一类吖啶类化合物及其应用.pdf

本发明提供了一类吖啶类化合物及其应用，所述化合物具有通式I的结构：通式I中：R1选自H或-CO-Ph-(o﹑m﹑p)R4；R2选自O或-N-Ph-(o﹑m﹑p)R5；R3、R4和R5分别独立选自H、C1～C6的饱和烷基或C1～C6的饱和烷基取代的苯氧基。本发明的吖啶类化合物模拟BH3-only蛋白α-螺旋，竞争性结合和拮抗Bcl-2，Bcl-XL和Mcl-1蛋白，从而特异性的引起肿瘤细胞凋亡，而且对正常细胞以没有杀伤力，有望被开发成为靶向Bcl-2家族蛋白的安全、高效的蛋白抑制剂类抗癌药物。

权利要求书
1.  一类吖啶类化合物，具有如下结构通式Ⅰ：

其中：
R1选自H或-CO-Ph-(o﹑m﹑p)R4；
R2选自O或-N-Ph-(o﹑m﹑p)R5；
R3、R4和R5分别独立选自H、C1～C6的饱和烷基或C1～C6的饱和烷基取代的苯氧基。

2.  根据权利要求1所述的吖啶类化合物，其特征在于R1为-CO-Ph-(o﹑m﹑p)R4，R2为-N-Ph-(o﹑m﹑p)R5。

3.  根据权利要求1或2所述的吖啶类化合物，其特征在于R3和R4分别独立选自C1～C6的饱和烷基，R5选自C1～C6饱和烷基取代的苯氧基。

4.  根据权利有求3所述的吖啶类化合物，其特征在于C1～C6的饱和烷基选自甲基、乙基、异丙基、仲丁基或异丁基。

5.  根据权利要求1所述的吖啶类化合物，选自：
2,3,4-三羟基吖啶-9(10H)-酮；
2,3,4-三羟基-6-甲基吖啶-9(10H)-酮；
2,3,4-三羟基-6-异丙基吖啶-9(10H)-酮；
10-苯甲酰基-2,3,4-三羟基吖啶-9(10H)-酮；
10-(3-乙基-苯甲酰基)-6-甲基-2,3,4-三羟基吖啶-9(10H)-酮；
10-(4-叔丁基-苯甲酰基)-6-异丙基-2,3,4-三羟基吖啶-9(10H)-酮；
(E)-9-苯亚胺-2,3,4-羟基吖啶；
(E)-6-甲基-9-(2-仲丁基-苯亚胺)-2,3,4-羟基吖啶；
(E)-6-异丙基-9-(4-苯氧基-苯亚胺)-2,3,4-羟基吖啶；
(E)-9-苯亚胺基-10-苯甲酰基-2,3,4-三羟基-10(9H)-吖啶；
(E)-9-(2-仲丁基-苯亚胺)-6-甲基-10-(4-甲基-苯甲酰基)-2,3,4-三羟基-10(9H)-吖啶；
(E)-9-(4-苯氧基-苯亚胺)-6-异丙基-10-(4-叔丁基-苯甲酰基)-2,3,4-三羟基-10(9H)-吖啶。

6.  权利要求1～5的任一项所述的吖啶类化合物在作为BH3α-螺旋模拟物中的应用。

7.  权利要求1～5的任一项所述的吖啶类化合物在制备Bcl-2家族蛋白抑制剂中的应用。

8.  权利要求1～5的任一项所述的吖啶类化合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）3,4,5-三甲氧基苯甲酸与液溴按投料摩尔比1:1，回流反应15-30h，制备得2-溴-3,4,5-三甲氧基苯甲酸，其中反应溶剂为氯仿和水的混合溶液；
（2）将2-溴-3,4,5-三甲氧基苯甲酸与3-R3-苯胺按投料摩尔比1:1.1-1:2，氮气保护下回流反应2-5小时，得式Ⅱ的化合物；其中反应溶剂为乙醇，催化剂为CuI，缚酸剂为K2CO3；

（3）化合物Ⅱ经脱水环化反应制得化合物Ⅲ；所述化合物Ⅱ的脱水环化反应采用下述两种方法中的一种：①化合物Ⅱ在多聚磷酸中，80-90℃下反应30-40分钟，制得R2为O的化合物Ⅲ；②化合物Ⅱ在三氯氧磷中，135-140℃下反应2-3小时，经冷却加水析晶、分离得中间产物，中间产物与NH2-Ph-(o﹑m﹑p)R5投料摩尔比1:1.1-1:2，在乙醇中氮气保护下回流反应1-2小时，反应催化剂为浓盐酸，制得R2为-N-Ph-(o,m,p)R5的化合物Ⅲ；

（4）化合物Ⅲ在48%的溴化氢水溶液中，回流反应1-2小时，得R1为H的式Ⅰ的化合物；
（5）化合物Ⅲ首先与NaH按照投料摩尔比1:2-1:10，在冰浴中反应，待无气泡冒出，再与Cl-CO-Ph-(o﹑m﹑p)R4按投料摩尔比1:1.5-1:5，在冰浴中反应2-3小时，得式Ⅳ的化合物；其中反应溶剂为二甲酰胺；

（6）化合物Ⅳ和三溴化硼按照投料摩尔比为1:10-1:20，在-80℃反应1小时、升温至室温，室温反应18-24小时，得R1为-CO-Ph-(o﹑m﹑p)R4的式Ⅰ的化合物，其中反应溶剂为二氯甲烷。

