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1、(10)申请公布号 CN 102988469 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102988469 A *CN102988469A* (21)申请号 201210519834.4 (22)申请日 2012.12.06 A61K 36/484(2006.01) A61P 31/16(2006.01) (71)申请人 上海中医药大学 地址 201203 上海市浦东新区蔡伦路 1200 号 (72)发明人 李玉虎 李利丹 蒋美娟 张琳琳 (54) 发明名称 一种防治流感病毒感染的中药组合物及其制 备方法和用途 (57) 摘要 本发明涉及一种用于防治流感病毒感染的中 药组合物及其制备。
2、方法。 该中药组合物由炙紫菀、 马齿苋、 甘草组成， 其比例为炙紫菀 10g、 马齿苋 10g、 甘草 5.0g。所述的中药组合物可用于防治流 感病毒的感染。该中药组合物一方面可用于治疗 流感、 也可用于提高患者对流感病毒的抵抗力。 优 选处于感染初期的患者和可能感染的人群进行预 防。可作为药物在患流感的初期服用。可作为保 健品用于提高对流感病毒的抵抗力。也可以将该 中药组合物的乙醇提取液制备成药物性口罩和滴 鼻液， 用于预防流感病毒的感染。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 。
3、页 1/1 页 2 1. 一种用于预治流感病毒感染的中药组合物， 其特征在于， 所述的中药组合物由由炙 紫菀、 马齿苋、 甘草组成， 其比例为炙紫菀 10g、 马齿苋 10g、 甘草 5.0g。 2. 根据权利要求 1 所述的用于防治流感病毒感染的中药组合物的制备方法， 其特征在 于 ： 按比例称取原料， 浸泡、 水煎煮二次并滤过、 滤液合并浓缩、 加入无水食用酒精、 滤过、 滤 液蒸馏、 加蒸馏水定容至 1g 生药 /ml。 3. 根据权利要求 2 所述的用于防治流感病毒感染的中药组合物的制备方法， 其特征在 于， 按照如下步骤制备而得 ： 按比例称炙紫菀100g、 马齿苋100g、 甘草5。
4、0g。 在蒸馏水中浸泡 30min， 并加入 1000ml 左右蒸馏水 ( 液面浸没中药饮片 2-3cm) 武火煮沸， 待其沸腾后文火 慢煎 30min， 将药液用三层纱布过滤， 得滤液 500ml 左右 ； 再向生药中继续加入蒸馏水至药 材表面再次进行煮沸， 得滤液 500ml 左右， 将两次滤液合并后浓缩至 300-500ml， 并将其放 入 4冰箱冷却， 待其完全冷却后向浓缩液中加入无水食用酒精 1000-1200ml， 静置过夜， 次日纱布过滤， 并将滤液蒸馏， 得无食用酒精的药液， 滤液用蒸馏水定容至 350ml， 最后浓度 为 1g 生药 /ml， 分装， 消毒， 低温冷藏， 备用。
5、。 4. 根据权利要求 1 所述的中药组合物在制备防治流感病毒的药物或医药用品中的用 途。 5. 根据权利要求 4 所述的药物， 其特征是该组合物制备成汤剂口服， 用于流感病毒感 染的治疗。 6. 根据权利要求 4 所述的药物， 其特征是该组合物制备成滴鼻液， 浓度为 1g 生药 /ml， 小并分装， 消毒后备用， 每鼻孔滴 1-2 滴， 用于预防流感病毒的感染。 7. 根据权利要求 4 所述的医药用品， 其特征是该组合物制备成药物性口罩外用， 用于 预防流感病毒的感染。 权 利 要 求 书 CN 102988469 A 2 1/8 页 3 一种防治流感病毒感染的中药组合物及其制备方法和用途 。
