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1、(10)申请公布号 CN 104286415 A (43)申请公布日 2015.01.21 CN 104286415 A (21)申请号 201410519741.0 (22)申请日 2014.09.30 A23K 1/16(2006.01) (71)申请人 广东省微生物研究所 地址 510070 广东省广州市先烈中路 100 号 申请人 广东碧德生物科技有限公司 (72)发明人 许国焕 张丽 陈亚剑 程炜轩 郭莹姿 魏逸峰 梁建庆 谭文俊 (74)专利代理机构 广州科粤专利商标代理有限 公司 44001 代理人 刘明星 (54) 发明名称 一种高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂及其 制备方法 (。
2、57) 摘要 本发明公开了一种高产谷胱甘肽酿酒酵母微 生物制剂及其制备方法。本发明通过液体高密度 发酵， 固体发酵， 低温烘干等易于工业化生产的生 产工艺， 生产高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂 产品。按照本发明的方法制备得到的酿酒酵母微 生物制剂， 其每克含活菌数 20 40 亿个， 杂菌率 低， 尤其是该酿酒酵母微生物制剂中的酿酒酵母 的谷胱甘肽产量高， 可达 400mg/kg 以上， 转化率 高、 生产速率快的。本发明方法的菌种易于培养， 原料来源方便廉价， 反应条件温和、 反应步骤简 单， 成本低廉。 制备得到的酿酒酵母制剂用作微生 物饲料添加剂， 能够促进动物的生长。 (51)Int.。
3、Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104286415 A CN 104286415 A 1/1 页 2 1. 一种高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： a、 菌种活化 ： 将酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)GIM2.139 活化后转接到 YEPD 液体培养基中， 281培养至菌浓度为 1.0107cfu/mL 2.0108cfu/mL， 形成种子培养 液 ； b、 将种子培养液以质。
4、量百分比 3 5的接种量转接到含有一级发酵培养基的发酵 罐中， 发酵温度 281， 搅拌速率 200 350rpm， 通气量 0.8 0.9V/Vmin， 溶氧浓度 80 90， 发酵至酿酒酵母生长到对数生长期， 将此对数生长期的菌液作为一级种子液 ； c、 将一级种子液以质量百分比 2 10的接种量转接到含有二级发酵培养基的发酵 罐中进行二级发酵， 发酵温度281， 搅拌速率150250rpm， 通气量0.80.9V/V min， 溶氧浓度 70 80， 发酵至酿酒酵母生长到对数生长期， 将此对数生长期的菌液作为二级 种子液 ； d、 在无菌环境中， 将二级种子液以质量百分比 2 10的接种。
5、量接入麸皮固体培养基 中， 混合均匀， 控制通风量为 ： 3 10 换气次数 / 小时， 温度 25 32， 湿度 80 90条 件下培养6072小时， 培养期间翻动麸皮固体培养基， 30-45干燥处理后， 得到高产谷胱 甘肽酿酒酵母微生物制剂 ； 所述的一级和二级发酵培养基都为 ： 每升含有葡萄糖 5 30g、 蔗糖 2 20g、 糖蜜 2 30g、 NaCl 3 10g、 蛋白胨 5 20g、 磷酸氢二钾 1-15g， 余量为水， pH6.00.2 ； 所述的麸皮固体培养基为 ： 按总质量分数 100计， 由麸皮 38 50、 豆粕 10 23、 尿素 0.1 0.5、 氯化铵 0.1 0。
6、.5和水 38 51组成。 2. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于， 所述的将酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)GIM2.139 活化为将酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)GIM2.139 划线接 种到麦芽汁琼脂培养基试管斜面， 28培养 24 小时。 3.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述的步骤d的培养期间翻动麸皮固 体培养基为每隔 3 5 小时翻动一次。 4.一种按照权利要求1、 2或3所述的制备方法制备得到的高产谷胱甘肽酿酒酵母微生 物制剂。 权 利 要 求 书 CN 104286415 A 2 1/6。