说明书一类吖啶类化合物及其应用
技术领域
本发明涉及一类新的吖啶类Bcl-2家族蛋白抑制剂及其在体外、体内模拟BH3-only蛋白的α-螺旋，竞争性结合和拮抗Bcl-2和Mcl-1蛋白，从而诱导细胞凋亡和作为抗癌化合物的应用。
背景技术
肿瘤细胞中蛋白质-蛋白质的相互作用（PPI）通常发生改变，这是决定肿瘤恶性发生与发展的基础。研究发现，大部分（65%）的蛋白质相互作用界面是由一个α-螺旋主导的。α-螺旋的一些重要的氨基酸残基可以和受体蛋白质表面的疏水沟槽相互结合形成复合物，从而对蛋白质的相互作用和功能产生影响。因此，利用化学分子模拟α-螺旋，调节PPI、阻断PPI界面是抗肿瘤药物研发的策略之一。
Bcl-2家族蛋白（B-cell lymphoma2family of proteins）是內源细胞凋亡通路又称作线粒体通路的顶点和核心因子。Bcl-2家族蛋白之间的相互作用可以改变线粒体外膜的通透性，进而调控线粒体促凋亡因子的释放来决定细胞的生死。抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之间的相互作用，主要是通过其相互作用界面上的一段α-螺旋来控制的。BH3-only蛋白的BH3肽段以α-螺旋的形式插入Mcl-1和Bcl-2蛋白的疏水沟槽。因此，使用小分子模拟BH3-only蛋白的α-螺旋竞争结合Mcl-1和Bcl-2蛋白的BH3沟槽，可以释放BH3-only蛋白进而启动细胞凋亡，达到杀伤肿瘤细胞的目的。
发明内容
本发明旨在获得可作为BH3的α-螺旋模拟物，能够靶向性和高亲和力的抑制Bcl-2家族蛋白相互作用的化合物。
本发明的目的之一在于提供一类吖啶类化合物，所述化合物具有下述通式I的结构：

其中：
R1选自H或-CO-Ph-(o﹑m﹑p)R4；
R2选自O或-N-Ph-(o﹑m﹑p)R5；
R3、R4和R5分别独立的选自H、C1～C6的饱和烷基或C1～C6的饱和烷基取代的苯氧基。
优选的而技术方案中，所述R1为-CO-Ph-(o,m,p)R4，R2为-N-Ph-(o﹑m﹑p)R5。
进一步地，所述R3和R4分别独立选自C1～C6的饱和烷基，R5选自C1～C6饱和烷基取代的苯氧基。
进一步地，C1～C6的饱和烷基选自甲基、乙基、异丙基、仲丁基、异丁基。
本发明中，所述-CO-Ph-(o﹑m﹑p)R4或-N-Ph-(o﹑m﹑p)R5中的o﹑m﹑p是分别指邻位取代、间位取代和对位取代。
本发明中，所述“C1～C6的饱和烷基”，优选C1～C5的饱和烷基、C1～C4的饱和烷基、C1～C3的饱和烷基、甲基、乙基，其中所述烷基为直链烷基或支链烷基。
本发明的另一目的是提供上述化合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）3,4,5-三甲氧基苯甲酸与液溴按投料摩尔比1:1，回流反应15-30h，制备得2-溴-3,4,5-三甲氧基苯甲酸，其中反应溶剂为氯仿和水的混合溶液；
在步骤（1）中反应完成标志为溶液变成浅黄色；原料3,4,5-三甲氧基苯甲酸与液溴投料比严格限定为1:1，当液溴过量时，会产生双溴化产物，当液溴不足时，会残余大量原料；2-溴-3,4,5-三甲氧基苯甲酸产率为70-90%；
（2）步骤（1）中制得的2-溴-3,4,5-三甲氧基苯甲酸与3-R3-苯胺按投料摩尔比1:1.1-1:2，氮气保护下回流反应2-5小时，得式Ⅱ的化合物；其中乙醇为反应溶剂，CuI为催化剂，K2CO3为缚酸剂；式Ⅱ的化合物的产率为70-90%；

（3）化合物Ⅱ脱水环化制得化合物Ⅲ；所述化合物Ⅱ的脱水环化反应采用下述两种方法中的一种：①化合物Ⅱ在多聚磷酸中，80-90℃下反应30-40分钟，制得R2为O的化合物Ⅲ；②化合物Ⅱ在三氯氧磷中，135-140℃下反应2-3小时，经冷却加水析晶、分离得中间产物，中间产物与NH2-Ph-(o﹑m﹑p)R5投料摩尔比1:1.1-1:2，在乙醇中氮气保护下回流反应1-2小 时，反应催化剂为浓盐酸，制得R2为-N-Ph-(o﹑m﹑p)R5的化合物Ⅲ；

（4）式Ⅲ的化合物在48%的溴化氢水溶液中，回流反应1-2小时，得式Ⅰ的化合物；其中所得式Ⅰ的化合物中R1为H；
（5）化合物Ⅲ首先与NaH按照投料摩尔比1:2-1:10，在冰浴中反应，待无气泡冒出，再与Cl-CO-Ph-(o,m,p)R4按投料摩尔比1:1.5-1:5，在冰浴中反应2-3小时，得式Ⅳ的化合物；其中反应溶剂为干燥过的二甲酰胺（DMF）；

（6）化合物Ⅳ和三溴化硼按照投料摩尔比为1:10-1:20，在-80℃反应1小时、升温至室温，室温反应18-24小时，得R1为-CO-Ph-(o﹑m﹑p)R4的式Ⅰ的化合物，其中反应溶剂为干燥过的二氯甲烷。

