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1、(10)申请公布号 CN 102973580 A (43)申请公布日 2013.03.20 CN 102973580 A *CN102973580A* (21)申请号 201110263301.X (22)申请日 2011.09.07 A61K 31/7024(2006.01) A61K 9/08(2006.01) A61P 1/16(2006.01) (71)申请人 杭州赛利药物研究所有限公司 地址 310052 浙江省杭州市滨江区滨安路 1180 号华业科技园 2 幢 4 楼西侧 申请人 海南普利制药有限公司 浙江瑞达药业有限公司 (72)发明人 范敏华 魏巍 周学来 (54) 发明名称 。
2、积雪草苷酸在制备治疗肝纤维化药物中的用 途 (57) 摘要 本发明涉及积雪草的用途， 尤其涉及积雪草 中的单体积雪草苷酸在制备治疗肝纤维化药物中 的用途。本发明还提供了治疗肝纤维化的积雪草 苷酸注射剂 及其制备方法。 本发明有效拓宽了肝 纤维化和肝硬化患者的选择， 而且和现有的治疗 肝纤维化药物比较， 本发明具备疗效好、 不良副作 用小的优点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 1/1 页 2 1. 积雪草苷酸在制备治疗肝纤维化药物中的用途。 2. 根据权利要求 1 所述的。
3、用途， 其特征在于所述的积雪草苷酸制备成注射剂。 3. 根据权利要求 2 所述的用途， 其特征在于所述的注射剂为静脉注射剂、 动脉注射剂 和皮下注射剂。 4.根据权利要求2所述的用途， 其特征在于所述的积雪草苷酸注射剂剂， 由215g药物 活性成分积雪草苷酸溶解在 1000ml 的胶束溶剂系统中制得， 所述的胶束溶剂包括 15%30% 的表面活性剂和 70%85% 的溶剂。 5.根据权利要求3所述的用途， 其特征在于所述的注射剂由215g药物溶于1000ml的 溶剂中， 并通过滤膜制备得到。 6. 根据权利要求 4 所述的用途， 其特征在于所述的表面活性剂包括吐温 20、 吐温 85 或 两者。
4、混合。 7. 根据权利要求 4 或 5 所述的用途， 其特征在于所述的溶剂是磷酸缓冲液、 生理盐水、 羧甲基纤维素溶液、 聚乙二醇溶液、 丙二醇。 8. 根据权利要求 24 所述的积雪草苷酸注射剂的制备方法， 其特征在于取表面活性 剂， 放于量瓶中， 加入积雪草苷酸， 震荡至完全溶解， 加入 pH 7.0 磷酸缓冲液 （PBS） 至刻 度， 充分混匀后放于50水浴上加热30min， 放置6小时至溶液系统平衡， 通过滤膜， 制成积 雪草苷酸注射液。 9.根据权利要求5所述的积雪草苷酸注射剂的制备方法， 取215g积雪草苷酸， 加入到 1000ml 的溶剂中， 搅拌， 溶解完全后过滤膜即得。 权 。
5、利 要 求 书 CN 102973580 A 2 1/4 页 3 积雪草苷酸在制备治疗肝纤维化药物中的用途 技术领域 0001 本发明涉及积雪草的用途， 尤其是积雪草在制备治疗肝纤维化药物中的用途， 特 别涉及积雪草苷酸在制备治疗肝纤维化药物中的用途。 背景技术 0002 肝纤维化是肝脏纤维结缔组织异常增生的一种病理状态， 是慢性肝病发展为肝硬 化的必经阶段。以肝细胞损伤， 通过旁分泌作用激活肝星状细胞 （Hsc） ， 使其过量合成和分 泌细胞外基质 （ECM） 、 促炎症及纤维化细胞因了为特征。 随着肝脏病变的发展， 肝细胞变性、 坏死， 再生结节， 假小叶和纤维隔形成， 肝正常结构遭到破坏。
6、， 结果使肝脏变硬 （肝硬化） ， 进 一步可发展为肝癌。 西药对肝纤维化尚无有效治疗方法， 仅以秋水仙碱为主要治疗药物， 但 长期应用， 毒副反应较大。 国外的研究还多集中于基础方面， 以期在逐渐明了的肝纤维化形 成机理中寻找突破口， 而中药抗肝纤维化研究从临床观察和动物实验入手， 其初步结果已 显示出巨大的潜力。 积雪草又名落得打、 崩大碗、 马蹄等， 分布于我国江南各地， 为唇形科植 物。中医认为其性微寒、 味苦、 辛、 有清热除湿、 解毒利尿作用， 常用于治疗外感风寒。从临 床实践中发现积雪草对预防各种肝炎所致的肝纤维化和肝硬化效果良好。 但是积雪草中含 有多种成分， 具体是哪种成分发。