7、 页 3 一种高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂及其制备方法 技术领域 ： 0001 本发明属于饲料领域， 具体涉及一种高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂及其制备 方法。 背景技术 ： 0002 酿酒酵母是我国农业部允许作为饲料添加剂的菌种之一， 其已被越来越多地研制 成饲用微生态制剂。酿酒酵母其代谢产物富含氨基酸、 维生素 B、 蛋白质和多种酶等多种生 理活性成分， 尤其是含有丰富的谷胱甘肽 (glutathione,GSH)， 它是一种含 - 酰胺键和巯 基的三肽， 由谷氨酸、 半胱氨酸及甘氨酸组成。 酵母菌及其代谢产物能够提高动物抗氧化能 力， 增强动物免疫功能， 提高动物抗病能力等， 这些特性。
8、对保护动物肠粘膜、 调节免疫系统、 促进氨基酸、 葡萄糖等营养物质消化吸收， 增强动物抗氧化能力， 提高动物的饲料转化率和 防病促进生长起到重要作用。 0003 因此在饲料中添加高产谷胱甘肽的酵母菌是一个十分绿色健康的选择。 0004 目前国内外生产谷胱甘肽的方法主要有萃取法、 化学合成法、 发酵法、 酶法， 液体 发酵法是当前生产谷胱甘肽的主要方法， 普遍使用的菌种是酵母菌， 应用微生物液体发酵 的方法生产谷胱甘肽比较易于工业化， 但其制备的酿酒酵母微生物制剂中， 损失了酵母菌 产生的所有代谢产物， 仅保留酵母菌菌体， 并且产量低， 价格较高， 同时添加到饲料中会提 高饲料成本， 制约其大规。
9、模使用。 发明内容 ： 0005 本发明旨在提供一种高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂及其制备方法， 利用该方 法制备的酿酒酵母微生物制剂， 其谷胱甘肽含量高、 转化率高、 生产速率快， 并且该方法反 应条件温和， 反应步骤简单， 成本低廉。 0006 本发明的高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂的制备方法， 其特征在于， 包括以下 步骤 ： 0007 a、 菌种活化 ： 将酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)GIM2.139 活化后转接到 YEPD液体培养基中， 281培养至菌浓度为1.0107cfu/mL2.0108cfu/mL， 形成种子 培养液 ； 0008 b、 将种。
10、子培养液以质量百分比 3 5的接种量转接到含有一级发酵培养基的 发酵罐中， 发酵温度281， 搅拌速率200350rpm， 通气量0.80.9V/V min， 溶氧浓度 80 90， 发酵至酿酒酵母生长到对数生长期， 将此对数生长期的菌液作为一级种子液 ； 0009 c、 将一级种子液以质量百分比 2 10的接种量转接到含有二级发酵培养基的 发酵罐中进行二级发酵， 发酵温度 281， 搅拌速率 150 250rpm， 通气量 0.8 0.9V/ V min， 溶氧浓度7080， 发酵至酿酒酵母生长到对数生长期， 将此对数生长期的菌液作 为二级种子液 ； 0010 d、 在无菌环境中， 将二级种。
11、子液以质量百分比 2 10的接种量接入麸皮固体培 说 明 书 CN 104286415 A 3 2/6 页 4 养基中， 混合均匀， 控制通风量为 ： 3 10 换气次数 / 小时， 温度 25 32， 湿度 80 90条件下培养 60 72 小时， 培养期间翻动麸皮固体培养基， 经半成品检验， 每克湿菌体 含活菌数 20 亿 40 亿个活菌， 30-45干燥处理后， 得到高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制 剂 ； 0011 所述的一级和二级发酵培养基都为 ： 每升含有葡萄糖530g、 蔗糖220g、 糖蜜 2 30g、 NaCl3 10g、 蛋白胨 5 20g、 磷酸氢二钾 1-15g， 余量为水。