在上述制备方法中所述干燥过的二甲酰胺（DMF）是指使用分子筛干燥的分析纯DMF；所述的干燥过的二氯甲烷是指使用NaH在70℃下干燥3小时，并重新蒸馏过的二氯甲烷。二氯甲烷需要严格无水，原因是三溴化硼与水快速反应并可能爆炸。
在上述制备方法的描述中，各个取代基的定义，均与上述对化合物的描述中的定义相同。
对通过上述方法获得的化合物，通过多种手段检测了它们的BH3类似程度，以及他们对Mcl-1和Bcl-2的抑制能力。结果表明，本发明的上述具有新的结构的化合物具有极高的BH3类似程度，可以有效的抑制Mcl-1和Bcl-2蛋白。
对上述化合物，通过细胞实验检测了它们对多种肿瘤细胞系的抑制作用。结果表明，本发明的上述化合物可以很好的诱导多种肿瘤细胞系凋亡，而对正常细胞没有杀伤作用。
基于此，本发明还提供上述吖啶类化合物可以用于制备BH3的α-螺旋模拟物Bcl-2家族蛋白抑制剂，并进一步用于制备抗肿瘤药物。所述的Bcl-2家族蛋白抑制剂或相应的抗肿瘤药物可以是化合物的单质剂型也可以是有效量的吖啶类化合物与适量的药用辅剂混合形成的组合制剂。
本发明所述的吖啶类化合物模拟BH3-only蛋白α-螺旋，竞争性结合和拮抗Bcl-2和Mcl-1蛋白，从而诱导细胞凋亡作用，实现其作为抗癌化合物的应用。
附图说明
图1是荧光偏振方法检测化合物12与FAM-Bid肽段竞争结合Mcl-1蛋白的动力学曲线。
图2是荧光偏振方法检测化合物12与FAM-Bid肽段竞争结合Bcl-2蛋白的动力学曲线。
图3是化合物12与Mcl-1蛋白结合的Autodock结果示意图。
图4是化合物12滴定Mcl-1蛋白的1H-15N HSQC化学位移谱图。
图5是化合物12滴定Mcl-1蛋白的1H-15N HSQC，化学位移较大的氨基酸残基示意图。
图6是化合物12与其模拟的BH3-only蛋白的α-螺旋的叠加图。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从化学试剂公司购买。
实施例1：2,3,4-三羟基吖啶-9(10H)-酮（化合物1）的制备

称取21.2g（0.1mol）3,4,5-三甲氧基苯甲酸，溶于150mL氯仿和10mL水的混合溶液，在搅拌下加入5.13mL（0.1mol）液溴。溶液变为深红色，反应回流18h后，冷却到室温。水洗3次，蒸干，残余物为浅黄色固体。用乙醇/水(200mL/300mL)重结晶，得到白色 针状晶体2-溴-3,4,5-三甲氧基苯甲酸25.6g，产率87.9%，产物熔点为144–145℃。
称取5.82g（0.02mol）2-溴-3,4,5-三甲氧基苯甲酸，2.24g（0.024mol）苯胺，1.9g CuI和4.14g（0.03mol）K2CO3溶于150mL乙醇中，氮气保护下回流反应2h。冷却后，减压蒸馏除去溶液，残余固体溶于250mL1%（质量比）的NaOH水溶液中。过滤，滤液在搅拌下用浓盐酸调pH至1。析出大量灰色固体，过滤，水洗，用乙醇/水(100mL/300mL)重结晶，得到白色针状晶体2-苯胺-3,4,5-三甲氧基苯甲酸5.2g，产率85.8%。
称取3.9g（12.8mmol）2-苯胺-3,4,5-三甲氧基苯甲酸加入50ml的圆底烧瓶中，加入20mL粘稠多聚磷酸，混合物在90℃下搅拌反应40分钟。冷却到室温，油状液体在搅拌下倒入80g粉末状冰上。静置2h后，过滤，水洗，所得黄色固体用乙醇/水(100mL/200mL)重结晶，得到黄色粉末2,3,4-三甲氧基吖啶-9(10H)-酮2.4g，产率65%.
称取285mg（1mmol）2,3,4-三甲氧基吖啶-9(10H)-酮加入20mL溴化氢水溶液中（48%质量比），反应回流1小时。冷却到室温，有大量固体析出，过滤，水洗，粗产品用乙醇水重结晶，获得黄色粉末2,3,4-三羟基吖啶-9(10H)-酮。
产品产量139mg,产率为57.2%;1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.830(s,1H),9.668(s,1H),9.444(s,1H),8.129(d,J=8.0Hz,1H),7.861(d,J=8.0Hz,1H),7.548(m,J=16.0Hz,1H),7.182(s,1H),7.107(m,J=16.0Hz,1H).TOF MS(EI+):C13H9NO4,found244.1.
实施例2：2,3,4-三羟基-6-甲基吖啶-9(10H)-酮（化合物2）的制备

称取5.82g（0.02mol）2-溴-3,4,5-三甲氧基苯甲酸，2.57g（0.024mol）间甲基苯胺，1.9g CuI和4.14g（0.03mol）K2CO3溶于150mL乙醇中，氮气保护下回流反应2h。冷却后，减压蒸馏除去溶液，残余固体溶于250mL1%（质量比）的NaOH水溶液中。过滤，滤液在搅拌下用浓盐酸调pH至1。析出大量灰色固体，过滤，水洗，用乙醇/水(100mL/300mL)重结晶，得到白色针状晶体2-(3-甲基苯胺)-3,4,5-三甲氧基苯甲酸4.6g，产率72.6%。
称取3.17g（0.01mol）2-(3-甲基苯胺)-3,4,5-三甲氧基苯甲酸加入50ml的圆底烧瓶中，加入20mL粘稠多聚磷酸，混合物在90℃下搅拌反应30分钟。冷却到室温，油状液体在搅拌下倒入80g粉末状冰上。静置2h后，过滤，水洗，所得黄色固体用乙醇/水(100mL/200mL)重结晶，得到黄色粉末2,3,4-三甲氧基-6-甲基吖啶-9(10H)-酮1.7g，产率56.7%.
称取299mg（1mmol）2,3,4-三甲氧基-6-甲基吖啶-9(10H)-酮加入20mL溴化氢水溶液中（48%质量比），反应回流1小时。冷却到室温，有大量固体析出，过滤，水洗，粗产品用乙醇水重结晶，获得黄色粉末2,3,4-三羟基-6-甲基吖啶-9(10H)-酮。
产品产量85mg,产率为33.1%;1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.002(s,1H),9.807(s,1H),9.623(s,1H),9.422(s,1H),7.960(s,1H),7.813(d,J=8.0Hz,1H),7.442(d,J=8.0Hz,1H),7.196(s,1H),2.384(s,3H).TOF MS(EI+):C14H11NO4,found257.1.
实施例3：2,3,4-三羟基-6-异丙基吖啶-9(10H)-酮（化合物3）的制备