7、挥预防和治疗肝纤维化和肝硬化作用不明， 这极大地阻碍 了积雪草在治疗肝纤维化和肝硬化中的应用。本发明从积雪草中提取出积雪草苷酸， 并利 用肝纤维化大鼠模型对积雪草苷酸治疗肝纤维化进行了基础研究， 结果表明， 积雪草苷酸 可明显减少大鼠肝纤维化、 肝硬化。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供积雪草苷酸的新用途， 即积雪草苷酸在制备治疗肝纤维化 药物中的用途。 0004 本发明的另一目的在于提供一种治疗肝纤维化的积雪草苷酸注射剂及其制备方法。 0005 为了实现上述发明目的， 本发明利用肝硬化大鼠模型进行积雪草苷酸阻断肝纤维 化病理基础的基础研究， 结果表明积雪草苷酸可明显减少实验大鼠肝纤维。
8、化和肝硬化。 0006 积雪草苷酸在制备治疗肝纤维化药物中的用途。 0007 所述的积雪草苷酸制备成注射剂。 0008 所述的注射剂为静脉注射剂、 动脉注射剂和皮下注射剂。 0009 所述的积雪草苷酸注射剂剂， 由215g药物活性成分积雪草苷酸溶解在1000ml的 胶束溶剂系统中制得， 所述的胶束溶剂包括 15%30% 的表面活性剂和 70%85% 的溶剂。 0010 所述的注射剂由 215g 药物溶于 1000ml 的溶剂中， 并通过滤膜制备得到。 0011 所述的表面活性剂包括吐温 20、 吐温 85 或两者混合。 0012 所述的溶剂是磷酸缓冲液、 生理盐水、 羧甲基纤维素溶液、 聚乙二。
9、醇溶液、 丙二醇。 0013 所述的积雪草苷酸注射剂的制备方法， 取表面活性剂， 放于量瓶中， 加入积雪草苷 酸， 震荡至完全溶解， 加入 pH 7.0 磷酸缓冲液 （PBS） 至刻度， 充分混匀后放于 50水浴上 说 明 书 CN 102973580 A 3 2/4 页 4 加热 30min， 放置 6 小时至溶液系统平衡， 通过滤膜， 制成积雪草苷酸注射液。 0014 所述的积雪草苷酸注射剂的制备方法， 取 215g 积雪草苷酸， 加入到 1000ml 的溶 剂中， 搅拌， 溶解完全后过滤膜即得。 0015 积雪草苷酸在酸性条件下的水中溶解， 易溶于乙醇、 丙烯、 吡啶。目前国外积雪草 总。
10、苷的注射剂多以丙烯或 pH3.5 左右的注射用水为基质。丙烯会引起注射部位严重疼痛的 不良反应， pH3.5 超过了注射剂的 pH 范围 49， 而且过低的 pH 值出了会带来注射疼痛外， 还 增加了对脏器、 血管等损伤的风险。为增加积雪草苷酸溶解度， 减少注射部位疼痛， 我们开 发了胶束溶剂系统， 包括 10% 的表面活性剂和 90% 的磷酸盐缓冲液， pH 7.0 （PBS） 。这个表 面活性剂可以是吐温 20 和吐温 85。当吐温 20 和吐温 85 的比例从 0:1010:0 之间变化时， 积雪草提取物的有效成分单体的溶解度随之上升 726 倍 （与单纯在 PBS7.0 中比较 0.7。
11、mg/ ml） ， 胶束的粒径也随之降低。在吐温 20 和吐温 85 的比例为 6:4、 8:2 和 10:0 时， 积雪草苷 酸的溶解度可高达 10 mg/ml 以上， 胶束的粒径低于 2m。在 55的环境中贮存 60 天， 未 发现含量、 有关物质等项目发生明显变化。渗透压与以丙烯或 pH3.5 左右的注射用水为基 质的注射剂相比， 明显降低， 与生理盐水的渗透压更为相似。 0016 本发明提供了积雪草的一个单体积雪草苷酸的新用途， 在制备治疗肝纤维化药物 中的用途， 并且提供了一种治疗肝纤维化的积雪草苷酸注射剂及其制备方法， 有效拓宽了 肝纤维化和肝硬化患者的选择， 而且和现有的治疗肝纤。
12、维化药物比较， 本发明具备疗效好、 不良副作用小的优点。 0017 为了进一步合理利用积雪草苷酸， 我们对积雪草苷酸做了抗肝纤维化的实验研 究， 以二甲基亚硝胺诱导大鼠肝纤维化模型， 采用超声波引导下肝脏内注射的方法， 观察血 清谷丙转氨酶 （ALT） 、 谷草转氨酶 （AST） 、 透明质酸 （HA） 、 层粘连蛋白 （LN） 等指标， 研究积雪 草苷酸对实验性大鼠肝纤维化的防治作用。 0018 材料与方法 1、 动物及分组 ： 健康 SD 大鼠 84 只， 雌雄各半， 体重 （180 士 20） g, 随机分为 6 组。分 别为正常组 （假手术组， 给予生理盐水） 、 模型组、 秋水仙碱组。
