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1、(10)申请公布号 CN 102988667 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102988667 A *CN102988667A* (21)申请号 201210388267.3 (22)申请日 2012.10.15 A61K 36/8905(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 李正梅 地址 211200 江苏省南京市溧水县经济开发 区团山东路 1 号 (72)发明人 不公告发明人 (54) 发明名称 一种调经活血片的制备方法及应用 (57) 摘要 本发明提供一种调经活血片的制备方法， 由 木香 20g、 川芎 20g、 醋制延胡索 20。
2、g、 当归 60g、 熟 地黄 40g、 赤芍 40g、 红花 30g、 乌药 30g、 白术 30g、 丹参 60g、 制香附 60g、 甘草水制吴茱萸 10g、 泽兰 60g、 鸡血藤 60g、 菟丝子 80g 作为原料药制成， 采 用超临界萃取和微波萃取制备而成， 使得阿魏酸 含量有很大提高， 本发明还提供了调经活血片在 制备抑制小鼠肥大细胞癌 P815 细胞增殖药物中 的应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 1/1 页 2 1. 一种调经活血片的制备方法， 由木。
3、香 20g、 川芎 20g、 醋制延胡索 20g、 当归 60g、 熟 地黄 40g、 赤芍 40g、 红花 30g、 乌药 30g、 白术 30g、 丹参 60g、 制香附 60g、 甘草水制吴茱萸 10g、 泽兰 60g、 鸡血藤 60g、 菟丝子 80g 作为原料药制成， 其特征在于所述的方法由下列步 骤组成 ： 取木香、 川芎、 醋制延胡索、 当归、 红花， 加入到 CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带 剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为 4-6%， 萃取压力 15-30MPa， 温度 30-50， CO2流量 1-3m1/g 生药min， 萃取时间 150-180min， 得超临。
4、界萃取物， 备用 ； 取其余中药， 粉碎， 加入 2L的70%乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波萃取， 萃取功率400-600W， 萃取2次， 每次4-8 分钟， 合并萃取液， 浓缩， 加到 D101 大孔吸附树脂柱上， 50% 乙醇洗脱， 收集 5 倍量柱体积洗 脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取物， 备用 ； 将上述超临界萃取物和微波提取物 混合， 加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 600 片， 每片重 0.5g。 2. 根据权利要求 1 所述一种调经活血片的制备方法， 其特征在于所述 CO2超临界萃取 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为 5%。 3. 根。
5、据权利要求 1 所述一种调经活血片的制备方法， 其特征在于所述微波萃取功率 500W， 每次萃取 6 分钟。 4. 根据权利要求 1 所述一种调经活血片的制备方法， 其特征在于所述 CO2超临界萃取 的萃取压力 20MPa， 温度 40， CO2流量 2ml/g 生药min， 萃取时间 160min。 5. 根据权利要求 1 所述一种调经活血片在制备抑制小鼠肥大细胞癌 P815 细胞增殖药 物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102988667 A 2 1/5 页 3 一种调经活血片的制备方法及应用 技术领域 0001 本发明涉及中药制剂技术领域， 具体涉及一种调经活血片的制备方法及应用。。
6、 背景技术 0002 调经活血片记载于卫生部标准 WS3-B-0614-91， 由木香 20g、 川芎 20g、 醋制延胡索 20g、 当归 60g、 熟地黄 40g、 赤芍 40g、 红花 30g、 乌药 30g、 白术 30g、 丹参 60g、 制香附 60g、 甘 草水制吴茱萸 10g、 泽兰 60g、 鸡血藤 60g、 菟丝子 80g 作为原料药制成， 能调经活血， 行气止 痛。用于月经不调， 行经腹痛。 0003 现有技术中， 尚未有调经活血片在提取制备方面采用超临界和微波技术的报道， 而采用打粉和水煎煮的方法， 工艺粗糙、 落后， 杂质多， 导致患者用量过大， 不方便服用， 严 重。