12、， pH6.00.2 ； 0012 所述的麸皮固体培养基为 ： 按总质量分数 100计， 由麸皮 38 50、 豆粕 10 23、 尿素 0.1 0.5、 氯化铵 0.1 0.5和水 38 51组成。 0013 该高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂经包装， 成品检测， 储存， 可作为商品出售。 0014 所述的将酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)GIM2.139 活化优选为将酿酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae)GIM2.139划线接种到麦芽汁琼脂培养基试管斜面， 28培 养 24 小时。 0015 所述的步骤 d 的培养期间翻动麸皮固体培养基优。
13、选每隔 3 5 小时翻动一次。 0016 所述的麦芽汁琼脂培养基属于现有技术中的常规培养基， 其配方为 ： 每升含有麦 芽膏粉 130g， 琼脂 20g， 氯霉素 0.1g， 余量为水， pH6.0 6.2。 0017 所述的 YEPD 液体培养基属于现有技术中的常规培养基， 其配方为 ： 每升含有酵母 粉 10g， 蛋白胨 20g， 葡萄糖 20g， 蒸馏水 1000mL， pH 自然， 115湿热灭菌 20min。 0018 本发明相比于现有技术， 具有优点 ： 0019 按照本发明的方法制备得到的酿酒酵母微生物制剂， 其每克含活菌数 20 40 亿 个， 杂菌率低， 尤其是该酿酒酵母微生。
14、物制剂中的酿酒酵母的谷胱甘肽产量高， 可达 400mg/ kg以上， 转化率高、 生产速率快的。 本发明方法的菌种易于培养， 原料来源方便廉价， 反应条 件温和、 反应步骤简单， 成本低廉。制备得到的酿酒酵母制剂用作微生物饲料添加剂， 能够 促进动物的生长。 附图说明 ： 0020 图 1 是实施例 1 中一级发酵中的酿酒酵母生长曲线图 ； 0021 图 2 是实施例 1 中二级发酵中的酿酒酵母生长曲线图。 具体实施方式 ： 0022 以下实施例是对本发明的进一步说明， 而不是对本发明的限制。 0023 实施例 1 ： 0024 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GI。
15、M2.139(保藏于广东省微生物菌种保藏 中心， 保藏号 GIM2.139， 该菌种对外销售， 可以购买到 ) 的冻干种上挑取一环菌体接种至麦 芽汁琼脂培养基试管斜面培养基中， 28培养24小时 ； 再将试管斜面种子转接到YEPD液体 培养基中， 28培养24h， 形成种子培养液， 其菌浓度为1.0108cfu/mL。 所述的麦芽汁琼脂 培养基的配方为 ： 每升含有麦芽膏粉 130g， 琼脂 20g， 氯霉素 0.1g， 余量为水， pH6.0 6.2， 115高压灭菌 20min。YEPD 液体培养基配方为 ： 每升含有酵母粉 10g， 蛋白胨 20g， 葡萄糖 20g， 蒸馏水 1000m。
16、L， pH 自然， 115湿热灭菌 20min。 0025 将种子培养液以质量百分比 5的接种量转入装有一级发酵培养基的 30L 种子罐 说 明 书 CN 104286415 A 4 3/6 页 5 中进行发酵培养， 装液量 70， 发酵温度 281， 搅拌速率 200rpm， 通气量 0.8 0.9V/ Vmin， 溶氧浓度 85 90， 自接种后每 2h 取样一次测 560nm 的吸光值， 用未接种的培养 基作为空白对照， 制作酿酒酵母生长曲线图(图1)， 由曲线可知酿酒酵母在812h菌数急 剧增加， 表明菌体已经到达对数生长期， 取用发酵时间为 8 小时的菌液制成一级种子液 ； 将 一级。
17、种子液以 10的接种量， 转接入装有二级发酵培养基的 300L 发酵罐中进一步扩大培 养， 装液量70， 发酵温度281， 搅拌速率250rpm， 通气量0.80.9V/V min， 溶氧浓度 70 80， 自接种后每 2h 取样一次测 560nm 的吸光值， 用未接种的培养基作为空白对照， 制作酿酒酵母生长曲线图 ( 图 2)， 由曲线可知酿酒酵母在 12 25h 菌数急剧增加， 表明菌 体已经达到对数生长期， 因此取用该时期的菌液得到二级种子液， 本实施例中选取的是发 酵时间为 16 小时的菌液作为二级种子液。所述的一级和二级发酵培养基均为， 每升含有葡 萄糖 10g、 蔗糖 20g、 糖。
