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1、(10)申请公布号 CN 102988374 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102988374 A *CN102988374A* (21)申请号 201210472521.8 (22)申请日 2012.11.20 A61K 31/704(2006.01) A61K 31/4748(2006.01) A61K 47/34(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) (71)申请人 东南大学 地址 211189 江苏省南京市江宁开发区东南 大学路 2 号 (72)发明人 陈宝安 王永禄 刘苒 李学明 郭莉婷 陈卫 程坚 殷。
2、海祥 张孝平 鲍文 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 32204 代理人 柏尚春 (54) 发明名称 聚乳酸羟基乙酸 - 聚赖氨酸 - 聚乙二醇 - 汉 防己甲素和柔红霉素共聚物纳米粒及其制备和应 用 (57) 摘要 本发明公开了聚乳酸羟基乙酸 - 聚赖氨 酸 - 聚乙二醇 - 汉防己甲素和柔红霉素共聚物纳 米粒及其制备和应用， 具体步骤包括共聚物溶解 在有机溶剂 （O） 中， 形成油相聚合物， 将药物溶解 到水相 (W1) 中， 再将水相慢慢加入至油相中乳化 形成初乳 (W1/O)， 将制得初乳迅速加入至另一水 相(W2)中， 复乳化形成复乳(W1/O/W2)，。
3、 将复乳化 的纳米粒溶液中有机相挥干， 高速冷冻离心机离 心溶液， 沉淀物用水重旋， 离心， 重复操作两次， 制 得 PLGA-b-PLL-g-PEG 包载的汉防己甲素和柔红 霉素共聚物纳米粒。本发明共聚物纳米粒载体制 备方法简便， 药物装载方法适于工业化生产， 环境 污染少。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 5 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 5 页 附图 3 页 1/2 页 2 1. 一种聚乳酸羟基乙酸 - 聚赖氨酸 - 聚乙二醇 - 汉防己甲素和柔红霉素共聚物纳米 粒， 其特征在于聚乳酸羟基乙酸。
4、与聚赖氨酸连接为嵌段结构， 聚赖氨酸与聚乙二醇之间为 接枝结构， 聚乳酸羟基乙酸 - 聚赖氨酸 - 聚乙二醇聚合物的分子量为 4104-5105； 所述 纳米粒子粒径范围为 100-1000nm ； 聚乳酸羟基乙酸 - 聚赖氨酸 - 聚乙二醇聚合物包载的药 物为汉防己甲素和柔红霉素 ； 包载药物使用的方法为自乳化溶剂挥发法、 乳化溶剂挥发法、 复乳化溶剂挥发法。 2.根据权利要求1所述的聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇-汉防己甲素和柔红 霉素共聚物纳米粒， 其特征在于所述聚乳酸羟基乙酸粘度范围为 0.150.8dL/g， 其中聚乳 酸与羟基乙酸比例为 （85 50） :（15 50） ； 所。
5、述聚赖氨酸分子量范围 50020000g/mol ； 所述聚乙二醇分子量范围 10008000g/mol。 3. 一种如权利要求 1 所述的聚乳酸羟基乙酸 - 聚赖氨酸 - 聚乙二醇 - 汉防己甲素和 柔红霉素共聚物纳米粒的制备方法， 其特征在于将聚乳酸羟基乙酸 - 聚赖氨酸 - 聚乙二醇 共聚物溶解在有机溶剂 O 中， 形成油相聚合物 ； 将汉防己甲素与柔红霉素溶解到内水相 W1， 中形成水溶液， 再将该水溶液慢慢加入至油相聚合物中乳化形成初乳 W1/O， 将制得初乳 W1/ O迅速加入至外水相W2中， 复乳化形成复乳W1/O/W2纳米粒溶液， 将复乳W1/O/W2纳米粒溶液 中有机相挥干，。