6、技术领域 0001 本发明涉及一种中药组合物， 以及该中药组合物的提取、 制备和用途， 属于医药保 健品领域。 背景技术 0002 流行性感冒 ( 简称流感 ) 是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病， 它严重危 害了人类的健康甚至生命。 全球每年约有1520的人被流感病毒感染， 直接或间接导致 每年在世界范围内约 50 万人死亡。自 1918 年流感病毒在世界范围大流行造成 2000 万人 死亡以来， 如何获得有效的药物来控制流感的感染， 是各国科学家的一个重要课题。 0003 流感病毒感染机体的过程 ： 流感病毒通过吸附侵入脱壳复制装配释放 等步骤进入机体繁殖而感染人体， 使大量呼吸道纤毛。
7、上皮细胞受感染、 变性、 坏死和脱落 ； 流感病毒感染呼吸道上皮后， 可以迅速形成子代病毒扩散并感染周边细胞， 引起周边细胞 的空泡变性， 致使感染者出现头疼、 鼻塞、 流鼻涕、 浑身酸软无力、 咳嗽、 发热等症状。 0004 流感病毒属正粘科病毒， 是一类对粘蛋白具有特殊亲和性的 RNA 病毒。流感病毒 的感染主要依赖包膜上的血凝素 (Hemagglutinin， H) 和神经氨酸酶 (Neuramindase， N)。 血凝素是由 3 条糖基化多肽分子以非共价形式聚合而成的三聚体， 经蛋白酶裂解后具感染 性。HA1 与上皮细胞表面的唾液酸受体结合， HA2 疏水区有膜融合活性， 对病毒侵入。
8、宿主细 胞是必须的。神经氨酸酶是由 4 条相同的糖基化多肽所组成的蘑菇状四聚体， 具有酶活性， 可水解宿主细胞表面糖蛋白末端的 N- 乙酰神经氨酸， 有利于成熟病毒的释放。 0005 参与抗流感病毒感染的固有免疫机制主要有两种， 一种为流感病毒感染后直接刺 激感染的宿主细胞产生 IFN-， IFN- 能够抑制病毒在宿主细胞内复制 ； 另一种为 NK 细 胞对流感病毒感染细胞的直接杀灭作用 ； 感染流感病毒可刺激机体产生相应免疫应答， 从 而使各种细胞因子分泌增多， 机体产生的致炎细胞因子主要包括 IL-1、 IL-2、 IL-6、 TNF-、 IFN- 等 ； 粒性白细胞， 单核细胞和淋巴细胞。
9、受流感病毒刺激后使 IL-6 含量提高， IL-6 是 一种多功能细胞因子， 可调节免疫应答以及与炎症反应有关的 T 细胞的激活、 生长和分化， 并能促进 T 细胞介导的炎症反应。 0006 中医中药作为传统医学历史悠久， 其在重大疫病上表现出的显著疗效目前越来越 被受关注。流感病毒引发的呼吸道感染属于传统医学时行感冒和风温的范畴， 它的中医治 疗包括直接抗病毒作用以及阻断病毒对正常细胞的吸附、 穿入、 复制等而达到抗病毒的作 用， 直接抗病毒作用主要是指中药对病毒的直接杀灭， 具有直接抗病毒作用的单味中药大 多数为清热解毒类药物， 如金银花、 连翘、 板蓝根等。中药也可通过抑制流感病毒感染的。
10、宿 主细胞的凋亡， 而减轻免疫损伤， 保持呼吸道粘膜的完整性， 发挥对机体保护作用。 因此， 开 发出一些对流感具有广泛预防和治疗作用的药物已经成为必然。 0007 本发明的设计人多年从事药物抗流感病毒的研究。根据我们的经验。流感病毒感 染的关键是流感病毒包膜上的血凝素， 流感病毒依靠血凝素与宿主细胞受体结合， 从而进 入宿主细胞， 进行病毒复制， 造成病变。 本试验使用的中药组合物主要针对性流感病毒包膜 说 明 书 CN 102988469 A 3 2/8 页 4 上的血凝素， 中药组合物与血凝素接触后， 结合血凝素， 使血凝素失去与宿主细胞受体感染 的能力， 从而达到终止流感病毒感染。 查。
