氢酶，其具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列，前提是它包括前述(A)-(C)中列出的任意氨基酸取代突变。
(3)前述突变的葡萄糖脱氢酶，其具有选自以下突变的氨基酸取代突变：
(D)472Arg，472Asn，472Asp，472Glu，472Gly，472Phe，472Pro，
(E)475Asp，475Cys，475Glu，475Gly，475Met，475Phe
(F)472Arg+475(Asp，Gly，His，Phe)，
472Asn+475(Gly，His，Phe，Tyr)，
472Asp+475(His，Ser)，
472Cys+475(Gly，His，Phe)，
472Glu+475(Glu，His，Phe，Tyr)，
472Gly+475(Asp，Phe，Tyr)，
472His+475(His，Ser)，
472Ile+475(Asp，Glu，Gly，His，Ser)，
472Leu+475(Gly，His，Phe，Tyr)，
472Met+475(Asp，Gly，His，Phe)，
472Phe+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，
472Ser+475(Glu，Gly，His，Phe)，
472Trp+475(His，Phe)，
472Tyr+475His，
472Val+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe)。
(4)葡萄糖脱氢酶，其是具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列或包括在除以下列出的位置外的位置取代、缺失、插入或添加一个或多个氨基酸残基的SEQ ID NO：13的氨基酸序列，并且具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白，并且其中：
(i)SEQ ID NO：13的氨基酸序列中至少第472位的精氨酸残基或第475位的天冬酰胺残基被另一种氨基酸残基取代，并且
(ii)导入前述突变的葡萄糖脱氢酶对葡萄糖的比活性和对麦芽糖的比活性的比值((对麦芽糖的反应性/对葡萄糖的反应性)×100)与没有导入突变的葡萄糖脱氢酶的该比值相比减少了10％或更多。
(5)突变的葡萄糖脱氢酶复合物，至少包含前述突变的葡萄糖脱氢酶和电子转移亚基。
(6)编码前述突变的葡萄糖脱氢酶的DNA。
(7)具有前述DNA并且产生前述突变的葡萄糖脱氢酶或突变的葡萄糖脱氢酶复合物的微生物。
(8)葡萄糖测定试剂盒，包含前述突变的葡萄糖脱氢酶、突变的葡萄糖脱氢酶复合物或微生物。
(9)葡萄糖传感器，包含前述突变的葡萄糖脱氢酶、突变的葡萄糖脱氢酶复合物或微生物。
在本说明书中，尽管术语“突变的GDH”是指与突变的GDH复合物不同的内容中的突变的α-亚基，但突变的α-亚基和突变的GDH复合物也可以通称为“突变的GDH”。

附图简述
图1显示了DH5α/pTrc99A/γ+α对作为底物的葡萄糖和麦芽糖的脱氢酶活性。菱形代表对葡萄糖的活性，矩形代表对麦芽糖的活性(图2-5中也是如此)。
图2显示了DH5α/pTrcγαAsn475Asp对作为底物的葡萄糖和麦芽糖的脱氢酶活性。
图3显示了DH5α/pTrc99Aγαβ对作为底物的葡萄糖和麦芽糖的脱氢酶活性。
图4显示了DH5α/pTrcγαβAsn475Asp对作为底物的葡萄糖和麦芽糖的脱氢酶活性。
图5显示了DH5α/pTrcγαβAsn475Glu对作为底物的葡萄糖和麦芽糖的脱氢酶活性。
图6显示了用于对GDHα-亚基中第472和475位进行密码子取代的PCR引物的序列。
图7显示了突变的GDHs的SV图。
图8显示了突变的GDHs的SV图。
图9显示了葡萄糖传感器的结构。
图10显示了葡萄糖传感器的试剂部分。
图11显示了采用野生型GDH的葡萄糖传感器的葡萄糖反应性。
图12显示了采用472Glu475Tyr型GDH的葡萄糖传感器的葡萄糖反应性。
图13显示了采用472Asp475His型GDH的葡萄糖传感器的葡萄糖反应性。
图14显示了葡萄糖存在下，采用野生型GDH的葡萄糖传感器的麦芽糖反应性。
图15显示了葡萄糖存在下，采用472Glu475Tyr型GDH的葡萄糖传感器的麦芽糖反应性。
图16显示了葡萄糖存在下，采用472Asp475His型GDH的葡萄糖传感器的麦芽糖反应性。
图17显示通过采用野生型GDH和突变的GDH的葡萄糖传感器测量的表现血糖水平。
实施本发明的最佳方式
下文中将详细解释本发明。
本发明的突变的GDH是通过将特定突变导入野生型GDH而制备的。野生型GDH的实例包括由洋葱伯克霍尔德氏菌产生的GDHs。由洋葱伯克霍尔德氏菌产生的GDHs的实例包括由洋葱伯克霍尔德氏菌KS1、JCM2800和JCM2801菌株产生的GDHs。KS1菌株于2000年9月25日保藏于独立的管理机构，即国际专利生物保藏机构-通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)，保藏号是FERM BP-7306。JCM2800和JCM2801菌株储存在独立的管理机构，即RIKEN，Bioresource Center，日本微生物保藏中心(JCM)。
含有KS1菌株的GDHα-亚基基因和部分β-亚基基因的染色体DNA片段的核苷酸序列示于SEQ ID NO：11(美国专利申请No.2004/0023330)。该核苷酸序列中存在3个可读框(ORF)，从5’末端侧开始的第二个和第三个ORFs分别编码α-亚基(SEQ ID NO：13)和β-亚基(SEQ ID NO：14)。此外，推定第一个ORF编码γ-亚基(SEQID NO：12)。此外，含有全长β-亚基基因的片段的核苷酸序列示于SEQID NO：15。此外，β-亚基的氨基酸序列示于SEQ ID NO：16。推定SEQ ID NO：16中的氨基酸1-22相应于信号肽。尽管SEQ ID NOS：15和16中的第一个氨基酸残基是Val，它们很可能是Met，并且可能在翻译后去除。
本发明的突变的GDH可以由单独的α-亚基、包含α-亚基和β-亚基的复合物，或包含α-亚基、β-亚基和γ-亚基的复合物组成。通过在任何情况下将特定突变导入α-亚基，并且可能在上述特定突变外具有保守突变，获得本发明的突变的GDH。此外，其它的亚基可以是野生型亚基或具有保守突变。术语“保守突变”表示不显著影响GDH活性的突变。
本发明的突变的α-亚基优选具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列，但是其包含下文描述的特定突变。此外，突变的α-亚基可以具有前述保守突变，只要它具有GDH活性。也就是说，它可以是具有除上述特定突变外，包含一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的SEQ ID NO：13的氨基酸序列的蛋白。SEQ ID NO：13具有可以由SEQ ID NO：11的核苷酸序列编码的氨基酸序列。但是，在翻译后可以去除N-末端的甲硫氨酸残基。前述“一个或几个”优选表示1-10的数目，更优选1-5，特别优选1-3。
此外，β-亚基典型地具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列。但是，只要它作为GDH的β-亚基起作用，它可能是具有包括一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的SEQ ID NO：16的氨基酸23-425的氨基酸序列的蛋白。前述术语“一个或几个”优选表示1-20的数目，更优选1-10，特别优选1-5。“作为GDH的β-亚基起作用”表示作为细胞色素C，而不降解GDH的酶活性。
野生型α-亚基基因的特定实例包括含有相应于SEQ ID NO：11的核苷酸764-2380的核苷酸序列的DNA。此外，α-亚基基因可以是具有相应于SEQ ID NO：11的核苷酸序列中的核苷酸764-2380的核苷酸序列的DNA，或在严格条件下可以与从该序列制备的探针杂交，并且编码具有GDH活性的蛋白的DNA。
此外，β-亚基基因的特定实例包括具有相应于SEQ ID NO：9的核苷酸187-1398的核苷酸序列的DNA。此外，β-亚基基因可以是具有相应于SEQ ID NO：9的核苷酸187-1398的核苷酸序列的DNA，或在严格条件下可以与从该序列制备的探针杂交，并且编码可以作为β-亚基起作用的蛋白的DNA。
前述严格条件的实例包括，例如，以下条件：具有70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，特别优选95％或更高同源性的DNAs彼此杂交，并且特定实例是60℃下1×SSC，0.1％SDS的条件。
可以通过例如采用洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株的染色体DNA作为模板的PCR获得α-亚基基因和β-亚基基因。可以基于前述核苷酸序列，通过化学合成制备PCR的引物。此外，也可以采用基于作为探针的前述序列制备的寡核苷酸，通过杂交从洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株的染色体DNA获得引物。此外，也可以相似地从洋葱伯克霍尔德氏菌的其它菌株获得其变体。其它菌株的实例包括前述JCM2800和JCM2801菌株。由这些菌株产生的GDHs的α-亚基分别与KS1菌株的α-亚基具有95.4和93.7％的同源性。
此外，甚至可以将其它微生物产生的GDHs用于制备本发明的突变的GDH，只要它们具有与洋葱伯克霍尔德氏菌产生的GDH相似的结构和酶学特征。
在本发明的突变的GDH中，通过将特定突变导入前述野生型GDH而改进对葡萄糖的底物特异性。“改进对葡萄糖的底物特异性”是指对其它糖类，如单糖、二糖和寡糖，例如麦芽糖、半乳糖、木糖等的反应性降低，同时基本维持对葡萄糖的反应性，或与对其它糖类的反应性相比，对葡萄糖的反应性改进。例如，即使对葡萄糖的反应性降低，但如果对其它糖类的反应性降低更大的程度，则改进了对葡萄糖的底物特异性。此外，即使对其它糖类反应性升高，但如果对葡萄糖的底物特异性升高更大的程度，则改进了对葡萄糖的底物特异性。具体地，如果对葡萄糖的比活性与对其它糖类，如麦芽糖的比活性的比值((对另一种糖的反应性/对葡萄糖的反应性)×100)减少10％或更多，优选20％或更多，更优选50％或更多，则改进了对葡萄糖的底物特异性。
前述特定突变表示在SEQ ID NO：13的氨基酸序列中第472位的氨基酸取代、第475位的氨基酸取代，和第472和475位两者的氨基酸取代。突变的更特定的实例包括下文所述的氨基酸取代。示出的数字代表氨基酸序列中的位置，氨基酸残基代表对前述位置取代后的氨基酸残基，“+”表示同时包含了两个氨基酸取代。在以下氨基酸取代中，第472位的氨基酸取代列于(A)中，第475位的氨基酸取代列于(B)，第472和475位两者的氨基酸取代列于(C)。例如，“472Asn+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)”表示用Asn取代第472位的氨基酸残基(野生型中的Ala)，并且用Asp、Gly、His、Phe、Ser或Tyr取代第475位的氨基酸残基(野生型中的Asn)的突变。
(A)472Arg，472Asn，472Asp，472Cys，472Glu，472Gly，472His，472Ile，472Leu，472Met，472Phe，472Pro，472Ser， 472Trp，472Tyr，472Val，
(B)475Asp，475Cys，475Glu，475Gly，475His，475Met，475Phe，475Ser，475Tyr，475Val，
(C)472Arg+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，
472Asn+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，
472Asp+475(His，Phe，Ser，Val)，
472Cys+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser)，
472Glu+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，
472Gly+475(Asp，Cys，Gly，Met，Phe，Ser，Tyr)，
472His+475(Cys，Glu，His，Met，Phe，Ser，Tyr)，
472Ile+475(Asp，Cys，Glu，Gly，His，Met，Phe，Ser，Tyr)，
472Leu+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，
472Met+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser)，
472Phe+475(Asp，Glu，Gly，His，Met，Phe，Ser，Tyr)，
472Pro+475His
472Ser+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser)，
472Trp+475(His，Phe，Ser)，
472Tyr+475(Asp，His，Phe，Ser)，
472Val+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser)。
在前述的氨基酸取代中，优选取代如下：
(D)472Arg，472Asn，472Asp，472Glu，472Gly，472Phe，472Pro，
(E)475Asp，475Cys，475Glu，475Gly，475Met，475Phe
(F)472Arg+475(Asp，Gly，His，Phe)，
472Asn+475(Gly，His，Phe，Tyr)，
472Asp+475(His，Ser)，
472Cys+475(Gly，His，Phe)，
472Glu+475(Glu，His，Phe，Tyr)，
472Gly+475(Asp，Phe，Tyr)，
472His+475(His，Ser)，
472Ile+475(Asp，Glu，Gly，His，Ser)，
472Leu+475(Gly，His，Phe，Tyr)，
472Met+475(Asp，Gly，His，Phe)，