6、 高速冷冻离心机离心溶液， 沉淀物用水重旋， 离心， 重复操作即可制得聚乳 酸羟基乙酸 - 聚赖氨酸 - 聚乙二醇 - 汉防己甲素和柔红霉素共聚物纳米粒。 4.根据权利要求3所述的聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇-汉防己甲素和柔红 霉素共聚物纳米粒的制备方法， 其特征在于所述的聚乳酸羟基乙酸 - 聚赖氨酸 - 聚乙二醇 共聚物浓度为 1050mg/ml， 汉防己甲素与柔红霉素的浓度为 120mg/ml。 5.根据权利要求3所述的聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇-汉防己甲素和柔红 霉素共聚物纳米粒的制备方法， 其特征在于所述的有机溶剂 O 为以下溶剂中的一种 ： 二氯 甲烷、 二氯甲烷与丙酮。
7、的混合物、 乙酸乙酯、 二氯甲烷与甲醇的混合物。 6.根据权利要求3所述的聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇-汉防己甲素和柔红 霉素共聚物纳米粒的制备方法， 其特征在于所述的水相W1为去离子水、 2%8%吐温80溶液、 0.2%0.8% 的聚乙烯醇溶液或 0.1%0.6% 的泊洛沙姆溶液中的一种。 7.根据权利要求3所述的聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇-汉防己甲素和柔红 霉素共聚物纳米粒的制备方法， 其特征在于所述的乳化形成初乳W1/O的的方法为100400W 超声、 采用 3000rpm10000rpm 高剪切机高速匀浆或 500bar1000bar 高压均制法 ； 复乳化 形成复乳 W。
8、1/O/W2纳米粒溶液中有机相挥发方式为减压旋蒸法， 条件是 0.01MPa0.07MPa， 3540 ； 或 0.3%0.6%g/ml 聚乙烯醇溶液中搅拌挥发。 8. 根据权利要求 3 所述的聚乳酸羟基乙酸 - 聚赖氨酸 - 聚乙二醇 - 汉防己甲素和柔 红霉素共聚物纳米粒的制备方法， 其特征在于所述的外水相 W2为 1%3% 的聚乙烯醇溶液 或 1%3% 的泊洛沙姆溶液 ； 内水相与外水相的比例为 1:101:30， 内水相与有机相比例为 1:21:6。 9.根据权利要求8所述的聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇-汉防己甲素和柔红 霉素共聚物纳米粒的制备方法， 其特征在于所述的聚乙烯醇醇解。
9、度为 87%89%mol/mol， 粘 度 CPS 为 4.6-5.4， 所使用的泊洛沙姆型号为泊洛沙姆 F68 或泊洛沙姆 188。 10. 一种如权利要求 1 所述的聚乳酸羟基乙酸 - 聚赖氨酸 - 聚乙二醇 - 汉防己甲素和 权 利 要 求 书 CN 102988374 A 2 2/2 页 3 柔红霉素共聚物纳米粒的应用， 其特征在于该共聚物纳米粒主要用于治疗白血病及白血病 多药耐药。 权 利 要 求 书 CN 102988374 A 3 1/5 页 4 聚乳酸羟基乙酸 - 聚赖氨酸 - 聚乙二醇 - 汉防己甲素和柔 红霉素共聚物纳米粒及其制备和应用 技术领域 0001 本发明涉及高分子。
10、材料技术领域和纳米靶向肿瘤给药领域， 具体涉及 PLGA-PLL-PEG-汉防己甲素/柔红霉素的制备， 聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇聚合 物为骨架的纳米载药系统在传递抗肿瘤药物的应用。 背景技术 0002 化疗是目前治疗癌症的主要方法， 然而化疗过程中产生的多药耐药 (multi-drug resistance,MDR)常常导致癌症化疗达不到预期效果。 肿瘤细胞一旦对某种药物产生耐受， 对其他多种化疗药物也会产生交叉耐受， 这一现象称为多药耐药。据美国癌症协会统计表 明， 肿瘤年死亡率中， 90%以上肿瘤患者的死因都与多药耐药有关。 因此， 如何逆转多药耐药 成为癌症治疗亟待解决的关键问。