18、蜜 15g、 NaCl3g、 蛋白胨 5g、 磷酸氢二钾 5g， 余量为水， pH6.00.2， 将 上述组份混合均匀后， 121高压灭菌 30min。 0026 接种前， 先打开培养房的臭氧发生器以及紫外灯开关， 培养房面积 ： 25m2， 消毒 30min， 制备无菌环境， 在此无菌环境中将二级种子液以质量百分比 3的接种量接种到麸 皮固体培养基中， 混合均匀， 控制麸皮固体培养基中的通风量为 ： 10 换气次数 / 小时， 温度 28， 湿度为8090的条件下培养60小时， 培养期间每隔3小时翻动麸皮固体培养基料 一次， 由此而制得高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂。 所述的麸皮固体培养基，。
19、 按总质量分 数 100计， 由麸皮 38、 豆粕 23、 尿素 0.5、 氯化铵 0.5和水 38组成， 原料混合， 搅 拌均匀。然后在旋转蒸煮锅或蒸饭机， 压力， 温度分别为 ： 1.05 1.3Kg/cm3， 121 125 条件下， 灭菌 30 40min， 冷却至 40 50分装浅盆， 每盆 5kg， 备用。 0027 一、 活菌数和杂菌率的检测 ： 0028 1、 平板菌落计数法 0029 1.1、 称取本实施例的高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂 10g 作为样品， 放入盛有 90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中， 摇床200rpm振荡20min， 静置2030S， 制成样品 悬液。
20、。 0030 1.2、 用 1ml 无菌吸管吸取 1mL 样品悬液， 放入盛有 9mL 灭菌水的试管中， 充分振摇 使混合均匀， 即制成 1 ： 100 均匀稀释液。 0031 1.3、 用 1mL 无菌吸管吸取 1 ： 100 稀释液 1mL， 沿管壁徐徐注入含有 9mL 灭菌水试 管内， 振摇试管， 混合均匀， 做成 1 ： 1000 的稀释液。另取 1mL 灭菌吸管， 按上述操作顺序， 做 10 倍递增稀释液， 分别制成 10-4、 10-5、 10-610-9梯度稀释液， 如此每递增稀释一次， 即换 用 1 支 1mL 灭菌吸管。 0032 1.4、 选择 2-3 个适宜稀释度 ( 一。
21、般取 10-6、 10-7、 10-8)， 用灭菌 100L 微量移液器， 各取0.1mL接种于已制备好的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平皿内， 每个稀释度做3个平板， 用 无菌推棒均匀涂于整个表面。 0033 1.5、 将平皿倒置于 28 1恒温培养箱内培养 48h2h 后， 选取菌落数在 30-300 之间的平板计数。 0034 2、 酿酒酵母菌菌落形态 0035 形态特征 ： 乳白色， 圆形， 隆起， 外形光滑， 不透明， 边缘整齐。 0036 3、 菌落计数 说 明 书 CN 104286415 A 5 4/6 页 6 0037 3.1、 稀释度的选择 0038 3.1.1、 应选择平均菌落在。
22、 30-300 之间的稀释度， 乘以稀释倍数报告之。 0039 3.1.2、 若有两个稀释度。其生长的菌落数均在 30-300 之间， 则视两者之间如何来 决定若其 0040 比小于或等于 2， 应报告其平均数 ； 若大于 2， 则报告其中较小的数字。 0041 3.1.3、 若所有稀释度的平均菌落数均大于 300。则应按稀释度最高的平均菌落数 乘以稀释倍数报告之。 0042 3.1.4、 若所有稀释度平均菌落数均小于 30， 则应按稀释度最低平均菌落数乘以稀 释倍数报告之。 0043 3.2、 可疑菌落鉴定 0044 3.2.1 随机挑选 5 个菌落进行鉴定， 包括菌落形态、 菌体形态和子囊。
23、孢子形态显微 镜观察， 以及生理生化鉴定。其操作方法参见 酵母菌鉴定与分类手册 (1991 年出版 )。 0045 3.2.2 鉴定结果 0046 菌落形态 ： 菌落大而湿润， 隆起， 乳白色， 表面光滑无皱褶， 边缘清晰。 0047 菌体形态 ： 菌体于显微镜下观察， 细胞呈卵圆形、 椭圆形或圆形。 0048 子囊孢子形态 ： 子囊孢子于显微镜下观察， 呈光滑的圆形或卵圆形。 0049 生化鉴定 ： 酿酒酵母能发酵葡萄糖， 麦芽糖， 不能发酵乳糖， 不能同化硝酸盐。 0050 3.2.3 菌落数的报告 0051 挑取菌落总数在 30-300 之间的平板计数， 随机挑取 5 个可疑菌落鉴定后，。