称取5.82g（0.02mol）2-溴-3,4,5-三甲氧基苯甲酸，3.24g（0.024mol）3-异丙基苯胺，1.9g CuI和4.14g（0.03mol）K2CO3溶于150mL乙醇中，氮气保护下回流反应2h。冷却后，减压蒸馏除去溶液，残余固体溶于250mL1%（质量比）的NaOH水溶液中。过滤，滤液在搅拌下用浓盐酸调pH至1。析出大量灰色固体，过滤，水洗，用乙醇/水(100mL/300mL)重结晶，得到白色针状晶体2-(3-异丙基苯胺)-3,4,5-三甲氧基苯甲酸4.4g，产率63.8%。
称取3.45g（0.01mol）2-(3-异丙基苯胺)-3,4,5-三甲氧基苯甲酸加入50ml的圆底烧瓶中，加入20mL粘稠多聚磷酸，混合物在90℃下搅拌反应30分钟。冷却到室温，油状液体在搅拌下倒入80g粉末状冰上。静置2h后，过滤，水洗，所得黄色固体用乙醇/水(100mL/200mL)重结晶，得到黄色粉末2,3,4-三甲氧基-6-异丙基吖啶-9(10H)-酮2.6g，产率79.5%.
称取327mg（1mmol）2,3,4-三甲氧基-6-异丙基吖啶-9(10H)-酮加入20mL溴化氢水溶液中（48%质量比），反应回流1小时。冷却到室温，有大量固体析出，过滤，水洗，粗产品用乙醇水重结晶，获得棕色粉末2,3,4-三羟基-6-异丙基吖啶-9(10H)-酮。
产品产量248mg,产率为87.0%;1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.97(s,1H),8.09(d,J=8.0Hz,1H),7.77(s,1H),7.19(s,1H),7.08(d,J=8.0Hz,1H),2.93(m,J=16.0Hz,1H).1.25(d,J=8.0Hz,6H).TOF MS(EI+):C16H15NO4,found285.1.
实施例4：10-苯甲酰基-2,3,4-三羟基吖啶-9(10H)-酮（化合物4）的制备

称取0.855g（3mmol）2,3,4-三羟基吖啶-9(10H)-酮，溶于10mL干燥过的DMF中，搅拌冰浴下分批次加入480mg（20mmol）NaH，待无气泡冒出。溶液变为淡绿色，搅拌下在30分钟内滴加8.16μL(7mmol)苯甲酰氯，加毕，在氮气保护下冰浴反应1h。剧烈搅拌下，反应液加入冰水中，黄色固体析出，过滤，水洗。粗产品用乙醇水重结晶。获得黄色固体0.530g，产率41.1%。
称取上步黄色产品0.403g（1.0mmol），溶于10mL干燥过的二氯甲烷中，完全溶解后，溶液在–80℃氮气丙酮溶液中冷却。搅拌下，缓慢滴加10mmol三溴化硼的二氯甲烷溶液，30分钟加完。封闭反应体系，在–80℃反应1h后，缓慢升温到室温。反应12小时后，反应液加入甲醇淬灭，加入50mL冰水中。使用乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥。过滤，滤液蒸干，获得红色粉末10-苯甲酰基-2,3,4-三羟基吖啶-9(10H)-酮。
产品产量240mg,产率为69.2%;1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.831(s,1H),9.648(s,1H),8.939(s,1H),8.197(d,J=8.0Hz,1H),7.569(t,J=8.0Hz,1H),7.533(d,J=8.0Hz,1H),7.439(s,1H),7.242(m,J=8.0Hz,2H),7.113–7.190(m,4H).TOF MS(EI+):C20H13NO5,found347.2.
实施例5：10-（3-乙基-苯甲酰基）-6-甲基-2,3,4-三羟基吖啶-9(10H)-酮（化合物5）的制备

称取0.897g（3mmol）2,3,4-三羟基-6-甲基吖啶-9(10H)-酮，溶于10mL干燥过的DMF中，搅拌冰浴下分批次加入480mg（20mmol）NaH，待无气泡冒出。溶液变为淡绿色，搅拌下在30分钟内滴加8.16μL(7mmol)3-乙基-苯甲酰氯，加毕，在氮气保护下冰浴反应1h。剧烈搅拌下，反应液加入冰水中，黄色固体析出，过滤，水洗。粗产品用乙醇水重结晶。
称取上步黄色产品0.431g（1.0mmol），溶于10mL干燥过的二氯甲烷中，完全溶解后，溶液在–80℃氮气丙酮溶液中冷却。搅拌下，缓慢滴加10mmol三溴化硼的二氯甲烷溶液，30分钟加完。封闭反应体系，在–80℃反应1h后，缓慢升温到室温。反应12小时后，反应 液加入甲醇淬灭，加入50mL冰水中。使用乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥。过滤，滤液蒸干，获得红色粉末10-（3-乙基-苯甲酰基）-6-甲基-2,3,4-三羟基吖啶-9(10H)-酮。
产品产量278mg,产率为71.4%;1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.831(s,1H),9.648(s,1H),8.939(s,1H),δ9.569(s,1H),9.374(s,1H),9.277(s,1H),8.419(s,1H),8.081(d,J=8.0Hz,1H),7.852(t,J=8.0Hz,1H),7.555(d,J=8.0Hz,1H),7.099(t,J=8.0Hz,1H),6.501–6.699(m,3H),3.01(m,J=12.0Hz,2H),2.34(s,3H),1.23(t,J=8.0Hz,3H).TOF MS(EI+):C23H19NO5,found389.1.
实施例6：10-（4-叔丁基-苯甲酰基）-6-异丙基-2,3,4-三羟基吖啶-9(10H)-酮（化合物6）的制备