11、题。 0003 长期以来， 多药耐药逆转剂的研究一直是血液病领域研究的热点问题。 现已证明， 由 MDR1 基因编码的 P- 糖蛋白 (P-gp) 过度表达是肿瘤细胞产生 MDR 的重要原因。P-gp 的 本质是一种能量依赖性药物排出泵， 可消耗细胞能量将细胞内药物泵出细胞外， 从而使细 胞内药物浓度下降， 药物作用减弱直至丧失， 最终导致 MDR 和肿瘤化疗的失败。因此， 逆转 MDR1 基因与 P-gp 过度表达成为提高化疗成功率的关键因素。 0004 目前， 针对 P-gp 过表达而开发的肿瘤耐药逆转剂主要有钙离子通道阻滞剂、 环孢 菌素类等。 这些化疗药物虽然体外可以完全或部分逆转MD。
12、R， 但其普遍存在的问题是特异性 差， 且产生逆转作用的剂量远大于其产生毒性的限制剂量， 对心血管系统、 免疫系统等有明 显的不良反应， 因而不适于应用于临床。 0005 环孢菌素 D 衍生物 （PSC-833） 由瑞士诺华公司研制， 是迄今为止国际上第一个进 入到临床随机试验的P-gp抑制剂， 但由于PSC-833临床试验未见明显耐药 逆转作用， 目前 其上市进程已被全面叫停， 意味着目前临床上 MDR 面临着无药可用的境地。因此， 继续寻找 新型低毒高效的 MDR 逆转剂依然是目前研发相关药物的主要方向。而中药及其有效成分， 由于其低毒且源自天然植物的特性， 逐渐成为 MDR 抑制剂的研发。
13、重点， 如汉防己甲素、 甲基 莲心碱和蝙蝠葛碱等陆续被证明具有逆转肿瘤多药耐药的作用。 0006 汉防己甲素 （Tet） 是植物汉防己的根中的主要活性成分， 是一种对心脏低毒性的 钙通道拮抗剂， 能够抑制 mdr1 活化从而抑制 P-gp 的过度表达， 其体外逆转 MDR 的活性是维 拉帕米的10倍， 同时具有显著的体内逆转活性， 是非常具有开发前景的第三代MDR逆转剂。 0007 汉防己甲素对人白血病耐药细胞株K562/A02具有较强的MDR逆转作用， 可以增强 柔红霉素 （DNR） 对 K562/A02 的细胞毒作用。随着汉防己甲素浓度的增加 ： K562/A02 细胞 中高表达的耐药相关。
14、的可溶性钙结合蛋白(SORCIN)基因及sorcin蛋白的表达先增强后减 弱， 显示汉防己甲素对 K562/A02 耐药逆转呈浓度依赖性， 汉防己甲素可能通过调整 SORCIN 基因及蛋白的表达参与逆转 K562/A02 的耐药性 ； p21 蛋白的表达随着 TET 浓度的增加逐渐 增强 ； mdrl 基因的表达随着汉防己甲素浓度的增加不断降低 ； P-gp 的表达随着 Tet 浓度的 说 明 书 CN 102988374 A 4 2/5 页 5 增加而逐渐减弱。汉防己甲素作用后， 可明显降低 K562/A02 细胞 NF-KB 蛋白核转位和胞核 NF-KB蛋白表达水平， 可能通过抑制NF-K。
15、B活化逆转K562/A02细胞多药耐药性。 同时， 动物 实验表明， 汉防己甲素在荷瘤鼠体内可达到良好的疗效及安全性1。 然而汉防己甲素具有 半衰期短、 有局部刺激性、 在水中溶解度低、 注射给药毒性较高的等问题， 且汉防己甲素常 规用药很难达到靶细胞， 因此开发具有长效、 低毒、 低刺激性的汉防己甲素新型载药系统势 在必行。 0008 采用高分子聚合物和天然的高分子材料装载的药物纳米载体可以有效提高抗肿 瘤效果， 目前成为国际上抗肿瘤研究关注的重点领域。纳米载体具有主要优点如下 2 ： (1) 具有较高的药物包载能力， 能够包载的药物范围较广， 可以是疏水性的药物也可以是亲 水性药物， 并且。