472Phe+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，
472Ser+475(Glu，Gly，His，Phe)，
472Trp+475(His，Phe)，
472Tyr+475His，
472Vai+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe)。
前述氨基酸取代突变的位置是SEQ ID NO：13，即洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株的野生型GDHα-亚基的氨基酸序列中的位置，以及GDHα-亚基同源物或变体中的位置，所述同源物或变体具有除前述特定突变外取代、缺失、插入或添加一个或多个氨基酸残基的SEQ IDNO：13的氨基酸序列，所述位置相应于通过于SEQ ID NO：13的氨基酸序列进行比对而确定的前述氨基酸取代的位置。例如，在1-471位的区域中缺失一个氨基酸残基的保守GDH α-亚基变体中，第472和475位代表变体中的第471和第474位。
本发明的发明人研究了葡萄糖脱氢酶中参与结合FAD的区域和附近区域作为导入改进底物特异性的突变的位置。作为参与结合FAD的区域，考虑了FAD附近的区(覆盖FAD的盖)或FAD结合域，具体是相应于SEQ ID NOS：1-4的氨基酸序列的区域。
术语“相应于氨基酸序列的区域”表示在具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株的GDHα-亚基中，具有SEQ ID NO：1、2或4的氨基酸序列的区域，即，SEQ ID NO：13的氨基酸88-92、57-61和470-504的区域。此外，在具有与SEQID NO：13的氨基酸序列同源的氨基酸序列的GDH α亚基中，这些区域是相应于通过与SEQ ID NO：13的氨基酸序列比对确定的前述洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株的GDHα-亚基中的氨基酸88-92、57-61或470-504的区域。
本发明的发明人比较了用FAD作为辅酶的GMC氧化还原酶家族酶、氧化葡糖杆菌的山梨糖醇脱氢酶(GenBank编码AB039821)、草生欧文氏菌的2-酮戊二酸脱氢酶(GenBank编号AF068066)、Phanerochaete chrysosporium的纤维二糖脱氢酶(CDH)(J.Mol.Biol.，315(3)，421-34(2002))、链霉菌种的胆固醇氧化酶(COD)(J.Struct.Biol.116(2)，317-9(1996))和尼崎青霉的葡萄糖氧化酶(Eur.J.Biochem.252，90-99(1998))的氨基酸序列，发现了FAD结合域和覆盖FAD的盖保守的区域，和脯氨酸保守的区域，脯氨酸是参与蛋白折叠的氨基酸残基。然后，他们检验了通过修饰这些区域和其它区域之间的边界附近的序列而改进底物特异性的可能性。结果，他们证实了可以通过前述氨基酸残基的突变改进底物特异性。
可以通过定点诱变将相应于需要的氨基酸突变的核苷酸突变导入编码GDHα-亚基的DNA(α-亚基基因)，并且使用合适的表达系统表达获得的突变DNA，从而获得具有需要的突变的GDHα-亚基。此外，可以通过表达编码突变的GDHα-亚基的DNA以及编码β-亚基的DNA(β-亚基基因)或β-亚基基因和编码γ-亚基的DNA(γ-亚基基因)，获得突变的GDH复合物。为了将突变导入编码GDHα-亚基的DNA，也可以使用编码GDHα-亚基、γ-亚基和β-亚基(以此顺序)的多顺反子DNA片段。
可以通过以下方法确定导入突变的GDHα-亚基或GDH复合物对糖类的底物特异性：通过实施例中描述的方法检验对各种糖类的反应性，并且将其与野生型α-亚基或野生型GDH复合物的反应性进行比较。
可以通过例如采用洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株的染色体DNA作为模板和具有SEQ ID NOS：12和13的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物的PCR获得编码α-亚基、γ-亚基和β-亚基(以此顺序)的多顺反子DNA片段(参见下文描述的实施例)。
用于获得GDH亚基的基因、导入突变、表达基因等的载体的实例包括在埃希氏菌属细菌中起作用的载体，其特定实例包括pTrc99A，pBR322，pUC18，pUC118，pUC19，pUC119，pACYC184，pBBR122等。用于表达基因的启动子的实例包括lac，trp，tac，trc，P_L，tet，PhoA等。此外，可以通过在含有启动子的表达载体中的合适位点插入α-亚基基因或其它亚基基因，以一个步骤进行这些基因在载体中的插入和启动子的连接。所述表达载体的实例包括pTrc99A，pBluescript，pKK223-3等。
此外，可以将α-亚基基因或其它亚基基因以可表达的形式掺入宿主微生物的染色体DNA。
用重组载体转化微生物的方法的实例包括，例如，采用钙处理的感受态细胞法、原生质体法、电穿孔等。
宿主微生物的实例包括芽孢杆菌属细菌，如枯草芽孢杆菌、酵母，如啤酒糖酵母，和丝状真菌，如黑曲霉。但是，宿主微生物不限于这些实例，并且可以使用适于产生外来蛋白的宿主微生物。
可以将本发明的突变的α-亚基、突变的GDH复合物和表达它们的微生物用作葡萄糖传感器的酶电极或葡萄糖测定试剂盒的成分。采用洋葱伯克霍尔德氏菌的野生型GDH的葡萄糖传感器和葡萄糖测定试剂盒描述于美国专利No.2004/0023330A1。本发明的突变的GDH也可以以相似的方式使用。
实施例
将参照以下实施例更具体解释本发明。但是，本发明的范围不限于这些实施例。
实施例1：表达洋葱伯克霍尔德氏菌的GDH的质粒
作为表达洋葱伯克霍尔德氏菌的GDH的质粒，制备了表达GDHα-亚基和γ-亚基的质粒和表达α-亚基、β-亚基和γ-亚基的质粒。
<1>表达GDH α-亚基和γ-亚基的质粒
作为表达α-亚基和γ-亚基的质粒，使用了描述于WO02/036779中的质粒pTrc99A/γ+α。该质粒是通过将按顺序含有分离自洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株(FERM BP-7306)的染色体DNA的GDHγ-亚基结构基因和α-亚基结构基因插入载体pTrc99A(Pharmacia)中作为克隆位点的NcoI/HindIII位点而获得的质粒。该质粒中的GDHγα基因受trc启动子的调节。pTrc99A/γ+α具有氨苄青霉素抗性基因。
<2>表达GDH α-亚基、β-亚基和γ-亚基的质粒
按照以下方法制备表达GDH α-亚基、β-亚基和γ-亚基的质粒。
(1)制备洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株的染色体DNA。
以常规方法从洋葱伯克霍尔德氏菌KS1菌株制备染色体基因。也就是说，采用TL液体培养基(1L中含有10g聚蛋白胨，1g酵母提取物，5g NaCl，2g KH₂PO₄，5g葡萄糖，pH7.2)，34℃下在培养基中振荡菌株细胞过夜。通过离心收集生长的细胞。将细胞悬浮在含有10mM NaCl，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA，0.5％SDS和100μg/ml蛋白酶K的溶液中，50℃下处理6小时。在混合物中加入等体积的苯酚-氯仿，在室温下将混合物搅拌10分钟。然后，通过离心收集上清液。在上清液中加入终浓度为0.3M的乙酸钠，覆盖2倍体积的乙醇，以便在中间层中沉淀染色体DNA。用玻璃棒收集DNA，用70％的乙醇洗涤，然后溶解于合适体积的TE缓冲液中，获得染色体DNA溶液。
(2)制备编码GDHγ-亚基、α-亚基和β-亚基的DNA片段。
采用前述染色体DNA作为模板，具有以下序列的寡核苷酸作为引物，通过PCR扩增编码GDH γ-亚基、α-亚基和β-亚基的DNA片段。
[正向引物]
5’-CATGCCATGGCACACAACGACAACAC-3’(SEQ ID NO：5)
[反向引物]
5’-GTCGACGATCTTCTTCCAGCCGAACATCAC-3’(SEQ ID NO：6)
对扩增的片段的C-末端侧进行平端化，用Ncol消化N-末端侧，将片段连接到相似处理的pTrc99A(Pharmacia)中。用获得的重组载体转化大肠杆菌DH5α，收集在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基上生长的菌落。在液体LB培养基上培养获得的转化体，提取质粒，分析插入质粒中的DNA片段。结果，证实了大约3.8kb的插入的片段。将该质粒命名为pTrc99Aγαβ。该质粒中GDH的结构基因受到trc启动子的调节。pTrc99Aγαβ具有氨苄青霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因。
实施例2：将突变导入GDHα-亚基基因
通过采用商购的定点诱变试剂盒(QuikChangeII Site-DirectedMutagenesis Kit，Stratagene)，用天冬氨酸的密码子(GAT)或谷氨酸的密码子(GAA)取代实施例1中描述的质粒pTrc99A/γ+α和pTrc99Aγαβ中含有的GDHα-亚基基因中第475位的天冬酰胺的密码子(AAT)。作为引物，使用了以下寡核苷酸。下文中，将用天冬氨酸残基取代第475位的天冬酰胺称作“Asn475Asp”，用谷氨酸残基取代第475位的天冬酰胺称作“Asn475Glu”。
Asn475Asp取代的引物
[正向引物]
5’-CGCGCCGAACGATCACATCACGGGC-3’(SEQ ID NO：7)
[反向引物]
5’-GCCCGTGATGTGATCGTTCGGCGCG-3’(SEQ ID NO：8)
Asn475Glu取代的引物
[正向引物]
5’-GAATTCGCGCCGAACGAACACATCACGGGCTCG-3’(SEQ IDNO：9)
[反向引物]
5’-CGAGCCCGTGATGTGTTCGTTCGGCGCGAATTC-3’(SEQ IDNO：10)
采用以下反应组成进行PCR。在95℃下反应30秒后，重复95℃下30秒，55℃下1分钟和68℃下8分钟的一轮反应15次。然后，在68℃下反应30分钟后，将反应混合物在4℃下维持。
[反应混合物组成]
模板DNA(5ng/μl)       2μl
(pTrc99A/γ+α和pTrc99Aγαβ)
10x反应缓冲液          5μl
正向引物(100ng/μl)    1.25μl
反向引物(100ng/μl)    1.25μl
dNTP                   1μl
蒸馏水                 38.5μl
DNA聚合酶              1μl
总量                   50μl
PCR后，在反应混合物中加入0.5μl DNA聚合酶I，将混合物在37℃温育1小时，以分解模板质粒。
用获得的反应混合物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞(supE44，ΔlacU169(φ80lacZΔM15)，hsdR17，recAi，endA1，gyrA96，thi-1，relA1)。从在含有氨苄青霉素(50μl/ml)和卡那霉素(30μl/ml)的LB琼脂培养基(1％细菌用胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，1.5％琼脂)上生长的一些菌落制备质粒DNA，进行序列分析，证实目标突变已经被导入GDHα-亚基基因。将导入Asn475Asp突变的pTrc99A/γ+α和pTrc99Aγαβ分别称作pTrcγαAsn475Asp和pTrcγαβAsn475Asp。此外，将导入Asn475Glu突变的pTrc99A/γ+α和pTrc99Aγαβ分别称作pTrcγαAsn475Glu和pTrcγαβAsn475Glu。
实施例3：突变的GDHs的底物特异性分析
采用实施例2中获得的表达突变的GDH的质粒制备突变的GDH，检验其底物特异性。
(1)培养
振荡下在L形试管中在37℃下在2ml LB培养基(含有50μg/ml氨苄青霉素和30μg/ml卡那霉素)中培养导入了pTrcγαAsn475Glu和pTrcγαβAsn475Glu的大肠杆菌DH5α菌株。将这些培养液接种在装在500-ml Sakaguchi烧瓶中的150ml LB培养基(含有50μg/ml氨苄青霉素和30μg/ml卡那霉素)中，在振荡下在37℃培养细胞。培养开始后3小时，加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，将细胞进一步培养2小时。
(2)制备酶样品
从按照上文的描述获得的每个培养液收集细胞，洗涤，然后悬浮于含有每0.3mg湿细胞1ml 0.2％Triton X-100的10mM磷酸钾缓冲液(PPB，pH 7.0)中，通过超声处理破碎。离心(10000rpm，10分钟，4℃)该悬浮液以除去残留物，然后超速离心(50,000 r.p.m.，60分钟，4℃)上清液，将获得的上清液(水溶性级分)用作粗酶样品。进一步，通过常规的疏水层析(柱子：Octyl Sepharose，AmershamBiosciences)和离子交换层析(Q-Sepharose，Amersham Biosciences)纯化该样品，获得纯化的酶样品。通过采用GDH活性作为指标，确定目标酶级分。
(3)GDH活性的测量
在8μl前述纯化的酶样品中加入8μl用于测量活性的试剂(在12μl600mM甲基吩嗪硫酸二甲酯(PMS)和120μl 6mM 2，6-二氯苯酚-靛酚(DCIP)中加入含有0.2％(w/v)Triton X-100的10mM PPB，达到480μl的总体积而获得的溶液)。采用铝块温度调节室，使该混合物在每个反应温度预温育1分钟，然后在混合物中迅速加入每个浓度的8μl底物(葡萄糖或麦芽糖)或蒸馏水，搅拌混合物。采用分光光度计测量作为DCIP-引起的吸收波长的600nm处的吸光度。试剂DCIP和PMS的终浓度分别是0.06和0.6mM。底物的终浓度是40，20，10和5mM。
结果示于表1和图1-5。
表1