13、 （mg/kg） 、 积雪草苷酸腹腔注射 组 （3mg/kg， ip） 、 积雪草苷酸大剂量组 （6mg/kg） 、 积雪草苷酸中剂量组 （3mg/kg） 、 积雪草苷 酸小剂量组 （1.5mg/kg） 。 0019 2、 药物 ： 积雪草苷酸注射剂， 来源于杭州赛利药物研究所有限公司， 将药物配制成 不同浓度供大、 中、 小剂量组应用， 4冰箱保存。 0020 3 试剂和仪器 ： 秋水仙碱， 由昆明制药集团股份有限公司生产， 批号 ： 980732， 配制 成 l0mg/L 混悬液， 4冰箱保存。DMN， 上海开明化学厂生产， 化学纯， 批号 ： 01610720， 实验 时配制成 0.5%。
14、 的溶液。HA 放免试剂盒、 LN 放免试剂盒， 均由上海海军医学研究所提供。 Supen1000 型全自动生化仪， 美国 ASCA 制造。SN-682 型放射免疫 X 计数器， 上海原了能研 究所日环仪器厂制造， HitachiEUB-40 型超声机， 日立公司制造。 0021 4、 方法 4.1 造模方法 ： 用生理盐水将 DMN 配成 0.5% 的溶液， 大鼠腹腔注射 DMN 每次 l0mg/kg （2m1/kg） ， 共 12 次， 第 1 周每天 1 次， 连续 3 天， 第 24 周每周各 1 次， 第 57 周均每天 1 次， 连续 2 天， 至模型建立。 0022 4.2 药物。
15、肝内直接注射 ： 模型大鼠麻醉后仰卧固定于操作台上， 上腹部备皮、 消 说 明 书 CN 102973580 A 4 3/4 页 5 毒， 用 HitachiEUB-40 型超声机 3.5MHz 探头作肝脏定位导引。穿刺注射采用 0.25ml 注射 器， 5 号注射针头， 注射速度 0.6ml/min， 分别多点缓慢地注入大鼠肝脏各叶的边缘， 间距 5mm， 进针深度 5mm。注射部位用丝线缝合标记。 0023 4.3 观察指标及检测方法 ： 2 周后， 同上麻醉动物， 腹主动脉取血制备血清， -20 冰箱保存， 分别检测血清总蛋白 （TP） 、 白蛋白 （ALB） 、 谷丙转氨酶 （ALT）。
16、 、 谷草转氨酶 （AST） 、 透明质酸 （HA） 、 层粘连蛋白 （LN） 的含量。采血后取肝脏称重， 并取左叶肝脏置 10% 福尔马 林溶液中固定， HE 染色， 行病理组织学观察肝组织纤维化程度 （04 级） 。 0024 5、 统计学方法 ： 数据以 X 士 s 表示， 采用 SPSS11.0 软件进行处理。多组资料间比 较采用 ANOVA 分析， 肝组织纤维化程度采用等级序值法。 0025 实验结果 1、 积雪草苷酸对肝纤维化大鼠血清TP及ALB的影响 见表1。 积雪草苷酸腹腔注射组、 大剂量组、 中剂量组、 小剂量组与模型组比较， TP 及 ALB 变化均不明显 （P0.05） 。
17、。 0026 2、 积雪草苷酸对肝纤维化大鼠血清 ALT 及 AST 含量的影响 见表 1。积雪草苷酸 腹腔注射组、 大剂量组、 中剂量组、 小剂量组及秋水仙碱组与模型组比较， 均可降低 ALT 及 AST 水平 （P0.01 或 P0.05） 。 0027 3、 积雪草苷酸对肝纤维化大鼠血清 HA 及 LN 含量的影响 见表 1。积雪草苷酸腹 腔注射组、 大剂量组、 中剂量组、 小剂量组及秋水仙碱组与模型组比较， HA 水平降低， 但对 LN 的影响不明显。 0028 表 1 积雪草苷酸对肝纤维化大鼠血清 TP、 ALB、 ALT、 AST、 HA 及 LN 的影响 (xs) 组别nTP（g。
18、/L）ALB（g/L）ALT（g/L）AST（g/L）HA（g/L）LN（g/L） 正常1271.67.232.03.032.19.6108.133.764.212.457.615.1 模型1268.74.929.93.2127568.8255.278.7254.6107.275.716.1 秋水仙碱1271.96.332.54.159.115.5*117.531.4*126.438.9*64.917.5 腹腔注射1272.66.434.53.760.214.6*120.331.9*125.037.7*65.116.3 大剂量1269.53.535.62.454.912.8*125.439.1。