16、无论单方药还是复方药均可包载 ； (2) 有缓释作用， 能够延长药物的作用时 间 ； (3) 通过修饰可形成亲水端， 从而防止蛋白质的吸附， 躲避网状内皮系统的捕捉 ； (4) 粒 径小且分布窄， 易通过生理屏障， 在体内具有独特的分布特征。 纳米粒在体内的分布主要取 决于粒径的大小和表面形态， 与核内包裹的药物性质关系不大 ； (5) 可在保证药效的前提 下， 减少给药剂量， 从而 减轻或避免毒副作用。 0009 目前用于制备纳米给药系统的载体种高分子载体材料有多种， 如聚 - 羟基酸 ,、 乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、 交联聚酯、 聚氰基丙烯酸烷酯(PACA)、 天然蛋白、 壳聚糖、。
17、 明 胶等。本发明选择 PLGA-PLL-PEG 共聚物作为汉防己甲素的载体。以 PEG-PLL-PLGA 共聚物 作为药物载体的优势明显 ： (1) 能够有效减少 PLGA 被网状内皮系统的摄取， 从而增加载体 的稳定性， 延长其体循环时间 ； (2) 可以通过调节 PEG-PLL 链的长度来影响聚合物体内的降 解性和药物的释放行为， 改善药物的释放动力学特征 ； (3) 在共聚物载体上引入 PLL 可有效 增加细胞的摄取率， 提高药物疗效 ； (4)PEG-PLL 与 PLGA 共聚后可以增强聚合物的亲水性， 增强了载体对亲水性药物的装载能力。 0010 目 前 PLGA-PLL-PEG 。
18、共 聚 物 作 为 载 体 的 合 成 技 术 已 相 对 比 较 成 熟 3-5。 PLGA-PLL-PEG载体已被广发应用于多个领域， 如应用PLGA-PLL-PEG载体连接RGD蛋白作为 人造血小板用于创伤性出血的治疗 ； 应用 PLGA-PLL-PEG 包载脑原性神经因子 BDNF 用于神 经蛋白损伤的治疗 ； 应用 PLGA-PLL-PEG 载体， 采用复乳溶剂挥发法包裹 SiRNA， 用于肿瘤细 胞的基因干扰等。 0011 柔红霉素作为一种周期非特异性化疗药， 主要用于各种类型的急性白血病 （包括 粒细胞性、 淋巴细胞性和单核细胞性以及粒-单核细胞性） 、 慢性粒细胞性白血病、 恶。
19、性淋巴 瘤， 是一种非常好的抗肿瘤模型药物。 但因柔红霉素易诱发不可逆性心脏毒性， 从而限制了 它的临床应用。 而通过药物载体系统可以改变阿霉素的体内分布， 减少其毒副反应的发生。 本发明采用 PLGA-PLL-PEG 共聚物同时包载了柔红霉素与汉防己甲素， 可以考察汉防己甲 素的 MDR 逆转效果， 以期开发可用于临床的低毒高效的主动靶向耐药逆转剂。 0012 参考文献 0013 1 陈宝安 , 董颖 , 张鹏 , 程坚 , 周云 , 盛茗 , 王婷 , 高峰 . 汉防己甲素联合屈 洛昔芬逆转 K562/A02 细胞多药耐药的研究 J. 中华血液学杂志 2002;23(12):660-1. 。
20、0014 2Brannon-Peppas L,Blanchette JO.Nanoparticle and targeted systems for cancer therapy.Adv Drug Deliv Rev.2004,56(11):1649-1659. 0015 3Bertram JP,Rauch MF,Chang K,Lavik EB.Using Polymer Chemistry 说 明 书 CN 102988374 A 5 3/5 页 6 to Modulate the Delivery of Neurotrophic Factors from Degradable Micro。