  底物浓度    mM         活性(U/ml)   葡萄糖  麦芽糖pTrc99A/γ+α    40    20    10    5    1.65    1.70    1.71    1.57    1.01    1.03    1.07    0.72pTrcγαAsn475Asp    40    20    10    5    19.46    7.75    4.15    2.53    1.30    0.67    0.21    0.00pTrc99Aγαβ    40    20    10    5    5.49    5.38    5.03    4.20    1.82    1.78    1.57    1.24pTrcγαβAsn475Asp    40    20    10    5    11.57    6.53    3.21    2.50    1.35    0.93    0.39    0.13pTrcγαβAsn475Glu    40    20    10    5    8.62    7.13    6.12    4.95    2.10    1.26    0.84    0.43
从这些结果可以明确看出，所有突变的GDHs对麦芽糖的反应性都明显降低，而保持了对葡萄糖的反应性，即，改进了它们对葡萄糖的特异性。
实施例4：将突变导入GDH α-亚基基因
在实施例1中获得的pTrc99Aγαβ中所包含的GDHα-亚基基因中的第475位和邻近位置导入突变，并且评估突变的酶的底物特异性。按照与实施例2相同的方式导入突变。用于导入突变的引物按照如下方法制备。在图6中示出的基本引物(野生型)(正向引物：SEQ IDNO：17，反向引物：SEQ ID NO：18)中，在图6中提到的密码子改变表中所示的预定位置(第472位和第475位)改变密码子，以制备用于导入多种突变的引物。
实施例5：突变的GDHs的底物特异性分析
采用实施例4中获得的表达突变的GDH的质粒，通过与实施例3相同的方式制备突变的GDHs，并且检验其底物特异性。通过采用粗酶样品检验酶活性。每种突变的GDH对葡萄糖的比活性、对麦芽糖的比活性和反应比值(对麦芽糖的比活性/对葡萄糖的比活性，单位是U/ml)示于表2-7。当对葡萄糖的比活性是0.5U/ml或更低时，判断无活性，这种结果在表中以“-”表示。
结果，对于第475位，证实了除实施例2中进行的用天冬氨酸(GAT)或谷氨酸(GAA)取代天冬酰胺外的取代也具有改进底物特征的作用。此外，发现用另一种氨基酸取代第475位附近第472位的天冬酰胺(AAC)也改进了底物特性。此外，也发现第472位和第475位的氨基酸取代的组合可以协同改进底物特征。
表2
底物浓度：10mM
对葡萄糖的比活性(U/ml培养液)

表3
底物浓度：10mM
对麦芽糖的比活性(U/ml培养液)

表4
底物浓度：10mM
麦芽糖/葡萄糖(反应比值)

总共：60
表5
底物浓度：10mM
对葡萄糖的比活性(U/ml培养液)

表6
底物浓度：10mM
对麦芽糖的比活性(U/ml培养液)

表7
底物浓度：10mM
麦芽糖/葡萄糖(反应比值)

总共：60
实施例6：基于SV曲线评估纯化的酶
获得表现出实施例5中的改进的底物特异性的一些突变的GDHs的SV曲线。以与实施例3中相同的方式纯化每种突变的GDH。结果示于图7和8以及表8。
结果，证实纯化的酶的反应比值(对麦芽糖的比活性/对葡萄糖的比活性)也得到改进，并且低于所有检验的底物浓度下野生型的该比值。此外，由于结果基本与采用实施例5中的粗酶溶液获得的测量结果基本一致，可以证实采用粗酶进行的修饰的酶的筛选的足够可行性。此外，从这些候选物选择用于葡萄糖传感器的修饰的酶。为此目的，由于血麦芽糖水平最多升高到200mg/dl，特别注意了底物浓度180和90mg/dl时的反应比值。结果，选择472Asp475His作为候选物，其对葡萄糖的反应性没有像野生型那样降低，并且选择72Glu475Tyr作为候选物，其对葡萄糖的反应性降低，但几乎不与麦芽糖反应。
表8
酶特征的评估



实施例7：制备用于采用突变的GDHs测量血糖水平的比色传感器
采用472Asp+475His型突变GDH和472Glu+475Tyr型突变GDH制备用于测量血糖水平的比色传感器。
制备具有图9所示基本结构的葡萄糖传感器(1)。也就是说，前述葡萄糖传感器具有如下构造：通明盖(4)(材料：PET)通过间隔区(3)层压在透明的底板(2)上，通过元件(2)-(4)限定毛细管(5)。毛细管(5)的尺寸是1.3mm×9mm×50μm(图9)。透明的底板(2)和透明盖(4)是用厚度为250μm的PET制成，间隔区(3)是用黑色的双面胶带制成。
葡萄糖传感器具有图10所示的第一试剂部分(1)、第二试剂部分(2)和第三试剂部分(3)，每个部分的成分和涂布量示于表9。该表中，“Ru”代表六氨合钌复合物(Ru(NH₃)₆Cl₃)，CHAPS代表3-[(3-胆胺基丙基)二甲基氨]丙磺酸，ACES代表N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸，MTT代表3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-溴化四唑。
表9
第一试剂部分
含有电子转移物质的试剂部分的材料溶液(溶剂是水)
Ru涂布量200mM0.2ul
第二试剂部分
含有酶的试剂部分的材料溶液(溶剂是水)
酶酶浓度 CHAP S蔗糖单月桂酸酯ACES(pH7.5)涂布量野生型15KU/ml 0.20％0.05％75mM 0.1ul 472D475 H 15KU/ml 0.20％0.05％75mM 0.1ul 472E475 Y 15KU/ml 0.20％0.05％75mM 0.1ul
第三试剂部分
含有显色剂的试剂部分的材料溶液(溶剂是水)
MTT丙烯酰胺甲醇涂布量60mM 0.40％50％0.2ul
将测定样品加入前述葡萄糖传感器的毛细管，然后每0.1秒重复测量吸光度，以制备吸光度的时程。对于每次吸光度测量，沿着毛细管高度的方向用光照射第三试剂部分(3)，在照射后立即接收穿透葡萄糖传感器的光。通过用发光二极管以630nm的光照射，获得光照射。穿透的光用光电二极管接收。
用加入葡萄糖的血液作为测定样品。将加入浓度为0，100，200和400mg/dl葡萄糖的血细胞比容调节为42％的血样用于评估葡萄糖传感器的线性。结果示于图11(野生型)、12(472Glu475Tyr)和13(472Asp475His)。
此外，在血细胞比容调节为42％并且葡萄糖浓度调节为45mg/dl的血样中进一步加入浓度为0，100，200和300mg/dl的麦芽糖，并且用于评估麦芽糖的影响。结果示于图14(野生型)、15(472Glu475Tyr)和16(472Asp475His)。
当在45mg/dl的葡萄糖样品中加入麦芽糖时，对于野生型，吸光度以麦芽糖浓度依赖性方式增加，这表明与麦芽糖的强反应。另一方面，对于采用突变的酶的传感器，抑制了吸光度的麦芽糖浓度依赖性增加，表明麦芽糖的影响较小。通过将这些数据转化为表观血糖升高值而获得的结果示于图17。在采用野生型酶的传感器中，由于麦芽糖的污染，低血糖水平(45mg/dl葡萄糖)表面上显示为正常值(122mg/dl葡萄糖)。另一方面，当使用采用了修饰的GDHs的传感器时，甚至当样品被最多达300mg/dl麦芽糖污染时，表观血糖水平没有升高到正常范围。
从上述结果可以明确看出，在采用突变的GDHs的葡萄糖传感器中，即使线性保持到与野生型相似的程度，对麦芽糖的反应性仍然显著降低。如果采用这些使用突变的GDHs的葡萄糖传感器，对于在医院等施用时上限(200mg/dl)的麦芽糖血液浓度或更高浓度时，不会将低血糖值(50mg/dl或更低)判断为正常值或高血糖水平，因此可以进行安全的治疗性处理。此外，由于上文所述，GDHs不与溶解氧反应，通过提供采用这些突变的GDHs的传感器，可以进行糖尿病患者的准确诊断和治疗。
实施例8：证实第472位的氨基酸取代和除475位外的位置的氨基酸取代的组合的作用
在具有472Phe型取代的突变的GDH中，在邻近第475位的位置(第477-第479位)和从远离第475位的位置中随机选择的位置(第53-73位)中进一步导入苯丙氨酸的取代。
采用表达在第472位含有苯丙氨酸的取代的突变的GDH的pTrc99Aγαβ，按照与实施例2相同的方式导入突变。用于导入该突变的正向引物的序列示于表10和11。反向引物的序列与正向引物链完全互补。
表10
    突变    SEQ ID NO：    突变    SEQ ID NO：    I477F    T478F    G479F    S480F    T481F    I482F    M483F    G484F    A485F    D486F    A487F    19    20    21    22    23    24    25    26    27    28    29    R488F    D489F    S490F    V491F    V492F    D493F    K494F    D495F    C496F    R497F    30    31    32    33    34    35    36    37    38    39
表11
    突变    SEQ ID NO：    突变    SEQ ID NO：    R53F    N54F    Q55F    P56F    D57F    K58F    M59F    D60F    M62F    A63F    40    41    42    43    44    45    46    47    48    49    P64F    Y65F    P66F    S67F    S68F    P69F    W70F    A71F    P72F    H73F    50    51    52    53    54    55    56    57    58    59
结果示于表12和13。从这些结果可以明确看出，采用472Phe的氨基酸取代和除475位之外的其它位置的取代的组合，观察到了活性丧失、没有发生改变，或仅仅增加对麦芽糖的反应性的作用，因此，证实在任意位置导入突变并不必然获得改进作用。
表12                       10mM    10mM
     突变的位点  用于取代  葡萄糖  麦芽糖  麦芽糖/葡萄糖
                 的氨基酸  U/ml    U/ml    反应比值
    472F    None    6.79    0.81  12％    472F+    475    F(Phe)    0.75    0.07  8.7％    472F+    477    F(Phe)    0.11    0.16  inactive    472F+    478    F(Phe)    0.12    0.12  inactive    472F+    479    F(Phe)    0.21    0.21  inactive    472F+    480    F(Phe)    0.26    0.30  inactive    472F+    481    F(Phe)    0.10    0.08  inactive    472F+    482    F(Phe)    0.06    0.08  inactive    472F+    483    F(Phe)    4.32    0.68  15.6％    472F+    484    F(Phe)    0.10    0.10  inactive    472F+    485    F(Phe)    0.18    0.24  inactive    472F+    486    F(Phe)    1.26    0.40  32.0％    472F+    487    F(Phe)    0.22    0.23  inactive    472F+    488    F(Phe)    2.85    0.65  22.9％    472F+    489    F(Phe)    1.81    0.56  31.2％    472F+    490    F(Phe)    0.18    0.19  inactive    472F+    491    F(Phe)    0.23    0.23  inactive    472F+    492    F(Phe)    0.19    0.24  inactive    472F+    493    F(Phe)    0.15    0.15  inactive    472F+    494    F(Phe)    1.15    0.29  25.0％    472F+    495    F(Phe)    0.29    0.23  inactive    472F+    496    F(Phe)    0.16    O.18  iractive    472F+    497    F(Phe)    0.14    0.16  inactive
表13                           10mM    10mM
         突变的位点  用于取代  葡萄糖  麦芽糖  麦芽糖/葡萄糖
                     的氨基酸  U/ml    U/ml    反应比值