11、阅已有的文献， 中药组合物中炙紫菀、 马齿苋、 甘草 无特别的毒性， 小剂量无毒性， 对身体不产生危害。 发明内容 0008 1、 本发明提供一种预防流感病毒感染的中药组合物。该中药组合物由炙紫菀 10.0g、 马齿苋 1.0g、 甘草 5.0g 组成。 0009 2、 本发明进一步提供了该中药组合物的制备方法 ： 按比例称取原料， 浸泡、 水煎煮 二次并滤过、 滤液合并浓缩、 加入无水食用酒精、 滤过、 滤液蒸馏、 加蒸馏水定容至 1g 生药 / ml。 0010 3、 进一步地， 该制备方法为 ： 按比例称炙紫菀 100g、 马齿苋 100g、 甘草 50.0g。 在蒸馏水中浸泡 30mi。
12、n， 并加入 1000ml 左右蒸馏水 ( 液面浸没中药饮片 2-3cm) 武火煮 沸， 待其沸腾后文火慢煎 30min， 将药液用三层纱布过滤， 得滤液 500ml 左右 ； 再向生药中 继续加入蒸馏水至药材表面再次进行煮沸， 得滤液 500ml 左右， 将两次滤液合并后浓缩 至 300-500ml， 并将其放入 4冰箱冷却， 待其完全冷却后向浓缩液中加入无水食用酒精 1000-1200ml， 静置过夜， 次日纱布过滤， 并将滤液蒸馏， 得无食用酒精的药液， 滤液用蒸馏 水定容至 350ml， 最后浓度为 1g 生药 /ml， 分装， 消毒， 低温冷藏， 备用。 0011 最后药液三种用处 。
13、： 0012 (1) 口服， 用于流感病毒的治疗和提高机体对流感病毒的抵抗力。 0013 (2) 制备成药物性口罩 ： 将 28 层医用纱布口罩分别浸没于中药提取液原液中， 1h 后将口罩取出拧干药液并分别将其放入烘箱中， 60 -80烘干 (24h)， 在表面再覆盖一层 无药物的纱布， 备用， ( 要求无菌操作 )， 用于预防流感病毒的感染。 0014 (3) 制备成滴鼻液， 浓度 1g 生药 /ml， 小并分装， 消毒后备用， 每鼻孔滴 1-2 滴， 用 于预防流感病毒的感染。 0015 本发明的原料中， 马齿苋为马齿苋科植物马齿苋的全草 ； 紫菀为菊科植物紫菀的 根及根茎 ； 甘草为豆科。
14、植物甘草、 胀果甘草、 光果甘草的根及根茎。 0016 4、 本发明的优点 ： 0017 (1)本发明安全无毒、 价廉， 具有实用性。 该组合物的成分均为临床常用的中草药， 用量大， 药物本身毒性小， 对身体不产生危害。 0018 (2) 本发明预防流感病毒感染的功能可靠。本发明通过该中药组合物抗流感病毒 的体内、 外实验研究。结果表明中药组合物能使流感病毒液 ( 或 HA) 失去感染的活性、 抑制 其病毒复制、 增强机体抵抗力。 0019 (3) 本发明适用人群广泛。在流感流行季节， 对于流感患者服用本中药组合物， 可 作为治疗、 对于一般人群可作为保健品用于提高对流感的抵抗力。中药组合物制。
15、备成的药 物性口罩和滴鼻液可用于预防流感病毒感染， 减少患流感的机会。 具体实施方式 0020 1、 中药组合物组成 ： 炙紫菀、 马齿苋、 甘草。 0021 2、 中药组合物各中药比例 ： 炙紫菀 10g、 马齿苋 10g、 甘草 5.0g 说 明 书 CN 102988469 A 4 3/8 页 5 0022 3、 中药组合物的提取 ： 按比例称取炙紫菀 100g、 马齿苋 100g、 甘草 50.0g。在蒸馏 水中浸泡 30min， 并加入 1000ml 左右蒸馏水 ( 液面浸没中药饮片 2-3cm) 武火煮沸， 待其沸 腾后文火慢煎 30min， 将药液用三层纱布过滤， 得滤液 500。