21、spheres:Delivery of BDNF.Pharm Research.2010,27(1):82-91. 0016 4Zhou J,Patel TR,Fu M,Bertram JP,Saltzman WM.Octa-functional PLGA nanoparticles for targeted and efficient siRNA delivery to tumors.Biomaterials ,2012,33(2):583-591. 0017 5Bertram JP,Williams CA,Robinson R,Segal SS,Flynn NT,Lavik EB.Intr。
22、avenous Hemostat:Nanotechnology to Halt Bleeding.Sci Transl Med.2009,1(11):11-22。 发明内容 0018 技术问题 ： 本发明提供的技术方案为选用相容性好的生物可降解材料 PLGA、 PLL、 PEG 作为合成新型纳米载药系统的原料， 制备不同类型的 PEG-PLL-PLGA 聚合物， 并应用此 载体携载抗肿瘤药物柔红霉素和， 制备纳米粒， 并在末端偶联靶体， 构建一种具有主动靶向 性能的抗肿瘤药物纳米载体PEG-PLL-PLGA， 可以有效减少柔红霉素的毒性， 克服多药耐药。 0019 本发明所要解决的技术问题包括。
23、合成适宜装载药物的聚合物载体、 制备纳米粒条 件的优化及试验过程中一系列检测方法的确定。 0020 技术方案 ： 本发明所述的聚合物 PLGA-PLL-PEG 是一种较好的药物载体， 它可以通 过不同药剂学方法如溶剂扩散法、 乳化溶剂挥发法、 复乳化溶剂挥发法等， 制备得到纳米粒 或微球， 且可控制超声、 高速匀浆、 高压均质等机械条件的强弱， 从而得到不同粒径范围的 载药粒子 （1002000nm） 。制得的纳米粒表面光滑， 大小均一， 载药量及包封率高。 0021 本发明中所述载体分子量范围为 4104-5105， 其中 PLGA 为德国盈创公司 系列产品， 聚乳酸与羟基乙酸比例包括 85。
24、:15、 75:25、 65:35、 50:50。 0022 本发明所述的多聚物纳米载体包载的抗肿瘤药物为柔红霉素、 所述的中药逆转剂 为汉防己甲素。采用高效液相色谱法测定其载药量， 结果纳米粒子的载药量为 0.1%13%。 0023 本发明的聚乳酸羟基乙酸 - 聚赖氨酸 - 聚乙二醇 - 汉防己甲素和柔红霉素共聚物 纳米粒为 ： 聚乳酸羟基乙酸与聚赖氨酸连接为嵌段结构， 聚赖氨酸与聚乙二醇之间为接枝 结构， 聚乳酸羟基乙酸 - 聚赖氨酸 - 聚乙二醇聚合物的分子量为 4104-5105； 所述纳米 粒子粒径范围为 100-1000nm ； 聚乳酸羟基乙酸 - 聚赖氨酸 - 聚乙二醇聚合物包载。
25、的药物为 汉防己甲素和柔红霉素 ； 包载药物使用的方法为自乳化溶剂挥发法、 乳化溶剂挥发法、 复乳 化溶剂挥发法。 0024 所述聚乳酸羟基乙酸粘度范围为 0.150.8dL/g， 其中聚乳酸与羟基乙酸比例为 （85 50） :（15 50） ； 所述聚赖氨酸分子量范围 50020000g/mol ； 所述聚乙二醇分子量 范围 10008000g/mol。 0025 本发明聚乳酸羟基乙酸 - 聚赖氨酸 - 聚乙二醇 - 汉防己甲素和柔红霉素共聚物纳 米粒的制备方法为 ： 将聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇共聚物溶解在有机溶剂O中， 形成油相聚合物 ； 将汉防己甲素与柔红霉素溶解到内水相 W1。
26、， 中形成水溶液， 再将该水溶液 慢慢加入至油相聚合物中乳化形成初乳 W1/O， 将制得初乳 W1/O 迅速加入至外水相 W2中， 复 乳化形成复乳W1/O/W2纳米粒溶液， 将复乳W1/O/W2纳米粒溶液中有机相挥干， 高速冷冻离心 机离心溶液， 沉淀物用水重旋， 离心， 重复操作即可制得聚乳酸羟基乙酸 - 聚赖氨酸 - 聚乙 说 明 书 CN 102988374 A 6 4/5 页 7 二醇 - 汉防己甲素和柔红霉素共聚物纳米粒。 0026 所述的聚乳酸羟基乙酸 - 聚赖氨酸 - 聚乙二醇共聚物浓度为 1050mg/ml， 汉防己 甲素与柔红霉素的浓度为 120mg/ml。 0027 所述。