称取0.981g（3mmol）2,3,4-三羟基-6-异丙基吖啶-9(10H)-酮，溶于10mL干燥过的DMF中，搅拌冰浴下分批次加入480mg（20mmol）NaH，待无气泡冒出。溶液变为淡绿色，搅拌下在30分钟内滴加8.16μL(7mmol)4-叔丁基基-苯甲酰氯，加毕，在氮气保护下冰浴反应1h。剧烈搅拌下，反应液加入冰水中，黄色固体析出，过滤，水洗。粗产品用乙醇水重结晶。
称取上步黄色产品0.487g（1.0mmol），溶于10mL干燥过的二氯甲烷中，完全溶解后，溶液在–80℃氮气丙酮溶液中冷却。搅拌下，缓慢滴加10mmol三溴化硼的二氯甲烷溶液，30分钟加完。封闭反应体系，在–80℃反应1h后，缓慢升温到室温。反应12小时后，反应液加入甲醇淬灭，加入50mL冰水中。使用乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥。过滤，滤液蒸干，获得红色粉末10-（4-叔丁基-苯甲酰基）-6-异丙基-2,3,4-三羟基吖啶-9(10H)-酮。
产品产量189mg,产率为42.4%;1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.831(s,1H),9.648(s,1H),8.939(s,1H),8.197(d,J=8.0Hz,1H),δ9.569(s,1H),9.374(s,1H),9.277(s,1H),8.419(s,1H),8.081(d,J=8.0Hz,1H),7.852(t,J=8.0Hz,1H),7.555(d,J=8.0Hz,1H),7.099(t,J=8.0Hz,1H),6.501–6.699(m,3H),3.01(m,J=12.0Hz,1H),1.34(br,9H),1.28(d,J=12.0Hz,6H).TOF MS(EI+):C27H27NO5,found445.2.
实施例7：(E)-9-苯亚胺-2,3,4-羟基吖啶（化合物7）的制备

称取5.2g（0.017mol）2-苯胺-3,4,5-三甲氧基苯甲酸，溶于20mL三氯氧磷中，搅拌下在135–140℃反应2h。稍冷，减压蒸馏除去多余三氯氧磷。冷却至室温，在搅拌下将剩余油状物加入100mL冰水中，大量深红色固体析出。过滤，水洗，真空干燥，得到红色固体粉末9-氯-2,3,4-三甲氧基吖啶3.84g,产率74%。
称取3.03g（0.01mol）上步红色产物9-氯-2,3,4-三甲氧基吖啶和1.86g（0.02mol）苯胺溶于20mL乙醇中，待完全溶解后，加入5滴浓盐酸。在氮气保护下，反应混合物搅拌回流反应1h。冷却至室温，加入150mL冷水，大量固体析出。过滤，水洗，获得黄色粉末9-苯亚胺-2,3,4-三甲氧基吖啶2.2g，产率62%。
称取360mg（1mmol）9-苯亚胺-2,3,4-三甲氧基吖啶加入20mL溴化氢水溶液中（48%质量比），反应回流1小时。冷却到室温，有大量固体析出，过滤，水洗，粗产品用乙醇水重结晶，获得黄色粉末(E)-9-苯亚胺-2,3,4-羟基吖啶。
产品产量210mg，产率为66%；1H NMR(400MHz,DMSO)δ13.44(s,1H),10.62(s,1H),10.50(s,1H),8.384(d,J=8.0Hz,1H),8.270(d,J=8.0Hz,1H),7.895(t,J=8.0Hz,1H),7.407–7.470(m,3H),7.240–7.290(m,3H),7.004(s,1H).TOF MS(EI+):C19H14N2O3,found318.1.
实施例8：(E)-6-甲基-9-(2-仲丁基-苯亚胺)-2,3,4-羟基吖啶（化合物8）的制备

称取6.34g（0.02mol）2-(3-甲基苯胺)-3,4,5-三甲氧基苯甲酸，溶于20mL三氯氧磷中，搅拌下在135-140℃反应2h。稍冷，减压蒸馏除去多余三氯氧磷。冷却至室温，在搅拌下将剩余油状物加入100mL冰水中，大量深红色固体析出。过滤，水洗，真空干燥，得到红色固体粉末9-氯-6-甲基-2,3,4-三甲氧基吖啶4.37g,产率81%。
称取3.17g（0.01mol）上步红色产物9-氯-6-甲基-2,3,4-三甲氧基吖啶和2.98g（0.02mol）2-仲丁基苯胺溶于20mL乙醇中，待完全溶解后，加入5滴浓盐酸。在氮气保护下，反应混合物搅拌回流反应1.5h。冷却至室温，加入150mL冷水，大量固体析出。过滤，水洗，获得黄色粉末(E)-6-甲基-9-(2-仲丁基-苯亚胺)-2,3,4-三甲氧基吖啶。
称取430mg（1mmol）(E)-6-甲基-9-(2-仲丁基-苯亚胺)-2,3,4-三甲氧基吖啶加入20mL溴化氢水溶液中（48%质量比），反应回流1小时。冷却到室温，有大量固体析出，过滤，水洗，粗产品用乙醇水重结晶，获得黄色粉末(E)-6-甲基-9-(2-仲丁基-苯亚胺)-2,3,4-羟基吖啶。
产品产量182mg,产率为47%;1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.24(d,J=8.0Hz,1H),7.40(m,J=8.0Hz,3H),7.25(d,J=8.0Hz,1H),7.15(m,J=12.0Hz,2H),6.95(s,1H),2.85(m,J=12.0Hz,1H),2.43(s,3H),2.85(m,J=12.0Hz,2H),1.26(d,J=8.0Hz,3H),0.92(m,J=8.0Hz,3H).TOF MS(EI+):C24H24N2O3,found388.1.
实施例9：(E)-6-异丙基-9-(4-苯氧基-苯亚胺)-2,3,4-羟基吖啶（化合物9）的制备