19、*89.939.0*65.814.3 中剂量1270.54.132.92.660.121.0*150.045.2*102.549.5*68.810.0 小剂量1269.84.632.03.267.022.6*165.849.1*139.452.2*72.311.9 4、 各组大鼠肝脏病理组织学结果 正常组大鼠肝小叶结构完整、 无炎细胞浸润， 无纤 维化增生。模型组大鼠肝纤维化程度较明显， 肝小叶结构不完善， 肝细胞有炎性细胞浸润， 汇管区纤维增生包绕肝小叶。秋水仙碱组及积雪草苷酸腹腔注射组、 大剂量组、 中剂量组、 小剂量组与模型组比较， 肝组织炎症细胞浸润、 脂肪变性、 肝纤维化程度均较模型。
20、组减轻 （P0.05， P0.01） 。结果见表 2。 0029 表 2 各组大鼠肝纤维化程度比较 ( 只 ) 说 明 书 CN 102973580 A 5 4/4 页 6 注 ： 与模型组比较， *P0.05， *P0.01 实验结果显示 ： 积雪草苷酸腹腔注射及肝脏直接给药大中小 3 个剂量均有不同程度的 改善肝功能的作用， 对 ALT 及 AST 均有较明显的抑制作用 (P0.05)。血清 HA 测定结果显 示 ： 积雪草苷酸腹腔注射及大中小 3 个剂量均能明显降低 HA 的含量 (P0.05)。 具体实施方式 0030 实施例 1 ： 制备积雪草苷酸注射剂 ： 取100ml吐温20， 。
21、放于1000ml量瓶中， 加入10g 积雪草苷酸， 震荡至完全溶解， 加入pH 7.0 磷酸缓冲液 （PBS） 至刻度， 充分混匀后放于 50水浴上加热 30min。放置 6 小时至溶 液系统平衡， 通过 0.45m 的滤膜， 制成积雪草苷酸注射液。 0031 实施例 2 ： 制备积雪草苷酸注射剂 ： 取 60ml 吐温 20 和 40ml 吐温 85， 放于 1000ml 量瓶中， 加入 6g 积雪草苷酸， 震荡至完 全溶解， 加入 pH 7.0 磷酸缓冲液 （PBS） 至刻度， 充分混匀后放于 50水浴上加热 30min。放 置 6 小时至溶液系统平衡， 通过 0.45m 的滤膜， 制成积。
22、雪草苷酸注射液。 0032 实施例 3 ： 制备积雪草苷酸注射剂 ： 取 80ml 吐温 20 和 20ml 吐温 85， 放于 1000ml 量瓶中， 加入 14g 积雪草苷酸， 震荡至完 全溶解， 加入 pH 7.0 磷酸缓冲液 （PBS） 至刻度， 充分混匀后放于 50水浴上加热 30min。放 置 6 小时至溶液系统平衡， 通过 0.45m 的滤膜， 制成积雪草苷酸注射液。 0033 实施例 4 ： 取 10g 积雪草苷酸， 加入到 1000ml 的 0.5% 羧甲基纤维素溶液中， 搅拌至完全溶解， 将 液体通过 0.45m 的滤膜， 即得积雪草苷酸静脉注射液。 0034 将制得的积雪。
23、草苷酸静脉注射剂经冷冻干燥后得到积雪草苷酸冻干针剂。 0035 实施例 5 ： 取 5g 积雪草苷酸， 加入到 1000ml 的聚乙二醇 300 溶液中， 搅拌至完全溶解， 将液体通 过 0.45m 的滤膜， 即得积雪草苷酸动脉注射液。 0036 将制得的积雪草苷酸动脉注射剂经冷冻干燥后得到积雪草苷酸冻干针剂。 0037 实施例 6 ： 取 5g 积雪草苷酸， 加入到 1000ml 注射用水中， 搅拌至完全溶解， 用盐酸或氢氧化钠将 pH 调至 3.5， 将液体通过 0.45m 的滤膜， 即得积雪草苷酸皮下注射液。 0038 将制得的积雪草苷酸皮下注射剂经冷冻干燥后得到积雪草苷酸冻干针剂。 0039 实施例 7 ： 取 12g 积雪草苷酸， 加入到 1000ml 丙二醇中， 搅拌至完全溶解， 将液体通过 0.45m 的 滤膜， 即得积雪草苷酸注射液。 0040 将制得的积雪草苷酸注射剂经冷冻干燥后得到积雪草苷酸冻干针剂。 说 明 书 CN 102973580 A 6 。