27、的有机溶剂 O 为以下溶剂中的一种 ： 二氯甲烷、 二氯甲烷与丙酮的混合物、 乙 酸乙酯、 二氯甲烷与甲醇的混合物。 0028 所述的水相 W1为去离子水、 2%8% 吐温 80 溶液、 0.2%0.8% 的聚乙烯醇溶液或 0.1%0.6% 的泊洛沙姆溶液中的一种。 0029 所述的乳化形成初乳 W1/O 的的方法为 100400W 超声、 采用 3000rpm 10000rpm 高剪切机高速匀浆或 500bar 1000bar 高压均制法 ； 复乳化形成复乳 W1/O/W2纳米粒溶液 中有机相挥发方式为减压旋蒸法， 条件是 0.01MPa0.07MPa， 3540； 或 0.3%0.6%g/。
28、ml 聚 乙烯醇溶液中搅拌挥发。 0030 所述的外水相 W2为 1%3% 的聚乙烯醇溶液或 1%3% 的泊洛沙姆溶液 ； 内水相与外 水相的比例为 1:101:30， 内水相与有机相比例为 1:21:6。 0031 所述的聚乙烯醇醇解度为87%89%mol/mol， 粘度CPS为4.6-5.4， 所使用的泊洛沙 姆型号为泊洛沙姆 F68 或泊洛沙姆 188。 0032 本发明聚乳酸羟基乙酸 - 聚赖氨酸 - 聚乙二醇 - 汉防己甲素和柔红霉素共聚物纳 米粒的应用于治疗白血病及白血病多药耐药。 0033 有益效果 ： 本发明所述的以 PLGA-PLL-PEG 为载体的纳米粒， 可以同时装载一种。
29、或 两种溶解性相似的抗肿瘤药物， 并可连接靶向基团如转铁蛋白单抗、 多肽、 叶酸等， 聚合物 与靶向基团之间的连接是通过共价键连接。这种纳米体系中， 由抗肿瘤药物、 逆转剂协同 发挥抗肿瘤及逆转多药耐药的作用， 而靶向基团提高了纳米粒的靶向性， 减小了毒副作用。 0034 本发明所述的 PLGA-PLL-PEG 载药纳米粒， 可以制备成冻干制剂， 提高纳米粒的稳 定性。所使用的冻干保护剂包括甘露醇、 乳糖、 蔗糖、 葡萄糖、 海藻糖等， 所用浓度 5%10%。 0035 本发明制备方法简便， 制备纳米粒所使用的方法适于工业化生产， 装载药物范围 广， 特别适于毒副作用较大的难溶性抗肿瘤药物。 。
30、附图说明 0036 图 1 是纳米粒装载药物的模式图， 0037 图 2 是聚合物载体结构及偶联抗体过程图， 0038 图 3 是制备柔红霉素纳米粒的粒径分布图 （MalvrenZetasizer 3000HS 激光粒度 仪， 横坐标为粒径， 纵坐标为响应值） ， 0039 图 4 为制备的柔红霉素与汉防己甲素纳米粒的粒径分布图 （MalvrenZetasizer 3000HS 激光粒度仪， 横坐标为粒径， 纵坐标为响应值） ， 0040 图 5 为制备的柔红霉素汉防己甲素纳米粒的外观图及透射电镜下外观图 （日立 H-7650 透射电子显微镜） ， 0041 图 6 是当流动相为水 ： 乙腈 。
31、=780:220（磷酸调至 PH2.0） 时， 柔红霉素与汉防己甲 素的液相图谱。 具体实施方式 说 明 书 CN 102988374 A 7 5/5 页 8 0042 以下均对本发明进一步说明， 但不仅限于本发明内容。 0043 实施例 1.PLGA-PLL-PEG/ 盐酸柔红霉素纳米粒的制备 0044 采用复乳化溶剂挥发法 （W/O/W） 制备， 取适量柔红霉素溶于 6% 的吐温 80 溶液中， 作为水相， 而聚合物载体溶于二氯甲烷与丙酮 (1:14:1) 的混合溶液中， 作为油相， 将水相 滴入油相中搅拌， 其中水相与油相比例为 （1:21:5） 使用超声仪超声制得初乳 （W/O） 。将。