  472F  None  6.79  0.81    11.9％  472F+    475  F(Phe)  0.75  0.07    8.7％  472F+    53  F(Phe)  3.44  0.48    13.8％  472F+    54  F(Phe)  3.00  0.54    18.2％  472F+    55  F(Phe)  3.81  0.72    18.8％  472F+    56  F(Phe)  4.89  0.57    11.7％  472F+    57  F(Phe)  2.41  0.41    17.2％  472F+    58  F(Phe)  3.33  0.45    13.5％  472F+    59  F(Phe)  4.07  0.58    14.2％  472F+    60  F(Phe)  1.55  0.37    23.7％  472F+    62  F(Phe)  1.31  0.26    19.9％  472F+    63  F(Phe)  2.91  0.44    15.0％  472F+    64  F(Phe)  0.54  0.28    51.4％  472F+    65  F(Phe)  5.52  0.76    13.8％  472F+    66  F(Phe)  1.63  0.35    21.8％  472F+    67  F(Phe)  3.91  0.48    12.3％  472F+    68  F(Phe)  4.32  0.86    19.8％  472F+    69  F(Phe)  4.79  0.82    17.1％  472F+    70  F(Phe)  5.34  0.64    12.0％  472F+    71  F(Phe)  1.26  0.28    22.5％  472F+    72  F(Phe)  3.65  0.50    13.8％  472F+    73  F(Phe)  1.20  0.26    21.3％
工业实用性
本发明的突变的GDH对葡萄糖具有改进的底物特异性，并且可以合适地用于采用葡萄糖传感器等测量葡萄糖。
<110>Arkray，Inc.
<120>突变的葡萄糖脱氢酶
<130>OPC5040
<150>JP2004-128165
<151>2004-04-23
<160>59
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>5
<212>PRT
<213>洋葱伯克霍尔德氏菌
<400>1
Glu His Lys Phe Asn
<210>2
<211>5
<212>PRT
<213>洋葱伯克霍尔德氏菌
<400>2
Asp Lys Met Asp Phe
  1               5
<210>3
<211>9
<212>PRT
<213>洋葱伯克霍尔德氏菌
<400>3
Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro Glu
  1               5
<210>4
<211>35
<212>PRT
<213>洋葱伯克霍尔德氏菌
<400>4
Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser Thr Ile Met Gly Ala
  1               5                  10                  15
Asp Ala Arg Asp Ser Val Val Asp Lys Asp Cys Arg Thr Phe Asp His
             20                  25                  30
Pro Asn Leu
         35
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>5
catgccatgg cacacaacga caacac        26
<210> 6
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>6
gtcgacgatc ttcttccagc cgaacatcac    30
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>7
cgcgccgaac gatcacatca cgggc         25
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>8
gcccgtgatg tgatcgttcg gcgcg             25
<210>9
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>9
gaattcgcgc cgaacgaaca catcacgggctcg      33
<210>10
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>10
cgagcccgtg atgtgttcgttcggcgcgaa ttc      33
<210>11
<211>2467
<212>DNA
<213>洋葱伯克霍尔德氏菌
<220>
<221>CDS
<222>(258)..(761)
<220>
<221>CDS
<222>(764)..(2380)
<220>
<221>CDS
<222>(2386)..(2466)
<400>11
aagctttctg tttgattgca cgcgattcta accgagcgtc tgtgaggcgg aacgcgacat 60
gcttcgtgtc gcacacgtgt cgcgccgacg acacaaaaat gcagcgaaat ggctgatcgt 120
tacgaatggc tgacacattg aatggactat aaaaccattg tccgttccgg aatgtgcgcg 180
tacatttcag gtccgcgccg atttttgaga aatatcaagc gtggttttcc cgaatccggt 240
gttcgagaga aggaaac atg cac aac gac aac act ccc cac tcg cgt cgc     290
                   Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg
                     1               5                  10
cac ggc gac gca gcc gca tca ggc atc acg cgg cgt caa tgg ttg caa    338
His Gly Asp Ala Ala Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gln Trp Leu Gln
             15                  20                  25
ggc gcg ctg gcg ctg acc gca gcg ggc ctc acg ggt tcg ctg aca ttg    385
Gly Ala Leu Ala Leu Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr Leu
         30                  35                  40
cgg gcg ctt gca gac aac ccc ggc act gcg ccg ctc gat acg ttc atg    434
Arg Ala Leu Ala Asp Asn Pro Gly Thr Ala Pro Leu Asp Thr Phe Met
     45                  50                  55
acg ctt tcc gaa tcg ctg acc ggc aag aaa ggg ctc agc cgc gtg atc    482
Thr Leu Ser Glu Ser Leu Thr Gly Lys Lys Gly Leu Ser Arg Val Ile
 60                  65                  70                  75
ggc gag cgc ctg ctg cag gcg ctg cag aag ggc tcg ttc aag acg gcc    530
Gly Glu Arg Leu Leu Gln Ala Leu Gln Lys Gly Ser Phe Lys Thr Ala
                 80                  85                  90
gac agc ctg ccg cag ctc gcc ggc gcg ctc gcg tcc ggt tcg ctg acg    578
Asp Ser Leu Pro Gln Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ser Leu Thr
             95                 100                 105
cct gaa cag gaa tcg ctc gca ctg acg atc ctc gag gcc tgg tat ctc    626
Pro Glu Gln Glu Ser Leu Ala Leu Thr Ile Leu Glu Ala Trp Tyr Leu
        110                 115                 120
ggc atc gtc gac aac gtc gtg att acg tac gag gaa gca tta atg ttc    674
Gly Ile Val Asp Asn Val Val Ile Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Met Phe
    125                 130                 135
ggc gtc gtg tcc gat acg ctc gtg atc cgt tcg tat tgc ccc aac aaa    722
Gly Val Val Ser Asp Thr Leu Val Ile Arg Ser Tyr Cys Pro Asn Lys
140                 145                 150                 155
ccc ggc ttc tgg gcc gac aaa ccg atc gag agg caa gcc tg atg gcc     769
Pro Gly Phe Trp Ala Asp Lys Pro Ile Glu Arg Gln Ala    Met Ala
                160                 165                    170
gat acc gat acg caa aag gcc gac gtc gtc gtc gtt gga tcg ggt gtc    817
Asp Thr Asp Thr Gln Lys Ala Asp Val Val Val Val Gly Ser Gly Val
                175                 180                 185
gcg ggc gcg atc gtc gcg cat cag ctc gcg atg gcg ggc aag gcg gtg    865
Ala Gly Ala Ile Val Ala His Gln Leu Ala Met Ala Gly Lys Ala Val
            190                 195                 200
atc ctg ctc gaa gcg ggc ccg cgc atg ccg cgc tgg gaa atc gtc gag    913
Ile Leu Leu Glu Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Trp Glu Ile Val Glu
        205                 210                 215
cgc ttc cgc aat cag ccc gac aag atg gac ttc atg gcg ccg tac ccg    961
Arg Phe Arg Asn Gln Pro Asp Lys Met Asp Phe Met Ala Pro Tyr Pro
    220                 225                 230
 tcg agc ccc tgg gcg ccg cat ccc gag tac ggc ccg ccg aac gac tac   1009
 Ser Ser Pro Trp Ala Pro His Pro Glu Tyr Gly Pro Pro Asn Asp Tyr
 235                 240                 245                 250
ctg atc ctg aag ggc gag cac aag ttc aac tcg cag tac atc cgc gcg    1057
Leu Ile Leu Lys Gly Glu His Lys Phe Asn Ser Gln Tyr Ile Arg Ala
                255                 260                 265
gtg ggc ggc acg acg tgg cac tgg gcc gcg tcg gcg tgg cgc ttc att    1105
Val Gly Gly Thr Thr Trp His Trp Ala Ala Ser Ala Trp Arg Phe Ile
            270                 275                 280
ccg aac gac ttc aag atg aag agc gtg tac ggc gtc ggc cgc gac tgg    1153
Pro Asn Asp Phe Lys Met Lys Ser Val Tyr Gly Val Gly Arg Asp Trp
        285                 290                 295
ccg atc cag tac gac gat ctc gag ccg tac tat cag cgc gcg gag gaa    1201
Pro Ile Gln Tyr Asp Asp Leu Glu Pro Tyr Tyr Gln Arg Ala Glu Glu
    300                 305                 310
gag ctc ggc gtg tgg ggc ccg ggc ccc gag gaa gat ctg tac tcg ccg    1249