24、 根据以 下公式计算得出每克样品中酿酒酵母菌数， 公式为 ： 0052 A BC/5f10 0053 式中 ： 0054 A测定的酿酒酵母菌落数， 单位为 cfu/g ； 0055 B同一稀释度三次重复的可疑酿酒酵母平均菌落数 ； 0056 C5 个鉴定的菌落中确认为酿酒酵母的菌落数 ； 0057 f稀释倍数 ； 0058 10转换因子。 0059 杂菌率 ( ) 杂菌总数 /( 酿酒酵母活菌数 + 杂菌总数 ) 0060 将本实施例的高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂进行检验发现， 其每克含活菌数 30 亿个活菌， 杂菌率 0.05。 0061 酿酒酵母产谷胱甘肽 ： 将高产谷胱甘肽酿酒酵母微生。
25、物制剂中的酿酒酵母接入麸 皮固体培养基， 接种量为重量百分比 ： 2， 温度28， 培养60小时。 将经过上述发酵固形物 溶于水中， 85水浴 15min， 于离心机中 5000rpm 离心 10 15min。取上清液用 DTNB(5- 硫 代 -2- 硝基苯甲酸 ) 法测定谷胱甘肽含量， 测得谷胱甘肽含量达 500mg/kg 以上。 0062 将此高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂经 30-45真空干燥处理， 包装成成品， 检 测合格后， 作为商品出售。 0063 实施例 2 ： 0064 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GIM2.139(保藏于广东省微生物菌种保藏 。
26、中心， 保藏号 GIM2.139， 该菌种对外销售， 可以购买到 ) 的冻干种上挑取一环菌体接种至麦 说 明 书 CN 104286415 A 6 5/6 页 7 芽汁琼脂培养基试管斜面培养基中， 28培养24小时 ； 再将试管斜面种子转接到YEPD液体 培养基中， 28培养 24h， 形成种子培养液， 其菌浓度为 8.0107cfu/mL。所述的麦芽汁琼 培养基的配方为 ： 每升含有麦芽膏粉 130g， 琼脂 20g， 氯霉素 0.1g， 余量为水， pH6.0 6.2， 115高压灭菌 20min。YEPD 液体培养基配方为 ： 每升含有酵母粉 10g， 蛋白胨 20g， 葡萄糖 20g，。
27、 蒸馏水 1000mL， pH 自然， 115湿热灭菌 20min。 0065 将种子培养液以质量百分比 3的接种量转入装有一级发酵培养基的 30L 种子罐 中进行发酵培养， 装液量 70， 发酵温度 281， 搅拌速率 350rpm， 通气量 0.8 0.9V/ Vmin， 溶氧浓度 85 90， 发酵时间为 10 小时的菌液 ( 已进入对数生长期 ) 制成一级 种子液 ； 将一级种子液以质量百分比 10的接种量， 转接入装有二级发酵培养基的 300L 发 酵罐中进一步扩大培养， 装液量 70， 发酵温度 281， 搅拌速率 150rpm， 通气量 0.8 0.9V/Vmin， 溶氧浓度 7。
28、0 80， 发酵时间为 22 小时的菌液 ( 已经进入对数生长期 ) 作 为二级种子液。所述的一级和二级发酵培养基均为， 每升含有葡萄糖 30g、 蔗糖 10g、 糖蜜 30g、 NaCl5g、 蛋白胨 10g、 磷酸氢二钾 1g， 余量为水， pH6.00.2， 将上述组份混合均匀后， 121高压灭菌 30min。 0066 接种前， 先打开培养房的臭氧发生器以及紫外灯开关， 培养房面积 ： 25m2， 消毒 30min， 制备无菌环境， 在此无菌环境中将二级种子液以 10 ( 质量百分比 ) 的接种量接种 到麸皮固体培养基中， 混合均匀， 控制麸皮固体培养基中的通风量为 ： 10 换气次数。
29、 / 小时， 温度 25， 湿度为 80 90的条件下培养 72 小时， 培养期间每隔 3 小时翻动麸皮固体培 养基料一次， 由此而制得高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂。 所述的麸皮固体培养基， 按总 质量分数 100计， 含有麸皮 38.8、 豆粕 10、 尿素 0.1、 氯化铵 0.1和水 51组成， 原料混合， 搅拌均匀。然后在旋转蒸煮锅或蒸饭机， 压力， 温度分别为 ： 1.05 1.3Kg/cm3， 121 125条件下， 灭菌 30 40min， 冷却至 40 50分装浅盆， 每盆 5kg， 备用。 0067 按照实施例 1 的方法， 将本实施例的高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂进行检。