16、ml 左右 ； 再向生药中继续加入蒸 馏水至药材表面再次进行煮沸， 得滤液 500ml 左右， 将两次滤液合并后浓缩至 300-500ml， 并将其放入 4冰箱冷却， 待其完全冷却后向浓缩液中加入无水食用酒精 1000-1200ml， 静 置过夜， 次日纱布过滤， 并将滤液蒸馏， 得无食用酒精的药液， 滤液用蒸馏水定容至 350ml， 最后浓度为 1g 生药 /ml， 分装， 消毒， 低温冷藏， 备用。 0023 效果实施例 1 0024 该中药组合物抗流感病毒血凝素 (HA) 的体外实验研究 0025 本实验使用的 HA 为流感病毒裂解液， 由上海生物制品研究所生产， 其成分为 ： 含 甲 。
17、1 型、 甲 3 型和乙型流行性感冒病毒株血凝素。加入中药后， 药物组的血凝效价与流感病 毒裂解液组的血凝效价比较， 如果血凝效价降低， 则表明药物具有抑制 HA( 破坏 HA 或吸附 HA) 的作用 ； 如果药物组不出现血凝效价降低或者改变， 则表明药物对流感病毒 HA 无抑制 作用。通过红细胞凝集反应效价的改变来判断药物的有效程度， 滴定流感病毒裂解液的血 凝效价， 便可大致估计流感病毒裂解液 HA 完整性的数量。 0026 操作步骤 ： 0027 1、 药物对倍稀释 ： 在 96 孔板第 2-8 孔加入生理盐水 0.05ml， 于第 1-2 孔加入药物 0.05ml， 第 2 孔混匀， 。
18、取 0.05ml 加入第 3 孔， 如此对倍稀释， 则药物浓度为原液、 2-1、 2-2、 2-3、 2-4、 2-5、 2-6、 2-7。 0028 2、 流感病毒裂解液的稀释 ： 在体外将流感病毒裂解液稀释， 病毒裂解液的凝集效 价为2-8， 实验时， 用2-7浓度的病毒裂解液进行血凝试验， 每孔加入浓度为2-7的病毒裂解液 0.05ml。 0029 3、 加 0.5 RBC 悬液 ： 每孔加入 0.5 RBC 悬液 0.05ml， 室温条件下作用 2 小时， 对药物作出效果判断。 0030 分别做红细胞对照组， 药物对照组和病毒对照组， 在对照组正常的条件下， 对药物 作出疗效判断。 0。
19、031 4、 结果 0032 中药与流感病毒裂解液血凝试验结果 0033 0034 + 表示流感病毒包膜上的 HA 与鸡红细胞膜上的特异性受体结合， 从而出现红细胞 说 明 书 CN 102988469 A 5 4/8 页 6 凝集， 即血凝试验阳性。( 阳性说明药物在该浓度下对流感病毒无效。) 0035 - 表示流感病毒包膜上的 HA 未与鸡红细胞上的特异性受体结合， 未出现红细胞凝 集， 即血凝试验阴性。( 阴性说明药物在该浓度下对流感病毒具有抑制作用 ) 0036 中药组合物作用不同时间后血凝试验的试验结果 0037 0038 说明药物抑制流感病毒与接触流感病毒 HA 的时间没有关系， 。
20、也即中药组合物做 成药物性口罩过滤后抑制流感病毒从 0min-1h 的效果一样。 0039 5、 分析当中药组合物 1 64 稀释 (31.25mg/ml) 时使 HA 失去凝血功能。说明中 药组合物在 31.25mg/ml 浓度下可以抑制 HA 的活性， 并且与接触的时间无关。 0040 效果实施例 2 0041 该中药组合物抗流感病毒的体外实验研究 0042 1、 操作步骤用血凝效价为 2-8的流感病毒液通过药物性口罩， 收集药物性口罩滤 液进行血凝试验， 实验方法同上， 设空白生理盐水对照组和流感病毒液对照组。 0043 2、 结果 0044 口罩滤液血凝试验结果 0045 0046 +。