Glu Leu Gly Val Trp Gly Pro Gly Pro Glu Glu Asp Leu Tyr Ser Pro
315                 320                 325                 330
cgc aag cag ccg tat ccg atg ccg ccg ctg ccg ttg tcg ttc aac gag    1297
Arg Lys Gln Pro Tyr Pro Met Pro Pro Leu Pro Leu Ser Phe Asn Glu
                335                 340                 345
cag acc atc aag acg gcg ctg aac aac tac gat ccg aag ttc cat gtc    1345
Gln Thr Ile Lys Thr Ala Leu Asn Asn Tyr Asp Pro Lys Phe His Val
            350                 355                 360
gtg acc gag ccg gtc gcg cgc aac agc cgc ccg tac gac ggc cgc ccg    393
Val Thr Glu Pro Val Ala Arg Asn Ser Arg Pro Tyr Asp Gly Arg Pro
        365                 370                 375
act tgt tgc ggc aac aac aac tgc atg ccg atc tgc ccg atc ggc gcg    1441
Thr Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys Pro Ile Gly Ala
    380                 385                 390
atg tac aac ggc atc gtg cac gtc gag aag gcc gaa cgc gcc ggc gcg    1489
Met Tyr Asn Gly Ile Val His Val Glu Lys Ala Glu Arg Ala Gly Ala
395                 400                 405                 410
aag ctg atc gag aac gcg gtc gtc tac aag ctc gag acg ggc ccg gac    1537
Lys Leu Ile Glu Asn Ala Val Val Tyr Lys Leu Glu Thr Gly Pro Asp
                415                 420                 425
aag cgc atc gtc gcg gcg ctc tac aag gac aag acg ggc gcc gag cat    1585
Lys Arg Ile Val Ala Ala Leu Tyr Lys Asp Lys Thr Gly Ala Glu His
            430                 435                 440
cgc gtc gaa ggc aag tat ttc gtg ctc gcc gcg aac ggc atc gag acg    1633
Arg Val Glu Gly Lys Tyr Phe Val Leu Ala Ala Asn Gly Ile Glu Thr
        445                 450                 455
ccg aag atc ctg ctg atg tcc gcg aac cgc gat ttc ccg aac ggt gtc    1681
Pro Lys Ile Leu Leu Met Ser Ala Asn Arg Asp Phe Pro Asn Gly Val
    460                 465                 470
gcg aac agc tcg gac atg gtc ggc cgc aac ctg atg gac cat ccg ggc    1729
Ala Asn Ser Ser Asp Met Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His Pro Gly
475                 480                 485                 490
acc ggc gtg tcg ttc tat gcg agc gag aag ctg tgg ccg ggc cgc ggc    1777
Thr Gly Val Ser Phe Tyr Ala Ser Glu Lys Leu Trp Pro Gly Arg Gly
                495                 500                 505
ccg cag gag atg acg tcg ctg atc ggt ttc cgc gac ggt ccg ttc cgc     1825
Pro Gln Glu Met Thr Ser Leu Ile Gly Phe Arg Asp Gly Pro Phe Arg
            510                 515                 520
gcg acc gaa gcg gcg aag aag atc cac ctg tcg aac ctg tcg cgc atc     1873
Ala Thr Glu Ala Ala Lys Lys Ile His Leu Ser Asn Leu Ser Arg Ile
        525                 530                 535
gac cag gag acg cag aag atc ttc aag gcc ggc aag ctg atg aag ccc     1921
Asp Gln Glu Thr Gln Lys Ile Phe Lys Ala Gly Lys Leu Met Lys Pro
    540                 545                 550
gac gag ctc gac gcg cag atc cgc gac cgt tcc gca cgc tac gtg cag     1969
Asp Glu Leu Asp Ala Gln Ile Arg Asp Arg Ser Ala Arg Tyr Val Glu
555                 560                 565                 570
ttc gac tgc ttc cac gaa atc ctg ccg caa ccc gag aac cgc atc gtg     2017
Phe Asp Cys Phe His Glu Ile Leu Pro Gln Pro Glu Asn Arg Ile Val
                575                 580                 585
ccg agc aag acg gcg acc gat gcg atc ggc att ccg cgc ccc gag ate     2065
Pro Ser Lys Thr Ala Thr Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro Glu Ile
            590                 595                 600
acg tat gcg atc gac gac tac gtg aag cgc ggc gcc gcg cat acg cgc     2113
Thr Tyr Ala Ile Asp Asp Tyr Val Lys Arg Gly Ala Ala His Thr Arg
        605                 610                 615
gag gtc tac gcg acc gcc gcg aag gtg ctc ggc ggc acg gac gtc gtg     2161
Glu Val Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Val Leu Gly Gly Thr Asp Val Val
    620                 625                 630
ttc aac gac gaa ttc gcg ccg aac aat cac atc acg ggc tcg acg atc     2209
Phe Asn Asp Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser Thr Ile
635                 640                 645                 650
atg ggc gcc gat gcg cgc gac tcc gtc gtc gac aag gac tgc cgc acg     2257
Met Gly Ala Asp Ala Arg Asp Ser Val Val Asp Lys Asp Cys Arg Thr
                655                 660                 665
ttc gac cat ccg aac ctg ttc att tcg agc agc gcg acg atg ccg acc     2305
Phe Asp His Pro Asn Leu Phe Ile Ser Ser Ser Ala Thr Met Pro Thr
            670                 675                 680
gtc ggt acc gta aac gtg acg ctg acg atc gcc gcg ctc gcg ctg cgg     2353
Val Gly Thr Val Asn Val Thr Leu Thr Ile Ala Ala Leu Ala Leu Arg
        685                 690                 695
atg tcg gac acg ctg aag aag gaa gtc tgacc gtg cgg aaa tct act ctc   2403
Met Ser Asp Thr Leu Lys Lys Glu Val       Val Arg Lys Ser Thr Leu
    700                 705                       710
act ttc ctc atc gcc ggc tgc ctc gcg ttg ccg ggc ttc gcg cgc gcg     2451
Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu Pro Gly Phe Ala Arg Ala
    715                 720                 725
gcc gat gcg gcc gat c                                               2467
Ala Asp Ala Ala Asp
730
<210>12
<211>168
<212>PRT
<213>洋葱伯克霍尔德氏菌
<400>12
Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg His Gly Asp Ala Ala
  1               5                  10                  15
Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gln Trp Leu Gln Gly Ala Leu Ala Leu
             20                  25                  30
Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr Leu Arg Ala Leu Ala Asp
         35                  40                  45
Asn Pro Gly Thr Ala Pro Leu Asp Thr Phe Met Thr Leu Ser Glu Ser
     50                  55                  60
Leu Thr Gly Lys Lys Gly Leu Ser Arg Val Ile Gly Glu Arg Leu Leu
 65                  70                  75                  80
Gln Ala Leu Gln Lys Gly Ser Phe Lys Thr Ala Asp Ser Leu Pro Glu
                 85                  90                  95
Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ser Leu Thr Pro Glu Gln Glu Ser
            100                 105                 110
Leu Ala Leu Thr Ile Leu Glu Ala Trp Tyr Leu Gly Ile Val Asp Asn
        115                 120                 125