30、验 发现， 其每克含活菌数 20 亿个活菌， 杂菌率 0.08。 0068 酿酒酵母产谷胱甘肽 ： 将高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂中的酿酒酵母接入麸 皮固体培养基， 接种量为重量百分比 ： 4， 温度25， 培养70小时。 将经过上述发酵固形物 溶于水中， 85水浴 15min， 于离心机中 5000rpm 离心 10 15min。取上清液用 DTNB(5- 硫 代 -2- 硝基苯甲酸 ) 法测定谷胱甘肽含量， 测得谷胱甘肽含量达 400mg/kg 以上。 0069 将此高产谷胱甘肽酿酒酵母经 30-45真空干燥处理， 包装成成品， 检测合格后， 作为商品出售。 0070 实施例 3 ： 0。
31、071 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GIM2.139(保藏于广东省微生物菌种保藏 中心， 保藏号 GIM2.139， 该菌种对外销售， 可以购买到 ) 的冻干种上挑取一环菌体接种至麦 芽汁琼脂试管斜面培养基中， 28培养24小时 ； 再将试管斜面种子转接到YEPD液体培养基 中， 28培养 24h， 形成种子培养液， 其菌浓度为 1.0107cfu/mL。所述的麦芽汁琼培养基 的配方为 ： 每升含有麦芽膏粉 130g， 琼脂 20g， 氯霉素 0.1g， 余量为水， pH6.0 6.2， 115 高压灭菌 20min。YEPD 液体培养基配方为 ： 每升含有酵母。
32、粉 10g， 蛋白胨 20g， 葡萄糖 20g， 蒸馏水 1000mL， pH 自然， 115湿热灭菌 20min。 0072 将种子培养液以质量百分比 4的接种量转入装有一级发酵培养基的 30L 种子罐 说 明 书 CN 104286415 A 7 6/6 页 8 中进行发酵培养， 装液量 70， 发酵温度 281， 搅拌速率 350rpm， 通气量 0.8 0.9V/ V min， 溶氧浓度 80 90， 发酵时间为 12 小时的菌液 ( 已经进入对数生长期 ) 制成一级 种子液 ； 将一级种子液以质量百分比 2的接种量， 转接入装有二级发酵培养基的 300L 发 酵罐中进一步扩大培养， 。
33、装液量 70， 发酵温度 281， 搅拌速率 150rpm， 通气量 0.8 0.9V/Vmin， 溶氧浓度 70 80， 发酵时间为 14 小时的菌液 ( 已经进入对数生长期 ) 作为二级种子液。所述的一级和二级发酵培养基均为， 每升含有葡萄糖 5g、 蔗糖 2g、 糖蜜 2g、 NaCl10g、 蛋白胨 20g、 磷酸氢二钾 15g， 余量为水， pH6.00.2， 将上述组份混合均匀后， 121高压灭菌 30min。 0073 接种前， 先打开培养房的臭氧发生器以及紫外灯开关， 培养房面积 ： 25m2， 消毒 30min， 制备无菌环境， 在此无菌环境中将二级种子液以质量百分比 2的接。
34、种量接种到麸 皮固体培养基中， 混合均匀， 控制麸皮固体培养基中的通风量为 ： 3 换气次数 / 小时， 温度 32， 湿度为 80 90的条件下培养 65 小时， 培养期间每隔 5 小时翻动麸皮固体培养基 料一次， 由此而制得高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂。 所述的麸皮固体培养基， 按总质量 分数 100计， 含有麸皮 50、 豆粕 10.4、 尿素 0.3、 氯化铵 0.3和水 39组成， 原料 混合， 搅拌均匀。 然后在旋转蒸煮锅或蒸饭机， 压力， 温度分别为 ： 1.051.3Kg/cm3， 121 125条件下， 灭菌 30 40min， 冷却至 40 50分装浅盆， 每盆 5kg，。
35、 备用。 0074 按照实施例 1 的方法， 将本实施例的高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂进行检验 发现， 其每克含活菌数 25 亿个活菌， 杂菌率 0.02。 0075 酿酒酵母产谷胱甘肽 ： 将高产谷胱甘肽酿酒酵母微生物制剂中的酿酒酵母接入麸 皮固体培养基， 接种量为重量百分比 ： 8， 温度32， 培养65小时。 将经过上述发酵固形物 溶于水中， 85水浴 15min， 于离心机中 5000rpm 离心 10 15min。取上清液用 DTNB(5- 硫 代 -2- 硝基苯甲酸 ) 法测定谷胱甘肽含量， 测得谷胱甘肽含量达 400mg/kg 以上。 0076 将此高产谷胱甘肽酿酒酵母经 30-45真空干燥处理， 包装成成品， 检测合格后， 作为商品出售。 说 明 书 CN 104286415 A 8 1/1 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104286415 A 9 。