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1、(10)申请公布号 CN 102988537 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102988537 A *CN102988537A* (21)申请号 201210550177.X (22)申请日 2012.12.17 A61K 36/744(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (71)申请人 河北神威药业有限公司 地址 065201 河北省廊坊市三河市燕郊开发 区迎宾路 682 号 (72)发明人 刘军锋 袁静 张状年 黄留玉 李东 王雪松 姜海 (74)专利代理机构 石家庄国域专利商标事务所 有限公司 13112 代理人 白海静 (54) 发明名称 清。
2、开灵活性组分栀子提取物在制备抗多重耐 药菌的药物中的应用 (57) 摘要 本发明涉及清开灵活性组分栀子提取物对乙 酸钙不动杆菌 （Acinetobacter calcoaceticus） 、 鲍 曼 不 动 杆 菌 （Acinetobacter baumannii， A.baumannii） 、嗜 麦 芽 寡 养 窄 食 单 胞 菌 （Stenotrophomonas maltophilia） 及含 NDM-1 耐 药基因大肠杆菌 （Escherichia coli） 具有抑制作 用， 因此它可用于抑制这些细菌病并治疗和 / 或 预防这些细菌引起的疾病。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1。
3、 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 1/1 页 2 1. 栀子提取物在制备抗多重耐药菌的药物中的应用。 2. 栀子提取物在制备抗含 NDM-1 耐药基因细菌药物中的应用。 3. 栀子提取物在制备抗乙酸钙不动杆菌药物中的应用。 4. 栀子提取物在制备抗鲍曼不动杆菌药物中的应用。 5. 栀子提取物在制备抗嗜麦芽寡养窄食单胞菌药物中的应用。 6. 栀子提取物在制备抗含 NDM-1 耐药基因大肠杆菌药物中的应用。 7. 根据权利要求 1-6 中任意一项所述应用， 其特征在于， 所述栀子提取物由栀子药 材， 加水煎煮两次，。
4、 过滤， 合并滤液， 所得滤液减压浓缩， 放冷后在搅拌下加乙醇使含醇量达 60%， 冷藏， 过滤， 滤液回收乙醇， 加水稀释到相对密度为 1.05 1.2 （60） ， 过滤， 所得滤液 上大孔吸附树脂， 依次用 5 7 倍量柱体积的水、 8 10 倍量柱体积的 40% 乙醇洗脱， 收集 洗脱液， 过滤， 减压回收乙醇至无醇味， 即得。 权 利 要 求 书 CN 102988537 A 2 1/4 页 3 清开灵活性组分栀子提取物在制备抗多重耐药菌的药物中 的应用 技术领域 0001 本发明涉及栀子的一种新的医药用途， 具体地说是在栀子提取物制备抗多重耐药 菌药物中的应用。 背景技术 0002。
5、 多重耐药菌 （multiple resistant bacteria） 是指有多重耐药性的病原菌， 即一 种微生物对三类 （比如氨基糖苷类、 红霉素、 B 内酰胺类） 或三类以上抗生素同时耐药。其 中最为多见的是NDM-1、 MDR-TB、 MDR-MRSA以及常在ICU中出现的鲍曼不动杆菌和铜绿假单 胞菌。NDM-1（NewDelhimetallo-lactamase-1， 新德里金属 - 内酰胺酶） ， 又名 NDM-1 细菌， 是一种耐碳青霉烯类的酶。NDM-1 基因常由质粒携带， 但也整合在细菌的染色体上， 易于在不同的菌株间传播和扩散， NDM-1 编码的蛋白单体分子量为 28kD。
6、a， 它的序列和其他 MBL 的序列相似性很低。NDM-1 主要分布在肠杆菌科和鲍曼不动杆菌中， 携带 NDM-1 的细菌 不但包括条件致病菌， 也包括致病菌， 如常见的志贺氏菌、 霍乱、 绿脓假单胞杆菌等。 它具有 高度耐药性， 几乎可以水解临床常用的一线抗菌药物， 包括 - 内酰胺类、 碳青霉烯类、 氟 喹诺酮类、 氨基糖苷等。长期以来， 抗生素药物的滥用， 是催生多重耐药菌的重要原因。目 前， 多重耐药菌感染呈现出增长趋势， 但抗菌药物选择方案却很少， 因此重耐药菌感染已成 为全球性棘手问题。 0003 栀子 （茜草科植物栀子 Gardenia jasminoides Ellis 的干燥。