Val Val Ile Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Met Phe Gly Val Val Ser Asp
    130                 135                 140
Thr Leu Val Ile Arg Ser Tyr Cys Pro Ash Lys Pro Gly Phe Trp Ala
145                 150                 155                 160
Asp Lys Pro Ile Glu Arg Gln Ala
                165
<210>13
<211>539
<212>PRT
<213>洋葱伯克霍尔德氏菌
<400>13
Met Ala Asp Thr Asp Thr Gln Lys Ala Asp Val Val Val Val Gly Ser
  1               5                  10                  15
Gly Val Ala Gly Ala Ile Val Ala His Gln Leu Ala Met Ala Gly Lys
             20                  25                  30
Ala Va1 Ile Leu Leu Glu Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Trp Glu Ile
         35                  40                  45
Val Glu Arg Phe Arg Asn Gln Pro Asp Lys Met Asp Phe Met Ala Pro
     50                  55                  60
Tyr Pro Ser Ser Pro Trp Ala Pro His Pro Glu Tyr Gly Pro Pro Asn
 65                  70                  75                  80
Asp Tyr Leu Ile Leu Lys Gly Glu His Lys Phe Asn Ser Gln Tyr Ile
                 85                  90                  95
Arg Ala Val Gly Gly Thr Thr Trp His Trp Ala Ala Ser Ala Trp Arg
            100                 105                 110
Phe Ile Pro Asn Asp Phe Lys Met Lys Ser Val Tyr Gly Val Gly Arg
        115                 120                 125
Asp Trp Pro Ile Gln Tyr Asp Asp Leu Glu Pro Tyr Tyr Gln Arg Ala
    130                 135                 140
Glu Glu Glu Leu Gly Val Trp Gly Pro Gly Pro Glu Glu Asp Leu Tyr
145                 150                 155                 160
Ser Pro Arg Lys Gln Pro Tyr Pro Met Pro Pro Leu Pro Leu Ser Phe
                165                 170                 175
Asn Glu Gln Thr Ile Lys Thr Ala Leu Asn Asn Tyr Asp Pro Lys Phe
            180                 185                 190
His Val Val Thr Glu Pro Val Ala Arg Asn Ser Arg Pro Tyr Asp Gly
        195                 200                 205
Arg Pro Thr Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys Pro Ile
    210                 215                 220
Gly Ala Met Tyr Asn Gly Ile Val His Val Glu Lys Ala Glu Arg Ala
225                 230                 235                 240
Gly Ala Lys Leu Ile Glu Asn Ala Val Val Tyr Lys Leu Glu Thr Gly
                245                 250                 255
Pro Asp Lys Arg Ile Val Ala Ala Leu Tyr Lys Asp Lys Thr Gly Ala
            260                 265                 270
Glu His Arg Val Glu Gly Lys Tyr Phe Val Leu Ala Ala Asn Gly Ila
        275                 280                 285
Glu Thr Pro Lys Ile Leu Leu Met Ser Ala Asn Arg Asp Phe Pro Asn
    290                 295                 300
Gly Val Ala Asn Ser Ser Asp Mer Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His
305                 310                 315                 320
Pro Gly Thr Gly Val Ser Phe Tyr Ala Ser Glu Lys Leu Trp Pro Gly
                325                 330                 335
Arg Gly Pro Gln Glu Met Thr Ser Leu Ile Gly Phe Arg Asp Gly Pro
            340                 345                 350
Phe Arg Ala Thr Glu Ala Ala Lys Lys Ile His Leu Ser Asn Leu Ser
        355                 360                 365
Arg Ile Asp Gln Glu Thr Gln Lys Ile Phe Lys Ala Gly Lys Leu Met
    370                 375                 380
Lys Pro Asp Glu Leu Asp Ala Gln Ile Arg Asp Arg Ser Ala Arg Tyr
385                 390                 395                 400
Val Gln Phe Asp Cys Phe His Glu Ile Leu Pro Gln Pro Glu Asn Arg
                405                 410                 415
 Ile Val Pro Ser Lys Thr Ala Thr Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro
             420                 425                 430
Glu Ile Thr Tyr Ala Ile Asp Asp Tyr Val Lys Arg Gly Ala Ala His
        435                 440                 445
Thr Arg Glu Val Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Val Leu Gly Gly Thr Asp
    450                 455                  460
Val Val Phe Asn Asp Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser
465                 470                 475                 480
Thr Ile Mer Gly Ala Asp Ala Arg Asp Ser Val Val Asp Lys Asp Cys
                485                 490                 495
Arg Thr Phe Asp His Pro Asn Leu Phe Ile Ser Ser Ser Ala Thr Met
            500                 505                 510
Pro Thr Val Gly Thr Val Asn Val Thr Leu Thr Ile Ala Ala Leu Ala
        515                 520                 525
Leu Arg Met Ser Asp Thr Leu Lys Lys Glu Val
    530                 535
<210>14
<211>27
<212>PRT
<213>洋葱伯克霍尔德氏菌
<400>14
Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu
  1               5                  10                  15
Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp
             20                  25
<210>15
<211>1441
<212> DNA
<213>洋葱伯克霍尔德氏菌
<220>
<221>CDS
<222>(121)..(1398)
<400>15
tccgaacctg ttcatttcga gcagcgcgac gatgccgacc gtcggtaccg taaacgtgac 60
gctgacgatc gccgcgctcg cgctgcggat gtcggacacg ctgaagaagg aagtctgacc 120
gtg cgg aaa tct act ctc act ttc ctc atc gcc ggc tgc ctc gcg ttg   168
Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu
  1               5                  10                  15
ccg ggc ttc gcg cgc gcg gcc gat gcg gcc gat ccg gcg ctg gtc aag   216
Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys
             20                  25                  30
cgc ggc gaa tac ctc gcg acc gcc atg ccg gta ccg atg ctc ggc aag   264
Arg Gly Glu Tyr Leu Ala Thr Ala Met Pro Val Pro Met Leu Gly Lys
         35                  40                  45
atc tac acg agc aac atc acg ccc gat ccc gat acg ggc gac tgc atg   312
Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp Pro Asp Thr Gly Asp Cys Met
     50                  55                  60
gcc tgc cac acc gtg aag ggc ggc aag ccg tac gcg ggc ggc ctt ggc   360
Ala Cys His Thr Val Lys Gly Gly Lys Pro Tyr Ala Gly Gly Leu Gly
 65                  70                  75                 80
ggc atc ggc aaa tgg acg ttc gag gac ttc gag cgc gcg gtg cgg cac   408
Gly Ile Gly Lys Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala Val Arg His
                 85                  90                  95
ggc gtg tcg aag aac ggc gac aac ctg tat ccg gcg atg ccg tac gtg   456
Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Val