称取6.9g（0.02mol）2-(3-异丙基苯胺)-3,4,5-三甲氧基苯甲酸，溶于20mL三氯氧磷中，搅拌下在135–140℃反应2h。稍冷，减压蒸馏除去多余三氯氧磷。冷却至室温，在搅拌下将剩余油状物加入100mL冰水中，大量深红色固体析出。过滤，水洗，真空干燥，得到红色固体粉末9-氯-6-异丙基-2,3,4-三甲氧基吖啶。
称取3.45g（0.01mol）上步红色产物9-氯-6-异丙基-2,3,4-三甲氧基吖啶和5.55g（0.03mol）4-苯氧基苯胺溶于20mL乙醇中，待完全溶解后，加入5滴浓盐酸。在氮气保护下，反应混合物搅拌回流反应1.5h。冷却至室温，加入150mL冷水，大量固体析出。过滤，水洗，获得黄色粉末(E)-6-异丙基-9-(4-苯氧基-苯亚胺)-2,3,4-三甲氧基吖啶。
称取494mg（1mmol）(E)-6-异丙基-9-(4-苯氧基-苯亚胺)-2,3,4-三甲氧基吖啶加入20mL溴化氢水溶液中（48%质量比），反应回流1小时。冷却到室温，有大量固体析出，过滤，水洗，粗产品用乙醇水重结晶，获得橘黄色粉末(E)-6-异丙基-9-(4-苯氧基-苯亚胺)-2,3,4-羟基吖啶。
产品产量280mg,产率为62.2%;1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.24(d,J=8.0Hz,1H),7.40(m,J=16.0Hz,3H),7.25(d,J=8.0Hz,2H),7.15(m,J=12.0Hz,2H),7.07(m,J=16.0Hz,4H), 6.95(s,1H),3.07(m,J=12.0Hz,1H).1.30(d,J=8.0Hz,6H).TOF MS(EI+):C28H24N2O4,found452.2.
实施例10：(E)-9-苯亚胺基-10-苯甲酰基-2,3,4-三羟基-10(9H)-吖啶（化合物10）的制备

称取9-苯亚胺-2,3,4-三甲氧基吖啶1.08g（3mmol），溶于10mL干燥过的DMF中，搅拌冰浴下分批次加入480mg（20mmol）NaH，待无气泡冒出。溶液变为淡绿色，搅拌下在30分钟内滴加8.16μL(7mmol)苯甲酰氯，加毕，在氮气保护下冰浴反应1h。剧烈搅拌下，反应液加入冰水中，黄色固体析出，过滤，水洗。粗产品使用硅胶柱进行分离，流动相为二氯甲烷：丙酮（35:1）。获得黄色固体1.02g，产率73.4%。
称取上步黄色产品0.464g（1.0mmol），溶于10mL干燥过的二氯甲烷中，完全溶解后，溶液在–80℃氮气丙酮溶液中冷却。搅拌下，缓慢滴加10mmol三溴化硼的二氯甲烷溶液，30分钟加完。封闭反应体系，在–80℃反应1h后，缓慢升温到室温。反应12小时后，反应液加入甲醇淬灭，加入50mL冰水中。使用乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥。过滤，滤液蒸干，获得红色粉末(E)-9-苯亚胺基-10-苯甲酰基-2,3,4-三羟基-10(9H)-吖啶。
产品产量320mg,产率为75.8%;1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.54(m,J=12.0Hz,1H),8.32(s,1H),7.98(d,J=8.0Hz,1H),7.72(d,J=8.0Hz,2H),7.19–7.42(m,10H).TOF MS(EI+):C26H18N2O4,found422.1.
实施例11：(E)-9-(2-仲丁基-苯亚胺)-6-甲基-10-(4-甲基-苯甲酰基)-2,3,4-三羟基-10(9H)-吖啶（化合物11）的制备

称取1.29g（3mmol）(E)-6-甲基-9-(2-仲丁基-苯亚胺)-2,3,4-三甲氧基吖啶，溶于10mL 干燥过的DMF中，搅拌冰浴下分批次加入480mg（20mmol）NaH，待无气泡冒出。溶液变为淡绿色，搅拌下在30分钟内滴加8.16μL(7mmol)对甲苯甲酰氯，加毕，在氮气保护下冰浴反应1h。剧烈搅拌下，反应液加入冰水中，黄色固体析出，过滤，水洗。粗产品使用硅胶柱进行分离，流动相为二氯甲烷：丙酮（35:1）。获得黄色固体(E)6-甲基-9-(2-仲丁基-苯亚胺)-10-(4-甲基苯甲酰基)-2,3,4-三甲氧基-10(9H)-吖啶。
称取上步黄色产品0.548g（1.0mmol），溶于10mL干燥过的二氯甲烷中，完全溶解后，溶液在–80℃氮气丙酮溶液中冷却。搅拌下，缓慢滴加10mmol三溴化硼的二氯甲烷溶液，30分钟加完。封闭反应体系，在–80℃反应1h后，缓慢升温到室温。反应12小时后，反应液加入甲醇淬灭，加入50mL冰水中。使用乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥。过滤，滤液蒸干，获得红色粉末(E)6-甲基-9-(2-仲丁基-苯亚胺)-10-(4-甲基苯甲酰基)-2,3,4-三羟基-10(9H)-吖啶。
产品产量230mg,产量为45.4%;1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.21(d,J=8.0Hz,2H),7.98(d,J=8.0Hz,1H),7.19–7.42(m,6H)，7.02(m,J=8.0Hz,2H),6.98(s,1H),2.85(m,J=12.0Hz,1H),2.43(d,J=12.0Hz,6H),2.85(m,J=12.0Hz,2H),1.26(d,J=8.0Hz,3H),0.92(m,J=8.0Hz,3H).TOF MS(EI+):C32H30N2O4,found506.1.
实施例12：(E)-9-(4-苯氧基-苯亚胺)-6-异丙基-10-(4-叔丁基-苯甲酰基)-2,3,4-三羟基-10(9H)-吖啶（化合物12）的制备