21、 表示流感病毒包膜上的 HA 与鸡红细胞膜上的特异性受体结合， 从而出现红细胞 凝集， 即血凝试验阳性。 (阳性说明滤液在该浓度下有流感病毒与RBC结合形成血凝试验阳 性 ) 0047 - 表示无流感病毒包膜上的 HA 与鸡红细胞上的特异性受体结合， 未出现红细胞凝 集， 即血凝试验阴性。 (阴性说明滤液在该浓度下流感病毒HA失去了活性， 即药物具有抑制 流感病毒的作用。) 说 明 书 CN 102988469 A 6 5/8 页 7 0048 3、 分析 ： 医用空白口罩过滤的流感病毒的血凝效价为 2-8。药物性口罩过滤的流感 病毒的血凝效价从 2-8降低到 2-4， 可结合红细胞受体的 H。
22、A 完整性的数量减少了 8 倍。说明 中药组合物药物性口罩能够与流感病毒的血凝素结构作用， 较好地抑制流感病毒的活性。 0049 效果实施例 3 0050 该中药组合物抗流感病毒的鸡胚实验研究 0051 流感病毒可在鸡胚绒毛尿囊膜细胞增殖， 增殖后的流感病毒可以释放到尿囊液 中， 在一定条件下能使某些动物或人红细胞发生肉眼可见的血凝现象， 如在感染流感病毒 鸡胚内注入药物后， 尿囊液不出现血凝现象， 则表示药物具有抗病毒作用。 通过红细胞凝集 反应效价的改变来判断药物的有效程度， 从而筛选出对流感病毒 HA 有抑制作用的药物， 滴 定流感病毒的血凝效价， 便可大致估计流感病毒的数量。 0052。
23、 1、 药物对鸡胚的毒性测定 ： 测定实验用药物对鸡胚的影响， 结果， 72 小时后鸡胚 全部存活， 说明药物对鸡胚无急性毒性作用。 0053 2、 病毒 EID50的测定 ： 计算并查反对数表得鸡胚半数感染剂量 (EID50) 为 10-5.84/0.1ml， 即 10-5.84查反对数表得病毒液应稀释 140000 倍。 0054 3、 药物抑制流感病毒的鸡胚实验 0055 (1) 实验一 0056 分组 ： 选择 10 日龄活鸡胚， 随机分为药物组、 生理盐水对照组、 正常鸡胚对照组。 加入药物 ： 除正常鸡胚对照组不作任何处理外， 其余各组按下列方法处理 ： 药物组 ： 先经尿 囊腔感。
24、染病毒 20ul(20EID50)， 置鸡胚于 37温箱 60 分钟， 然后取出， 每胚尿囊腔再注射药 物 20ul。生理盐水对照组 ： 于尿囊腔注入生理盐水 20ul， 置胚于 37温箱。病毒对照组 ： 先于尿囊腔感染病毒液20ul(20EID50)， 置胚于37温箱60分钟后， 取出于尿囊腔注入生理 盐水 20ul。培养 ： 以上鸡胚注射完毕后， 均用溶化石腊封闭注射孔， 置 37温箱培养。每日 在捡卵灯下逐个观察 2 次， 24 小时内死亡者弃去， 至 48 小时， 将存活的鸡胚移至 4冰箱过 夜， 次日分别收获尿囊液。血凝试验检测 ： 用 0.5鸡红细胞进行红细胞凝集试验。 0057 。
25、(2) 实验二 0058 用1000EID50(即1000倍的EID50病毒剂量)过滤药物性口罩， 滤液接种于鸡胚， 测 定 EID50， 判断药物性口罩杀灭流感病毒的效果。 0059 (3) 实验三 0060 用血凝效价为 2-12的流感病毒液通过药物性口罩， 收集滤液， 虑液接种鸡胚， 48h 后取尿囊液做血凝试验， 判断虑液中流感病毒的复制情况。 0061 4、 结果及分析 0062 实验一、 中药组合物鸡胚内抗流感病毒 H1N1 株的血凝实验结果 说 明 书 CN 102988469 A 7 6/8 页 8 0063 0064 + 表示流感病毒包膜上的 HA 与鸡红细胞膜上的特异性受体。