7、影响了本品在临床上应用。 发明内容 0004 发明目的 ： 为了解决上述问题， 本发明的目的在于提供一种调经活血片的制备方 法。 0005 本发明的另一个目的在于提供一种调经活血片在制备抑制小鼠肥大细胞癌 P815 细胞增殖药物中的应用。 0006 技术方案 ： 本发明的目的是通过如下的方案实现的 ： 0007 一种调经活血片的制备方法， 由木香 20g、 川芎 20g、 醋制延胡索 20g、 当归 60g、 熟 地黄 40g、 赤芍 40g、 红花 30g、 乌药 30g、 白术 30g、 丹参 60g、 制香附 60g、 甘草水制吴茱萸 10g、 泽兰 60g、 鸡血藤 60g、 菟丝子 。
8、80g 作为原料药制成， 所述的方法由下列步骤组成 ： 取木 香、 川芎、 醋制延胡索、 当归、 红花， 加入到 CO2 超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占 总萃取溶剂的体积百分比为 4-6%， 萃取压力 15-30MPa， 温度 30-50， CO2流量 1-3m1/g 生 药 min， 萃取时间150-180min， 得超临界萃取物， 备用 ； 取其余中药， 粉碎， 加入2L的70%乙 醇， 投入微波萃取装置中进行微波萃取， 萃取功率 400-600W， 萃取 2 次， 每次 4-8 分钟， 合并 萃取液， 浓缩， 加到 D101 大孔吸附树脂柱上， 50% 乙醇洗脱， 收集 5。
9、 倍量柱体积洗脱液， 减压 回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取物， 备用 ； 将上述超临界萃取物和微波提取物混合， 加入 淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 600 片， 每片重 0.5g。 0008 上述一种调经活血片的制备方法， 所述 CO2超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体 积百分比为 5%。 0009 上述一种调经活血片的制备方法， 所述微波萃取功率 500W， 每次萃取 6 分钟。 0010 上述一种调经活血片的制备方法， 所述 CO2超临界萃取的萃取压力 20MPa， 温度 40， CO2流量 2ml/g 生药min， 萃取时间 160min。 0011 上述调经活。
10、血片在制备抑制小鼠肥大细胞癌 P815 细胞增殖药物中的应用。 0012 现有技术中， 调经活血片每片0.5g， 每次5片， 一日3次， 采用本发明制备成的调经 活血片每片 0.5g， 每次仅需 3 片， 一日服用 3 次， 在具有更多活性成分的条件下大大减少了 说 明 书 CN 102988667 A 3 2/5 页 4 服用量。此结论可以通过下述试验证明。 0013 试验一、 不同方法制备的调经活血片中阿魏酸含量的比较 0014 1、 仪器及试药本发明调经活血片 ： 按实施例3方法制备， 使用620g原料药， 经提取 制成 600 片， 每片重 0.5g。原调经活血片， 按部颁标准方法制备。
11、， 使用 620g 原料药， 经提取 制成 600 片， 每片重 0.5g。Agilent1200 高效液相色谱仪 ； METTLERAE240 电子分析天平 ； 阿 魏酸对照品 ( 中国药品生物制品检定所 )。 0015 2、 方法 0016 色谱条件与系统适用性试验 ： 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 ； 甲醇 - 水 - 磷 酸 （40 ： 60 ： 0.2） 为流动相 ； 检测波长为 280nm。理论板数按阿魏酸峰计算， 应不低于 3000。 0017 对照品溶液的制备 ： 精密称取在 60减压干燥 4 小时的阿魏酸对照品适量， 加甲 醇制成每 1ml 含 18g 的溶液， 即得。 0。
12、018 供试品溶液的制备 ： 取本发明调经活血片和原调经活血片， 研细， 混匀， 取 1g， 精 密称定， 精密加入 70% 乙醇 20ml， 密塞， 超声处理 10 分钟， 离心， 取上清液， 即得。 0019 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 20l， 注入液相色谱仪， 测定， 即得。 0020 3、 结果 0021 结果表明， 本发明调经活血片中阿魏酸的含量为 1.38mg/ 片 ； 而原调经活血片中 阿魏酸的含量为 0.29mg/ 片， 在服用量减少的情况下， 阿魏酸含量有很大提高。 0022 上述研究表明， 采用本发明制备的调经活血片， 有效成分含量高于部颁标准法制 备的调。
13、经活血片。 具体实施方式 0023 以下通过实施例形式， 对本发明的上述内容再作进一步的详细说明， 但不应将此 理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例， 凡基于本发明上述内容所实现的技术均 属于本发明的范围。 0024 实施例 1 0025 取木香 20g、 川芎 20g、 醋制延胡索 20g、 当归 60g、 熟地黄 40g、 赤芍 40g、 红花 30g、 乌药 30g、 白术 30g、 丹参 60g、 制香附 60g、 甘草水制吴茱萸 10g、 泽兰 60g、 鸡血藤 60g、 菟丝 子 80g， 将木香、 川芎、 醋制延胡索、 当归、 红花， 加入到 CO2 超临界萃取器中， 乙醇。