称取1.49g（3mmol）(E)-6-异丙基-9-(4-甲氧基-苯亚胺)-2,3,4-三甲氧基吖啶，溶于10mL干燥过的DMF中，搅拌冰浴下分批次加入480mg（20mmol）NaH，待无气泡冒出。溶液变为淡绿色，搅拌下在30分钟内滴加8.16μL(7mmol)4-苯氧基-苯甲酰氯，加毕，在氮气保护下冰浴反应1h。剧烈搅拌下，反应液加入冰水中，黄色固体析出，过滤，水洗。粗产品使用硅胶柱进行分离，流动相为二氯甲烷：丙酮（35:1）。获得黄色固体(E)-6-异丙基-9-(4-甲氧基-苯亚胺)-10-(4-叔丁基苯甲酰基)-2,3,4-三甲氧基-10(9H)-吖啶。
称取上步黄色产品0.327g（0.5mmol），溶于10mL干燥过的二氯甲烷中，完全溶解后， 溶液在–80℃氮气丙酮溶液中冷却。搅拌下，缓慢滴加10mmol三溴化硼的二氯甲烷溶液，30分钟加完。封闭反应体系，在–80℃反应1h后，缓慢升温到室温。反应12小时后，反应液加入甲醇淬灭，加入50mL冰水中。使用乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥。过滤，滤液蒸干，获得红色粉末(E)-6-异丙基-9-(4-苯氧基-苯亚胺)-10-(4-叔丁基苯甲酰基)-2,3,4-三羟基-10(9H)-吖啶。
产品产量197mg,产率为64.5%;1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.13(s,1H),8.03(d,J=12.0Hz,1H),7.61(d,J=12.0Hz,2H),7.47(s,1H),7.34(br,J=12.0Hz,4H),7.19(d,J=8.0Hz,2H),7.12(d,J=8.0Hz,1H),6.69–6.98(br,5H),3.15(s,1H),1.34(br,9H),1.14(s,6H).TOF MS(EI+):C39H36N2O5,found612.6.
实施例13：通过荧光偏振分析法检测化合物的BH3类似程度
合成一个带有21个氨基酸的Bid BH3肽段（氨基酸：79-99：QEDIIRNIARHLAQVGD SMDR)，并在N端标记上6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（FAM）作为荧光标签（FAM-Bid）。竞争结合实验中所用的反应体系为GST-Bcl-2蛋白（40nM）或Mcl-1蛋白，和FAM-Bid多肽（5nM）溶于反应缓冲液中（100mM K3PO4,pH7.5;100μg/mL牛γ白蛋白；0.02%叠氮化钠）。在96孔板中，每孔加入100μL反应体系，然后加入溶于DMSO的检测化合物12，化合物在体系中的终浓度分别为100μM、10μM、1μM、100nM、10nM，每个浓度设3个平行孔。同时设立两个对照组，一个对照组为反应体系中只含有Bcl-2或Mcl-1和FAM-Bid(相当于0%抑制率)，另一对照组中的反应体系只含有FAM-Bid肽段。96孔板经过4个小时的避光孵育后，进行酶标仪上检测。荧光极化值（mP）在由530nm波长激发产生的485nm发射波长下测量。用蛋白抑制率对化合物剂量对数作图求出IC50值，根据公式Ki=[I]50/([L]50/Kd+[P]0/Kd+1)推导计算得出化合物与蛋白的竞争结合常数Ki值，在公式中[I]50为蛋白抑制率为50%时的化合物浓度,[L]50为蛋白抑制率为50%时的游离FAM-Bid的浓度，Kd为Mcl-1/FAM-Bid复合物的解离常数，[P]0为蛋白抑制率为0%时的游离Mcl-1的浓度。化合物12与Mcl-1和Bcl-2蛋白的竞争结合常数Ki值分别为79nM和56nM（附图1和2）。
按照上述相同的试验方法检测其他化合物的BH3类似程度，它们与Bcl-2和Mcl-1蛋白的结合常数在也多是nM级，以(-)-Gossypol为参照物。具体结果如表1所示。
表1.本发明化合物对Bcl-2和Mcl-1蛋白的竞争结合常数（Ki）