            100                 105                 110
tcg tac gcg aag atc aag gac gac gac gta cgc gcg ctg tac gcc tac   504
Ser Tyr Ala Lys Ile Lys Asp Asp Asp Val Arg Ala Leu Tyr Ala Tyr
        115                 120                 125
ttc atg cac ggc gtc gag ccg gtc aag cag gcg ccg ccg aag aac gag   552
Phe Met His Gly Val Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu
    130                 135                 140
atc cca gcg ctg cta agc atg cgc tgg ccg ctg aag atc tgg aac tgg   600
Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp
145                 150                 155                 160
ctg ttc ctg aag gac ggc ccg tac cag ccg aag ccg tcg cag agc gcc   648
Leu Phe Leu Lys Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Lys Pro Ser Gln Ser Ala
                165                 170                 175
gaa tgg aat cgc ggc gcg tat ctg gtg cag ggt ctc gcg cac tgc agc   696
Glu Trp Asn Arg Gly Ala Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala His Cys Ser
            180                 185                 190
acg tgc cac acg ccg cgc ggc atc gcg atg cag gag aag tcg ctc gac   744
Thr Cys His Thr Pro Arg Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys Ser Leu Asp
        195                 200                 205
gaa acc ggc ggc agc ttc ctc gcg ggg tcg gtg ctc gcc ggc tgg gac   792
Glu Thr Gly Gly Ser Phe Leu Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Trp Asp
    210                 215                 220
ggc tac aac atc acg tcg gac ccg aat gcg ggg atc ggc agc tgg acg   840
Gly Tyr Asn Ile Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly Ser Trp Thr
225                 230                 235                 240
cag cag cag crc gtg cag tat ttg cgc acc ggc agc gtg ccg ggc gtc   888
Gln Gln Gln Leu Val Gln Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val Pro Gly Val
                245                 250                 255
gcg cag gcg gcc ggg ccg atg gcc gag gcg gtc gag cac agc ttc tcg   936
Ala Gln Ala Ala Gly Pro Met Ala Glu Ala Val Glu His Ser Phe Ser
            260                 265                 270
aag atg acc gaa gcg gac atc ggt gcg atc gcc acg tac gtc cgc acg   984
Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Ala Ile Ala Thr Tyr Val Arg Thr
        275                 280                 285
gtg ccg gcc gtt gcc gac agc aac gcg aag cag ccg cgg tcg tcg tgg   1032
Val Pro Ala Val Ala Asp Ser Asn Ala Lys Gln Pro Arg Ser Ser Trp
    290                 295                 300
ggc aag ccg gcc gag gac ggg ctg aag ctg cgc ggt gtc gcg ctc gcg   1080
Gly Lys Pro Ala Glu Asp Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val Ala Leu Ala
305                 310                 315                 320
tcg tcg ggc atc gat ccg gcg cgg ctg tat ctc ggc aac tgc gcg acg   1128
Set Ser Gly Ile Asp Pro Ala Arg Leu Tyr Leu Gly Asn Cys Ala Thr
                325                 330                 335
tgc cac cag atg cag ggc aag ggc acg ccg gac ggc tat tac ccg tcg   1176
Cys His Gln Met Gln Gly Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr Tyr Pro Ser
            340                 345                 350
ctg ttc cac aac tcc acc gtc ggc gcg tcg aat ccg tcg aac ctc gtg   1224
Leu Phe His Asn Ser Thr Val Gly Ala Ser Asn Pro Ser Asn Leu Val
        355                 360                 365
cag gtg atc ctg aac ggc gtg cag cgc aag atc ggc agc gag gat atc   1272
Gln Val Ile Leu Asn Gly Val Gln Arg Lys Ile Gly Ser Glu Asp Ile
    370                 375                 380
ggg atg ccc gct ttc cgc tac gat ctg aac gac gcg cag atc gcc gcg   1320
Gly Met Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu Asn Asp Ala Gln Ile Ala Ala
385                 390                 395                 400
ctg acg aac tac gtg acc gcg cag ttc ggc aat ccg gcg gcg aag gtg   1368
Leu Thr Asn Tyr Val Thr Ala Gln Phe Gly Asn Pro Ala Ala Lys Val
                405                 410                 415
acg gag cag gac gtc gcg aag ctg cgc tga catagtcggg cgcgccgaca     1418
Thr Glu Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg
            420                 425
cggcgcaacc gataggacag gag                                         1441
<210>16
<211>425
<212>PRT
<213>洋葱伯克霍尔德氏菌
<400>16
Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu
  1               5                  10                  15
Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys
             20                  25                  30
Arg Gly Glu Tyr Leu Ala Thr Ala Met Pro Val Pro Met Leu Gly Lys
         35                  40                  45
Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp Pro Asp Thr Gly Asp Cys Met
     50                  55                  60
Ala Cys His Thr Val Lys Gly Gly Lys Pro Tyr Ala Gly Gly Leu Gly
 65                  70                  75                  80
Gly Ile Gly Lys Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala Val Arg His
                 85                  90                  95
Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Val
            100                 105                 110
Ser Tyr Ala Lys Ile Lys Asp Asp Asp Val Arg Ala Leu Tyr Ala Tyr
        115                 120                 125
Phe Met His Gly Val Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu
    130                 135                 140
Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp
145                 150                 155                 160
Leu Phe Leu Lys Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Lys Pro Ser Gln Ser Ala
                165                 170                 175
Glu Trp Asn Arg Gly Ala Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala His Cys Ser
            180                 185                 190
Thr Cys His Thr Pro Arg Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys Ser Leu Asp
        195                 200                 205
Glu Thr Gly Gly Ser Phe Leu Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Trp Asp
    210                 215                 220
Gly Tyr Asn Ile Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly Ser Trp Thr
225                 230                 235                 240
Gln Gln Gln Leu Val Gln Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val Pro Gly Val