7、成熟果实） 为清热解 毒复方中药清开灵注射液的主要原料药， 具有护肝、 利胆、 降压、 镇静、 止血、 消肿等作用， 在 中医临床常用于治疗黄疸型肝炎、 扭挫伤、 高血压、 糖尿病等症， 并且具有良好的效果。 开发 和研究栀子更多更好的医药功效， 是许多中医药学领域的重要研究课题之一。 发明内容 0004 本发明的目的就是要开发栀子提取物的新医药用途， 同时为临床提供一种可有效 拮抗多重耐药菌的药物。 0005 本发明的发明人经长期研究发现栀子提取物对含 NDM-1 耐药基因细菌具有显著 地抑制作用， 且与药物浓度成正比， 从而发明了栀子提取物的一种新的医药用途， 即完成了 栀子提取物在制备抗。
8、多重耐药菌药物中的应用。 0006 本发明所述的栀子提取物可按照常规的中药提取方法进行。 0007 本发明在此提供的方法如下 ： 0008 （1） 取栀子适量， 加水煎煮两次， ， 过滤， 合并两次滤液 ； 0009 （2） 所得滤液减压浓缩， 放冷后在搅拌下加乙醇使含醇量达 60%， 冷藏， 过滤， 滤液 回收乙醇， 加水稀释， 过滤 ； 0010 （3） 将所得滤液上大孔吸附树脂， 依次用水、 乙醇洗脱， 收集洗脱液， 过滤， 减压回 收乙醇至无醇味， 得栀子提取物， 冷藏。 说 明 书 CN 102988537 A 3 2/4 页 4 0011 其中， 步骤 （1） 中， 加水煎煮， 第。
9、一次加 8 倍量的水， 煮沸 2 小时， 第二次加 6 倍量 的水， 煮沸 1 小时 ； 步骤 （2） 中， 加水稀释至相对密度 1.05 1.2（60） ； 步骤 （3） 中， 洗脱 剂水用量是 5 7 倍量柱体积、 乙醇是 8 10 倍量柱体积的 40% 乙醇。 0012 本发明所述栀子提取物， 可按照现有技术所述方法制备成颗粒、 冲剂、 射剂、 胶囊 等药物制剂。 0013 本发明中所述的多重耐药菌是指含有 NMD-1 基因的多重耐药菌， 包括乙酸钙不 动 杆 菌 （Acinetobacter calcoaceticus） 、 鲍 曼 不 动 杆 菌 （Acinetobacter bau。
10、mannii， A.baumannii） 、 嗜麦芽寡养窄食单胞菌 （Stenotrophomonas maltophilia） 或含 NDM-1 耐药 基因大肠杆菌 （Escherichia coli） 。 0014 上述含 NDM-1 耐药基因检测菌株为革兰氏阴性菌， 具有较强的致病性和抗生素耐 药性。其中， 乙酸钙不动杆菌和鲍曼不动杆菌可引起肺部感染、 伤口及皮肤感染、 泌尿生殖 系统感染、 菌血症菌血症、 脑膜炎等， 麦芽寡养窄食单胞菌能引起严重的呼吸系统感染等， 含 NDM-1 耐药基因大肠杆菌可引发对肠道感染且对抗生素具有抗药性。 0015 更进一步地， 本发明还提供了栀子提取物在。
11、制备抗乙酸钙不动杆菌药物中的应 用， 即栀子提取物在制备治疗和 / 或预防乙酸钙不动杆菌引起的疾病的药物中的应用。 0016 更进一步地， 本发明还提供了栀子提取物在制备抗鲍曼不动杆菌药物中的应用， 即栀子提取物在制备治疗和 / 或预防鲍曼不动杆菌引起的疾病的药物中的应用。 0017 更进一步地， 本发明还提供了栀子提取物在制备抗嗜麦芽寡养窄食单胞菌药物中 的应用， 即栀子提取物在制备治疗和 / 或预防嗜麦芽寡养窄食单胞菌引起的疾病的药物中 的应用。 0018 更进一步地， 本发明还提供了栀子提取物在制备抗含 NDM-1 耐药基因细菌药物中 的应用。 0019 更进一步地， 本发明还提供了栀子。
12、提取物在制备抗含 NDM-1 耐药基因大肠杆菌药 物中的应用， 即栀子提取物在制备治疗和 / 或预防含 NDM-1 耐药基因大肠杆菌引起的疾病 的药物中的应用。 0020 本发明所述栀子制剂可用于治疗上述由含 NDM-1 耐药基因多重耐药细菌引发的 疾病， 如含 NDM-1 耐药基因多重耐药细菌引发的肠道感染、 呼吸系统感染、 伤口及皮肤感 染、 泌尿生殖系统感染、 菌血症菌血症、 脑膜炎等， 尤其是适用于治疗由乙酸钙不动杆菌、 鲍 曼不动杆菌、 嗜麦芽寡养窄食单胞菌或含 NDM-1 耐药基因大肠杆菌引发的疾病。 0021 本发明所述药物制剂在作为本发明的用途使用时， 其具体用量时可根据临床实。