26、结合， 从而出现红细胞 凝集， 即血凝试验阳性。( 阳性说明在该尿囊液稀释度下有流感病毒 HA 与鸡红细胞膜上的 特异性受体结合， 从而出现红细胞凝集 ) 0065 - 表示无流感病毒包膜上的 HA 与鸡红细胞上的特异性受体结合， 未出现红细胞凝 集， 即血凝试验阴性。( 阴性明在该尿囊液稀释度下无流感病毒 HA 与鸡红细胞膜上的特异 性受体结合， 从而不出现红细胞凝集 ) 0066 分析 ： 流感病毒尿囊液的血凝效价为 2-7， 炙紫菀、 马齿苋、 甘草组合物使流感病毒 血凝效价从 2-7降为 2-4， 使流感病毒的复制大为减少， 其数量减少了 64 倍， 说明中药组合物 在鸡胚内能较好地抑。
27、制流感病毒的复制。 0067 实验二、 药物性口罩虑液接种鸡胚 EID50的实验结果 0068 0069 分析 ： 通过药物性口罩的滤液接种至鸡胚的 EID50为 10-2.25/0.1ml， 通过空白口罩 的滤液接种至鸡胚的 EID50为 10-5.84/0.1ml， 药物组的 EID50减少了 3900 倍， 说明药物性口 罩滤液中的流感病毒数量大量减少， 存活的流感病毒数量为空白口罩滤液 1/3900。说明药 物性口罩能有效地使流感病毒失去活性。 0070 实验三、 药物性口罩虑液接种鸡胚血凝的实验结果 0071 0072 分析 ： 用血凝效价为 2-12的流感病毒液通过空白口罩， 滤液。
28、接种至鸡胚， 血凝效价 从 2-12 213， 几乎没什么变化。用血凝效价为 2-12的流感病毒液通过药物性口罩， 滤液接种 至鸡胚， 其血凝效价从 2-12减少至 26， 流感病毒的数量减少了 64 倍。说明药物性口罩能有 效地使流感病毒失去活性。 说 明 书 CN 102988469 A 8 7/8 页 9 0073 效果实施例 4 0074 该中药组合物作用于 H1N1 感染的 MDCK 细胞实验研究 0075 本研究采用流感病毒H1N1感染后MDCK细胞模型， 通过药物组、 正常细胞组和流感 病毒 H1N1 组细胞增殖的改变和药物作用于流感病毒 H1N1 感染 MDCK 细胞后， 上清。
29、中 IL-2、 IL-6、 TNF-、 IFN- 含量的变化， 对中药组合物是否增强机体抵抗流感病毒免疫力做出判 断， 同时通过对该上清液进行血凝试验， 滴定流感病毒的血凝效价， 大致估计流感病毒的数 量。 0076 1、 MDCK 细胞的培养 ： MDCK 细胞是贴壁细胞， 采用 0.25胰酶 +EDTA 消化传代。 将已长满单层的 MDCK 细胞吸去原培养基后， 以 D-Hanks 液洗一遍， 加入 3ml 0.25胰酶 +EDTA， 显微镜下控制消化时间， 待细胞收缩变圆将近脱落时， 倾去胰酶， 加入新鲜培养基， 轻轻吹落细胞， 低速离心机 1000 转 5 分钟离心， 倾去上清并加入新。
30、鲜培养液使其重新悬浮 后分装。37， 5 CO2培养箱内培养 24 小时。 0077 2、 药物对细胞的毒性作用 ： 将细胞按 2105个 / 孔加入到 24 孔板中， 37、 5 CO2 培养箱中培养 18h。用不含血清的培养液将中药对倍稀释不同梯度 1/2， 1/22， 1/23， 1/24， 1/25， 1/26， 1/27， 并将稀释好的中药分别加入 24 孔板， 20ul/ 孔， 最后每孔分别加 10 血清培养液至 1mL/ 孔， 各组设复孔， 37、 5 CO2 培养箱内培养 18h， 观察细胞病变情况。 实验设立空白对照组。结果显示 ： MDCK 细胞并没有被加入的中药提取液破坏。