14、作为夹带 剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为 4%， 萃取压力 15MPa， 温度 30， CO2流量 1m1/g 生 药min， 萃取时间 150min， 得超临界萃取物， 备用 ； 取其余中药， 粉碎， 加入 2L 的 70% 乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波萃取， 萃取功率 400W， 萃取 2 次， 每次 4 分钟， 合并萃取液， 浓 缩， 加到 D101 大孔吸附树脂柱上， 50% 乙醇洗脱， 收集 5 倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取物， 备用 ； 将上述超临界萃取物和微波提取物混合， 加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 600。
15、 片， 每片重 0.5g。 0026 经检测， 成品中阿魏酸的含量为 1.41mg/ 片。 0027 实施例 2 0028 取木香 20g、 川芎 20g、 醋制延胡索 20g、 当归 60g、 熟地黄 40g、 赤芍 40g、 红花 30g、 乌药 30g、 白术 30g、 丹参 60g、 制香附 60g、 甘草水制吴茱萸 10g、 泽兰 60g、 鸡血藤 60g、 菟丝 说 明 书 CN 102988667 A 4 3/5 页 5 子 80g， 将木香、 川芎、 醋制延胡索、 当归、 红花， 加入到 CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带 剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为 6%， 萃取。
16、压力 30MPa， 温度 50， CO2流量 3m1/g 生 药min， 萃取时间 180min， 得超临界萃取物， 备用 ； 取其余中药， 粉碎， 加入 2L 的 70% 乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波萃取， 萃取功率 600W， 萃取 2 次， 每次 8 分钟， 合并萃取液， 浓 缩， 加到 D101 大孔吸附树脂柱上， 50% 乙醇洗脱， 收集 5 倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取物， 备用 ； 将上述超临界萃取物和微波提取物混合， 加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 600 片， 每片重 0.5g。 0029 经检测， 成品中阿魏酸的。
17、含量为 1.45mg/ 片。 0030 实施例 3 0031 取木香 20g、 川芎 20g、 醋制延胡索 20g、 当归 60g、 熟地黄 40g、 赤芍 40g、 红花 30g、 乌药 30g、 白术 30g、 丹参 60g、 制香附 60g、 甘草水制吴茱萸 10g、 泽兰 60g、 鸡血藤 60g、 菟丝 子 80g， 将木香、 川芎、 醋制延胡索、 当归、 红花， 加入到 CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带 剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为 5%， 萃取压力 20MPa， 温度 40， CO2流量 2m1/g 生 药min， 萃取时间 160min， 得超临界萃取物， 备用 。
18、； 取其余中药， 粉碎， 加入 2L 的 70% 乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波萃取， 萃取功率 500W， 萃取 2 次， 每次 6 分钟， 合并萃取液， 浓 缩， 加到 D101 大孔吸附树脂柱上， 50% 乙醇洗脱， 收集 5 倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取物， 备用 ； 将上述超临界萃取物和微波提取物混合， 加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 600 片， 每片重 0.5g。 0032 经检测， 成品中阿魏酸的含量为 1.38mg/ 片。 0033 实施例 4 ： 调经活血片抑制 P815 细胞增殖的实验研究资料 0034 1 实验。