                245                 250                 255
Ala Gln Ala Ala Gly Pro Met Ala Glu Ala Val Glu His Ser Phe Ser
            260                 265                 270
Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Ala Ile Ala Thr Tyr Val Arg Thr
        275                 280                 285
Val Pro Ala Val Ala Asp Ser Asn Ala Lys Gln Pro Arg Ser Ser Trp
    290                 295                 300
Gly Lys Pro Ala Glu Asp Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val Ala Leu Ala
305                 310                 315                 320
Ser Ser Gly Ile Asp Pro Ala Arg Leu Tyr Leu Gly Asn Cys Ala Thr
                325                 330                 335
Cys His Gln Met Gln Gly Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr Tyr Pro Ser
            340                 345                 350
Leu Phe His Asn Ser Thr Val Gly Ala Ser Asn Pro Ser Asn Leu Val
        355                 360                 365
Gln Val Ile Leu Asn Gly Val Gln Arg Lys Ile Gly Ser Glu Asp Ile
    370                 375                 380
Gly Met Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu Asn Asp Ala Gln Ile Ala Ala
385                 390                 395                 400
Leu Thr Asn Tyr Val Thr Ala Gln Phe Gly Asn Pro Ala Ala Lys Val
                405                 410                 415
Thr Glu Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg
            420                 425
<210>17
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>17
cctgttcaac gacgaattcg cgccgaacaa ccacatcac                   39
<210>18
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>18
gtgatgtggt tgttcggcgc gaattcgtcg ttgaacacg    39
<210>19
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>19
cgatccgaac catcacttta cgggctcgac gatca    35
<210>20
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>20
cgatccgaac catcacatct ttggctcgac gatcatggg    39
<210>21
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>21
tccgaaccat cacatcacgt tttcgacgat catgggcgc    39
<210>22
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>22
catcacatca cgggctttac gatcatgggc gcc    33
<210>23
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>23
atcacatcac gggctcgttt atcatgggcg ccgatgc    37
<210>24
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>24
cacgggctcg acgtttatgg gcgccgatg             29
<210>25
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>25
 cgggctcgac gatctttggc gccgatgcg            29
<210>26
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>26
gggctcgacg atcatgtttg ccgatgcgcg cga        33
<210>27
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>27
gctcgacgat catgggcttt gatgcgcgcg actcc    35
<210>28
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>28
cgatcatggg cgcctttgcg cgcgactcc           29
<210>29
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>29
cgatcatggg cgccgatttt cgcgactccg tcgtc    35
<210>30
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>30
tgggcgccga tgcgtttgac tccgtcgtcg aca      33
<210>31
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>31
gcgccgatgc gcgctt ttcc gtcgtcgaca agg    33
<210>32
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>32
cgatgcgcgc gactttgtcg tcgacaagga c       33
<210>33
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>33
tgcgcgcgac tcctttgtcg acaaggactg c       33
<210>34
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>34
cgcgcgactc cgtctttgac aaggactgcc g       31
<210>35
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>35
cgcgactccg tcgtctttaa ggactgccgc acg     33
<210>36
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>36
cgactccgtc gtcgactttg actgccgcac gttcg        35
<210>37
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>37
ctccgtcgtc gacaagtttt gccgcacgtt cgacc        35
<210>38
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>38
cgtcgtcgac aaggactttc gcacgttcga ccatc        35
<210>39
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>39
gtcgtcgaca aggactgctt tacgttcgac catccgaac    39
<210>40
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>40
ggaaatcgtc gagcgcttct ttaatcagcc cgacaagatg g    41
<210>41
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>41
cgagcgcttccgctttcagc ccgacaagat g               31
<210>42
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>42
gtcgagcgct tccgcaattt tcccgacaag atggacttc      39
<210>43
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>43
gagcgcttcc gcaatcagtt tgacaagatg gacttcatgg c   41
<210>44
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>44
gcttccgcaa tcagccctt t aagatggact tcatggcgc     39
<210>45
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>45
ccgcaatcag cccgacttta tggacttcat ggcgccg    37
<210>46
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>46
gcaatcagcc cgacaagttt gacttcatgg cgccg      35
<210>47
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>47
caatcagccc gacaagatgt ttttcatggc gccgtaccc  39
<210>48
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>48
cgacaagatg gacttctttg cgccgtaccc gtc        33
<210>49
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>49
cgacaagatg gacttcatgt ttccgtaccc gtcgagccc    39
<210>50
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>50
caagatggac ttcatggcgt tttacccgtc gagcccctg    39
<210>51
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>51
acttcatggc gccgtttccg tcgagcccc               29
<210>52
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>52
cttcatggcg ccgtactttt cgagcccctg ggc         33
<210>53
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>53
gcgccgtacccgtttagccc ctgggcg          27
<210>54
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>54
cgccgtaccc gtcgtttccc tgggcgccg       29
<210>55
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>55
ccgtacccgtcgagcttttg ggcgccgcat ccc  33
<210>56
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>56
ccgtcgagcc cctttgcgcc gcatccc        27
<210>57
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>57
cgtcgagccc ctggtttccg catcccgagt acg 33
<210>58
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>58
cgagcccctg ggcgtttcat cccgagtacg gcc    33
<210>59
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>59
ccctgggcgc cgtttcccga gtacggc           27