31、从而产生细胞 病变 (CPE)， 这说明实验所用中药乙醇提取液的浓度对 MDCK 细胞无毒性。 0078 3、 流感病毒 TCID50将细胞按 2105个 / 孔加入到 24 孔板中， 37、 5 CO2 培养 箱中培养 18h。弃去原培养液， 并用 D-Hanks 液清洗细胞 2 遍， 再用不含血清的培养液将流 感病毒 H1N1 对倍稀释不同梯度 1/2， 1/22， 1/23， 1/24， 1/25， 1/26， 1/27， 并将稀释的流感病毒 H1N1分别加入24孔板， 20ul/孔， ， 最后每孔分别加10血清培养液至1ml/孔， 每个浓度设 3 个复孔， 37、 5 CO2 培养箱内。
32、培养 18h， 观察细胞病变情况。实验设立空白对照组。 0079 本实验用 Reed-Muench 氏法计算流感病毒 H1N1 引起的 TCID50， 由上述， 50 MDCK 细胞病变浓度在 10-4-10-5之间， 计算得 MDCK 细胞中的 TCID50为 10-4.333/0.1ml， 所以病毒液 应稀释 27800 倍， 实验时， 病毒液浓度为 20TCID50， 即病毒液应稀释 1350 倍。 0080 4、 上清液的收集 MDCK 细胞长满培养培养瓶壁后， 加入稀释好的流感病毒 H1N1( 病 毒液浓度为 20TCID50)， 培养 2h 后吸走原来培养液， 加入药液， ( 药物。
33、对倍稀释 1/2， 1/22， 1/23， 1/24， 1/25， 1/26)， 最后每孔分别加 2血清维持液至 1ml/ 孔， 37、 5 CO2 培养箱中 培养 24h 后收集上清。 0081 5、 ELISA 试剂盒检测 IL-6、 IL-2、 IFN- 和 TNF- 的含量 0082 收集上清， 按说明书操作。 0083 6、 血凝试验 ： 对收集的细胞上清液进行红细胞凝集试验， 试验方法同上。 0084 7、 结果及分析 0085 中药作用于 H1N1 感染的 MDCK 细胞后细胞因子的影响 0086 说 明 书 CN 102988469 A 9 8/8 页 10 0087 分析 ：。
34、 炙紫菀、 马齿苋、 甘草组合物 TNF- 与病毒对照组比较 (p 0.05)， 说明能 显著降低 TNF- 含量， 抑制流感病毒感染的宿主细胞的凋亡， 从而减轻免疫损伤 ； 炙紫菀、 马齿苋、 甘草组合物与病毒对照组 IFN- 含量相比 (P 0.05)， 说明炙紫菀、 马齿苋、 甘草 组合物可以促进 IFN- 的分泌， 加速外渗血液中单核细胞及 I 型辅助性 T 细胞 (Th1) 的免 疫应答， 从而使各种细胞因子分泌增多， 增强机体免疫功能。 0088 中药作用于 H1N1 感染的 MDCK 细胞上清血凝试验 0089 0090 + 表示流感病毒包膜上的 HA 与鸡红细胞膜上的特异性受体。
35、结合， 从而出现红细胞 凝集， 即血凝试验阳性。( 阳性说明药物在该稀释度下有血凝素与 RBC 结合 ) 0091 - 表示流感病毒包膜上的 HA 未与鸡红细胞上的特异性受体结合， 未出现红细胞凝 集， 即血凝试验阴性。( 阳性说明药物在该稀释度下无血凝素与 RBC 结合 ) 0092 分析 ： 细胞上清液血凝试验中流感病毒血凝效价为 2-8， 炙紫菀、 马齿苋、 甘草组合 物组血凝试验中药物稀释浓度 (1 23) 为 0.125g/ml 时， 可以使流感病毒失去活性， 可以 判断药物在 0.125g/ml 时能够抑制流感病毒复制。说明炙紫菀、 马齿苋、 甘草组合物在细胞 模型中能有效地使流感病毒失活。 说 明 书 CN 102988469 A 10 。