32、初 乳迅速加入至外水相 1.5% 聚乙烯醇溶液中搅拌， 倒入高压均质机中复乳化 （W/O/W） ， 控制 一定压力及均质时间， 制得 PLGA-PLL-PEG/ 盐酸柔红霉素纳米粒， 搅拌蒸出有机溶剂， 离心 洗涤， 冷冻干燥制得冻干纳米粒制剂， 纳米粒的载药量为 1%6%， 粒径可控在 15020000nm 之 间。 0045 实施例 2.PLGA-PLL-PEG/ 汉防己甲素纳米粒的制备 0046 采用乳化挥发法制备， 将聚合物溶于二氯甲烷中， 再加入乙醇溶液制成油相 （O） ， 将汉防己甲素溶解在其中， 将其滴加入乳化剂溶液 （1.5% 聚乙烯醇或 2% 泊洛沙姆 F68） 中， 油相与。
33、水相的比例为 1:51:10， 一定功率超声形成 O/W 溶液， 室温搅拌固化， 除去有 机相， 离心洗涤， 冷冻干燥制得冻干纳米粒制剂， 纳米粒的载药量为 1%11%， 粒径可控在 10010000nm 之间。 0047 实施例 3.PLGA-PLL-PEG/ 柔红霉素 / 汉防己甲素纳米粒的制备 0048 采用复乳化溶剂挥发法 （W/O/W） 制备， 取适量柔红霉素和盐酸化汉防己甲素溶于 6% 的吐温 80 溶液中， 作为水相， 而聚合物载体溶于二氯甲烷与丙酮的混合溶液中， 作为油 相， 将水相滴入油相中搅拌， 使用超声仪超声制得初乳 （W/O） 。将初乳迅速加入至外水相 1.5% 聚乙烯。
34、醇溶液中搅拌， 倒入高压均质机中复乳化 （W/O/W） ， 控制一定压力及均质时间， 制得 PLGA-PLL-PEG/ 盐酸柔红霉素纳米粒， 搅拌蒸出有机溶剂， 离心洗涤， 冷冻干燥制得冻 干纳米粒制剂， 纳米粒的柔红霉素载药量为 1%6%， 汉防己甲素载药量为 1%10%， 粒径可控 在 15020000nm 之间。 0049 实施例 4.PLGA-PLL-PEG/ 柔红霉素 / 汉防己甲素纳米粒的制备 0050 采用溶剂扩散法制备， 将柔红霉素、 汉防己甲素与聚合物溶于丙酮 - 二氯甲烷混 合液 （1:11:3） 中形成油相， 再加入至含乳化剂 （2% 泊洛沙姆） 的水相中， 油相与水相的。
35、比 例 1:41:10， 冰浴， 使用一定频率的超声乳化后， 室温搅拌， 离心洗涤， 冷冻干燥制得冻干纳 米粒制剂， 纳米粒的载药量为 1%7%， 汉防己甲素载药量为 1%4%， 粒径可控在 15020000nm 之间。 0051 实施例 5. 转铁蛋白单抗与载药纳米粒的交联 0052 将纳米粒溶于PBS7.4溶液中， 超声30s， 与转铁蛋白单抗的PBS7.4溶液混合搅拌， 反应 3h， 反应液经过蛋白快速层析系统和 Sepharose CL-4B 柱， 除去游离转铁蛋白单抗后 制得 PLGA-PLL-PEG-antiTf 纳米粒 ； 将纳米粒溶于 PBS7.4 溶液中， 超声 30s， 加。
36、入 1-(3- 二 甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC) 与硫代琥珀酰亚胺 （S-NHS） ， 再加入转铁蛋白 抗体， 搅拌反应 35h， 反应液经过蛋白快速层析系统和 Sepharose CL-4B 柱， 除去游离抗体 后制得 PLGA-PLL-PEG-antiTf 纳米粒。 说 明 书 CN 102988374 A 8 1/3 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102988374 A 9 2/3 页 10 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102988374 A 10 3/3 页 11 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102988374 A 11 。