从表1中，我们可以发现随着R1，R2，R3三个取代基疏水性的增加，化合物对Mcl-1和Bcl-2蛋白的亲和力有不同程度的增加。其中较优化合物为6（R1=4-叔丁基苯甲酰基,R2=氧，R3=异丙基）对Mcl-1和Bcl-2蛋白的亲和力Ki分别为0.151μM和0.188μM；11（R1=4-甲基苯甲酰基,R2=2-仲丁基-苯亚胺，R3=甲基）对Mcl-1和Bcl-2蛋白的亲和力Ki分别为0.154μM和0.1112μM；12（R1=4-叔丁基苯甲酰基,R2=4-苯氧基-苯亚胺基，R3=异丙基）对Mcl-1和Bcl-2蛋白的亲和力Ki分别为0.079μM和0.056μM。与(-)-Gossypol相比，化合物12对Mcl-1和Bcl-2蛋白的亲和力Ki分别提高了4倍和8倍。
实施例14：活细胞内荧光偏振能量转移（FRET）检测化合物的BH3类似性
利用磷酸钙共沉淀的方法将2μg Bcl-2-CFP和Bax-YFP质粒分别或同时转染至Hela细胞中，转染24小时后，将细胞接种于6孔培养板（2×105个/孔），加入溶于DMSO的待检测化合物12至终浓度（0.5,1.0,1.5,2.0,3.0,4.0,6.0,8.0,10.0μM），药物作用24小时后，PBS清洗细胞3次，用GENIOS荧光酶标仪（TECAN,Swiss）检测荧光值。在时间依赖的实验中，转染后的细胞接种于6孔板后，加入40μM化合物，药物作用每隔1小时，检测荧光值。在只转染Bcl-2-CFP质粒的细胞组中记录475nm发射波长值，激发波长为433nm。在只转染Bax-YFP质粒的细胞组中记录527nm发射波长值，激发波长为505nm。对共转染Bcl-2-CFP和Bax-YFP质粒的细胞实验组记录527nm和475nm发射波长值，激发波长为433nm。527nm发射荧光与475nm发射荧光相比值即为FRET，将单独转染对照组的FRET值设为1.0。在共转染的细胞中，由于Bcl-2蛋白和Bax蛋白的相互作用使得FRET值增加至2.0，而随着加药浓度和时间的增加，对两蛋白相互作用的干扰增强，FRET随之减弱。细胞活力由MTT法进行测定。试验结果表明，该化合物在0.5μM，作用1小时即可干扰Bcl-2/Bax之间的相互作用，呈浓度时间依赖趋势。
按照上述相同的试验方法检测其他11个化合物，试验证明这些化合物在不同作用浓度和作用时间的条件下，均具有细胞内模拟BH3-only蛋白的作用，能明显干扰Bcl-2/Bax之间的相互作用。具体结果如表2所示，其中浓度和时间表示测试化合物在该浓度下干扰Bcl-2/Bax 之间的相互作用发生的时间。
表2.本发明化合物对干扰Bcl-2/Bax之间相互作用的影响
化合物浓度（μM）时间（h）化合物浓度（μM）时间（h）110478424286336294244310125321111611120.51
从表2中，我们可以发现化合物干扰Bcl-2/Bax之间的相互作用，呈浓度时间依赖趋势。随着R1，R2，R3三个取代基疏水性的增加，干扰Bcl-2/Bax之间的相互作用需要的化合物浓度越低，时间越短，其趋势与对Mcl-1、Bcl-2蛋白的亲和力趋势相同。其中较优化合物为6（R1=4-叔丁基苯甲酰基,R2=氧，R3=异丙基）浓度为1uM，时间为1小时；11（R1=4-甲基苯甲酰基,R2=2-仲丁基-苯亚胺，R3=甲基）浓度为1uM，时间为1小时；12（R1=4-叔丁基苯甲酰基,R2=4-苯氧基-苯亚胺基，R3=异丙基）浓度为0.5uM，时间为1小时。
实施例15：利用MTT实验检测化合物12对多个细胞系的细胞毒性
将要检测的细胞（K562，U937，NCI-H1688，SMMC-7721，MCF-7，Hela和Hek293）用0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔103～104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200μL；将培养板移入CO2孵箱中，37℃、5%CO2及饱和湿度下培育24小时后，加入化合物12浓度从100μM到1μM（对照组选择加入相同体积的DMSO），继续培养72小时；每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μL，孵育4小时后终止培养。小心吸弃孔内培养上清液。然后，每孔加入150μL的DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解；选择550nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果。计算细胞存活率：试验组光吸收值/对照组光吸收值×100%，用细胞存活率对化合物剂量对数作图求出IC50值（细胞数量减少一半时所需化合物浓度）。
使用MTT方法检测化合物12在细胞培养液中，对癌细胞K562，U937，NCI-H1688，SMMC-7721，MCF-7，Hela和正常细胞Hek293的杀伤能力。如表3所示，化合物12能够对检测6种细胞系都保持较高的（1-10μM）杀伤能力，而对正常细胞Hek293没有毒性。MTT实验在细胞水平上进一步证明，化合物12可以靶向Bcl-2家族抗凋亡蛋白行使其抗癌功能。
表3.化合物12对多个细胞系的细胞毒性（IC50）
细胞系IC50[μM]细胞系IC50[μM]K5623.25±0.33SMMC-77216.85±0.18U9374.06±0.15Hela5.24±0.29MCF-76.12±0.26HEK29350.33±2.17NCI-H16884.37±0.08  
实施例16：使用Autodock软件模拟计算化合物12与Mcl-1蛋白的结合模式
Mcl-1(hMcl-1;PDB ID:2NLA)蛋白结构由蛋白质数据库RCSB中获得，化合物12的三维结构利用Chembio3D Ultra11.0进行能量优化获得最优构象。使用AutoDockTools软件对蛋白文件和小分子配体进行预处理，并使用AutoDock4.0软件的Lamarckian Genetic Algorithm(GA)算法进行分子对接计算，AutoDock对接结果用ADT软件显示。
模拟对接结果（图3）显示，化合物12可以很好的模拟Bim螺旋的D67与Mcl-1蛋白的R263和N260形成氢键，模拟Bim螺旋的L62占据Mcl-1的P2口袋，模拟Bim螺旋的I65占据Mcl-1的P3口袋，模拟Bim螺旋的F69占据Mcl-1的P4口袋。综上所述，化合物12是Bim螺旋的模拟物，可以很好的占据Mcl-1蛋白的BH3沟槽，抑制Mcl-1蛋白的功能。
实施例17：1H-15N HSQC实验确定化合物12与Mcl-1的结合区域
首先扫描未加小分子的Mcl-1蛋白的1H-15N HSQC图谱，检测蛋白质所有氨基酸的共振峰和谱峰分布情况，温度25或者35度，根据蛋白浓度不同扫描不同时间，记录数据，对靶蛋白分子的主链酰胺的1H15N信号进行化学位移归属，且结合已知蛋白质的三维空间结构来分析，接着，按1:1的浓度配比，滴定小分子抑制剂化合物12与15N标记的Mcl-1蛋白中，利用上述条件，再次扫描记录一系列的1H-15N HSQC谱，检测每个HSQC谱图中谱峰化学位移的变化。用NMRViewJ软件分析HSQC图谱，将前后两次扫描图谱叠加，分析Mcl-1蛋白氨基酸位移情况。随着配体小分子（化合物12）的滴定，谱峰发生化学位移的变化。蛋白质主链酰胺1H-15N化学位移变化较大的谱峰，表示这些氨基酸残基参与了相互作用。通过对化学位移较为明显的峰进行统计分析（图4），然后标定在已知三维结构的蛋白上，就可以明确的分析出小分子具体的结合位置和结合特点(图5)。
如附图4和5所示，随着化合物12的加入，22个氨基酸残基发生了明显的位移（位移大于0.05ppm），并且80%发生较大位移的氨基酸残基位于Mcl-1蛋白的BH3沟槽中。R263和其周围的氨基酸残基（V253、D256、G257和N260）、组成P2口袋的氨基酸残基（F228、F270、L235、V249、V253和T266）、组成P3口袋的氨基酸残基（F228、H224、T266和V220）和P4口袋的氨基酸残基（H224、N223、V220、G219和V216）发生了明显的化学位移，说 明化合物12可以与Mcl-1蛋白的这些区域进行相互作用。综上所述，蛋白质的二维核磁结果从分子水平上说明化合物12可以很好的模拟Bim螺旋的D67、L62、I65和F69（图6）占据Mcl-1蛋白的R263、P2口袋、P3口袋和P4口袋。