13、验 以及患者的具体情况确定。 具体实施方案 0022 以下通过实施例和试验例来进一步阐述本发明所述药物的有益效果。 0023 实施例 1 0024 栀子提取物的制备方法 0025 （1） 取栀子适量， 加水煎煮两次， 第一次加 8 倍量的水， 煮沸 2 小时， 第二次加 6 倍 量的水， 煮沸 1 小时， 过滤， 合并两次滤液 ；（2） 所得滤液减压浓缩至原药材量 1.5 2 倍体 积时， 放冷后在搅拌下加乙醇使含醇量达 60%， 冷藏， 过滤， 滤液回收乙醇， 加水稀释到相对 说 明 书 CN 102988537 A 4 3/4 页 5 密度为 1.05 1.2 （60） ， 过滤 ；（3）。
14、 将所得滤液上大孔吸附树脂， 依次用 5 7 倍量柱体 积的水、 8 10 倍量柱体积的 40% 乙醇洗脱， 收集洗脱液， 过滤， 减压回收乙醇至无醇味， 得 栀子提取物， 冷藏。 0026 药效学试验 0027 试验例 1 0028 栀子提取物对含 NDM-1 耐药基因细菌的抑菌效果研究 0029 本 药 效 学 试 验 所 采 用 的 检 测 菌 株 ： 乙 酸 钙 不 动 杆 菌 （Acinetobacter calcoaceticus， A.calcoaceticus） 、鲍 曼 不 动 杆 菌 （Acinetobacter baumannii， A.baumannii） 和 嗜 麦 。
15、芽 寡 养 窄 食 单 胞 菌 （Stenotrophomonas maltophilia， S.maltophilia） ， 均含有 blaNDM-1 耐药基因 ； pGEX-4T-NDM1-DH5 是含 NDM-1 重组质粒 的大肠杆菌 （Escherichia coli， E.coli） ； pGEX-4T-NDM-1-BL21（在大肠杆菌 BL21 中表达 NDM-1） 是含 NDM-1 重组质粒的大肠杆菌 （Escherichia coli， E.coli） ， 其质粒上带有 GST 标签。上述菌株均由中国人民解放军疾病预防控制所提供。 0030 配制 LB 琼脂培养基， 高压冷却至。
16、 60时， 取栀子提取物， 按 1:9 （药物 ： LB， V/V） 比 例配制不同浓度药物 （0.1g/ml、 0.2g/ml、 0.3g/ml） 平板， 琼脂厚度 3-4mm， 制备药物平板， 备用。 0031 研究栀子对含 NDM-1 耐药基因细菌进行抑菌实验 ： 0032 将4株含NDM-1基因耐药菌株乙酸钙不动杆菌、 鲍曼不动杆菌、 嗜麦芽寡养窄食单 胞菌及大肠杆菌 pGEX-4T-NDM1-DH5 分别接种于含 16g/ml 亚胺培南的 LB 液体培养基 中， 37、 200rpm培养过夜， 次日菌液用无菌PBS缓冲液稀释10倍后， 分别吸取2l接种于 药物琼脂平板表面或采用划线法。
17、接种， 平板置于 37孵育 24h 左右， 观察各菌株生长状况， 得栀子提取物的抑菌性测定结果， 见表 1。 0033 采用琼脂稀释法对栀子提取物的最小抑菌浓度 （MIC） 进行测定， 将耐药菌株接种 于不同药物浓度的琼脂平板上， 37孵育 24h 左右， 观察各菌株生长状况， 抑制菌株不能生 长的最小药物浓度 （MIC 值） 分别为乙酸钙不动杆菌 0.3g/ml、 鲍曼不动杆菌 0.3g/ml、 嗜麦 芽寡养窄食单胞菌 0.2g/ml、 pGEX-4T-NDM-1-BL21 0.3g/ml。 0034 实验结果表明 ： 栀子对耐药菌株均有抑制作用， 随着药物浓度的增加， 抑制作用明 显增强， 说明栀子对含 NDM-1 耐药基因耐药菌都有抑制作用， 且抑菌效果明显 ； 药物对不同 检测菌株的抗菌能力不同， MIC 也有所差异， 具有较强的广谱抗含 NDM-1 耐药基因耐药菌的 能力。 0035 表 1 栀子提取物浓度对菌株的影响 0036 说 明 书 CN 102988537 A 5 4/4 页 6 0037 注 ： + 表示不抑制生长， + 表示抑制不明显， + 表示明显抑制， - 表示完全抑制， 不生长。 说 明 书 CN 102988537 A 6 。