19、材料 0035 1.1 实验用细胞株 0036 小鼠肥大细胞癌 P815 细胞， 南京正宽医药科技有限公司实验室细胞库， DMEM+10%FBS 常规培养。 0037 1.2 实验药物 0038 研究药物 ： 本发明调经活血片 ： 按实施例 3 方法制备。 0039 药液储液 ： 称取 100mg 调经活血片， 溶于 5ml 无水乙醇中， 0.2m 滤器过滤， 500ldoff 管分装， -20存储， 同时 0.2m 滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。 0040 1.3 实验试剂 0041 DMEM（GIBCO 公司 Cat.No.12100-061Lot.No.758137） ； 胎牛血清 （。
20、浙江天杭生物科 技有限公司 Lot.No.100419） ； NaHCO3（上海久亿化学试剂有限公司 Cat.No.11810-033Lot. No.1088387） ； Trypsin（AMRESCO 公司批号 ： 2010/04） ； EDTA（AMRESCO 公司批号 ： 2009/10） ； Penicillin G Sodium Salt （AMRESCO公司批号 ： 2010242） ； Streptomycin Sulfate （AMRESCO 公司批号 ： 2010382） ； 无水乙醇 （南京化学试剂有限公司批号 ： 080310182） ； MTT(Biosharp 批 号。
21、 ： 0793);PBS（实验室自配） ； 0042 1.4 实验器材 0043 莱卡倒置显微镜 （德国 Leica 型号 ： DM1L） ； 可见 - 紫外光微孔板检测仪 （美国 MD 公司型号 ： SPECTRAMAX190） ； CO2 培养箱 （FORMA 型号 ： 3111） ； 超净台 （苏净集团安泰公司 制造型号 ： SW-CJ-ZFD） ； 纯水仪 （美国 Spring 公司型号 ： S/N020579） ； 精密移液器 （法国吉 说 明 书 CN 102988667 A 5 4/5 页 6 尔森公司型号 ： P2） ； 电子天平 （德国赛多利斯有限公司型号 ： BT323S）。
22、 ； 全自动高压灭菌锅 （日本 SANYO 公司型号 ： MLS-3020） ； 台式电热鼓风干燥箱 （上海精密实验设备公司型号 ： DHG9123A） ； 冰箱 （西门子公司型号 ： KG18V21TI） ； 液氮罐 （CBS 型号 ： 2001） ； 低速离心机 （上 海安亭科学仪器厂型号 ： KA-1000） ； 0.2m 滤器 （MILLIPORE 型号 ： SLGP033RB） ； 10cm 培养 皿 (NEST 公司 )、 96 孔培养板 （NEST 公司） ； 细胞计数板 ； 离心管、 移液管、 Tips 若干。 0044 2 实验方法 0045 1） P815 细胞用 DMEM。
23、+10%FBS 于 37、 5%CO2 进行常规培养 （10cm 培养皿） ， 当 细胞生长至对数期时， 收集细胞， 弃去培养液， PBS 轻洗 3 遍， 加入 3ml0.25% 胰蛋白 酶-0.04%EDTA， 37消化2min后， 向其中加入5ml完全培养基中和反应， 吹打细胞后将其转 入离心管中， 1000rpm 离心 5min， 调整细胞悬液浓度 3104 个 /ml。 0046 2） 将细胞种入 96 孔培养板中， 每孔加入细胞悬液 180l， 培养板放入细胞培养箱 中 （37， 5%CO2） 常规培养。 0047 3） 根据细胞生长情况， 一般长至 50%-70%， 加入调经活血片。
24、溶液， 继续培养 24h。 0048 4） 24h 后加入 20l MTT 溶液 （5mg/ml， 即 0.5%MTT） ， 继续培养 4h。 0049 5） 4h 后扣板法倒去上清， 用吸水纸轻轻拍干， 每孔加入 200l 二甲基亚砜， 置摇 床上低速振荡 10min， 使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 490nm 处测量各孔的吸光值。 6） 同时设置本底 （不加细胞， 只加培养液） ， 对照孔 （细胞、 相同浓度的药物溶解介质、 培养 液、 MTT、 二甲基亚砜） ， 每组设定 6 个复孔。 0050 7） 结果以药物对细胞的抑制率表示 ： 0051 细胞增值抑制率 （%） =（对照孔 。
25、OD 值 - 给药孔 OD 值） / 对照孔 OD 值 100%。实 验重复 3 次。 0052 3 统计处理 0053 采 用 Microsoft Excel2003 软 件 中 的 相 关 分 析 和 Student t 检 验， 数 据 以 meanS.D. 表示。 0054 4 实验结果 0055 MTT 法实验后统计结果显示， 与对照组比较， 当剂量达到 5mg/ml 时， 对 P815 细胞 增殖抑制有差异 （P0.05） ， 剂量在 10mg/ml 时该差异具有显著性 （P0.01） ， 当剂量达到 15-20mg/ml 时有极显著性差异 （P0.001） 。 0056 表 1 调经活血片对 P815 细胞增殖抑制影响研究 0057 0058 注 ： 与对照组比较， *P0.01 ； *P0.001 说 明 书 CN 102988667 A 6 5/5 页 7 0059 5 实验结论 0060 调经活血片可以抑制P815细胞增殖， 减少P815细胞的细胞生长数目， 该作用呈剂 量依赖性。 说 明 书 CN 102988667 A 7 。