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1、(10)申请公布号 CN 103922991 A (43)申请公布日 2014.07.16 CN 103922991 A (21)申请号 201410159716.6 (22)申请日 2014.04.21 C07D 209/14(2006.01) A61K 31/4045(2006.01) A61P 25/24(2006.01) A61P 25/16(2006.01) (71)申请人 兰州理工大学 地址 730050 甘肃省兰州市兰工坪 287 号 (72)发明人 杨中铎 智康康 王鸣刚 (74)专利代理机构 兰州振华专利代理有限责任 公司 62102 代理人 董斌 (54) 发明名称 圆锥山。
2、蚂蝗枝叶中分离的化合物及其制备方 法和用途 (57) 摘要 圆 锥 山 蚂 蝗 枝 叶 中 分 离 的 化 合 物 及 其 制 备 方 法 和 用 途， 该 化 合 物 的 化 学 名 称 为 (S,E)-4-(3-(2-(dimethylamino)ethyl)-1H- indol-5-yloxy)-4-(4-hydroxy-2,6,6-trimet hylcyclohex-1-enyl)but-3-en-2-one， 俗 名 为 Desmodeleganine， 该化合物是从圆锥山蚂蝗 （Desmodiumelegans） 枝叶中经过大孔树脂、 MCI、 硅胶以及 LH-20 柱层析的方法。
3、获得， 单胺氧化酶 (MAO) 抑制活性实验证明该化合物具有显著抗单 胺氧化酶活性， 动物体内试验表明该化合物具有 抗抑郁、 抗帕金森作用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 (10)申请公布号 CN 103922991 A CN 103922991 A 1/1 页 2 1. 圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物， 化合物名为 ：（S,E） -4- （3- （2- （dimethylamino） ethyl） -1H-indol-5-yloxy） -4-（4-hydroxy-2, 6, 6。
4、-trimethylcyclohex-1-enyl） but-3-en-2-one， 其俗名为 Desmodeleganine， 其化学结构式为 ： 。 2. 圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： （1） 称取粉碎的山蚂蝗枝叶， 加入 6 倍体积 95% 的工业乙醇， 充分混匀， 回流提取 2 小 时， 过滤， 滤渣重复提取一次， 合并收集滤液， 浓缩得到乙醇提取浸膏备用 ； （2） 将乙醇提取浸膏悬浮于 2 倍量的蒸馏水中， 用 2 mol/L HCl 调悬浮水溶液至 pH = 2 3， 静置过夜 ； 抽滤 ； 再用 4 mol/L NaOH 溶液调 pH。
5、=10 11， 用氯仿等体积萃取， 减压浓 缩， 得生物碱提取物 ； （3） 将生物碱提取物用 HPD-100 大孔树脂进行柱层析、 以水， 30%、 50%、 70%、 90%、 100% 乙 醇梯度洗脱， 收集 50-70% 洗脱部分 ； （4） 将大孔树脂柱层析后的 50-70% 洗脱部分， 浓缩， 用 MCI-gel-CHP-20P 树脂柱层析， 用水， 30%、 50%、 70%、 90%、 100% 甲醇梯度洗脱， 收集 50-70% 洗脱部分， 浓缩 ； 浓缩物进行硅胶 柱色谱， 三氯甲烷 - 甲醇 (50 1 1 1) 梯度洗脱， 经过 TLC 硫酸乙醇显色剂检测显色， 合并相。
6、同组分， 得到该化合物。 3. 圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物， 其在制备单胺氧化酶抑制剂中的用途。 4. 根据权利要求 3 所述的用途， 其特征在于单胺氧化酶抑制剂是指用于预防、 治疗抑 郁症或者帕金森病的药物。 5.根据权利要求3或4所述的用途， 其特征在于与药学上可以接受的载体， 或其它赋型 剂相结合， 按照常规方法制成经口服给药的内用型剂型， 或非口服给药的注射剂， 或其它剂 型。 权 利 要 求 书 CN 103922991 A 2 1/6 页 3 圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物及其制备方法和用途 技术领域 0001 本发明涉及圆锥山蚂蝗枝叶的生物碱的制备技术。 0002 背景技术 随着。
7、全球经济的快速发展以及人口老龄化问题的不断加重， 现代人们的生活压力越来 越大， 抑郁症和帕金森病的患者越来越多。 因此治疗抑郁症和帕金森病药物 （单胺氧化酶抑 制剂类药物） 的研究引起了人们的广泛兴趣。对于寻找这样的药物来说， 药用植物是一个非 常丰富的资源， 其药用成分具有疗效好、 副作用小、 作用面广等优点。 圆锥山蚂蝗 （Desmodium elegans） 为豆科山蚂蝗属植物， 生于山脚路边、 低山坡疏林 下、 林缘、 田边或草丛中。 分布于陕西西南部、 甘肃、 四川、 贵州西北部、 云南西北部和西藏等 地。目前， 圆锥山蚂蝗的研究主要集中在其形态， 资源方面的研究。到目前为止未见其。
8、抗单 胺氧化酶活性成分及抗抑郁抗帕金森的报道。 0003 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物及其制备方法和用途。 0005 本 发 明 是 圆 锥 山 蚂 蝗 枝 叶 中 分 离 的 化 合 物 及 其 制 备 方 法 和 用 途， 圆 锥 山 蚂 蝗 （Desmodium elegans）枝 叶 中 分 离 出 的 化 合 物，其 化 学 名 为 ： (S,E)-4-(3-(2-(dimethylamino)ethyl)-1H-indol-5-yloxy)-4-(4-hydroxy-2, 6, 6-trimethylcyclohex-1-enyl)but-。
9、3-en-2-one， 其俗名为 Desmodeleganine， 其结构经波 谱解析方法确定， 体内外活性实验表明 ： 该化合物在体外具有单胺氧化酶抑制活性， 在体内 具有抗抑郁及抗帕金森作用。 圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物是从圆锥山蚂蝗枝叶中经过大孔树脂、 MCI、 硅胶柱层 析分离所得， 化学名为 : (S,E)-4-(3-(2-(dimethylamino)ethyl)-1H-indol-5-yloxy)-4 -(4-hydroxy-2, 6, 6-trimethylcyclohex-1-enyl)but-3-en-2-one, 经波谱解析和化学 方法确定其化学结构为 ： 圆锥山蚂蝗枝。
10、叶中分离的化合物的制备方法， 包括以下步骤 ： （1） 称取粉碎的山蚂蝗枝叶， 加入 6 倍体积 95% 的工业乙醇， 充分混匀， 回流提取 2 小 说 明 书 CN 103922991 A 3 2/6 页 4 时， 过滤， 滤渣重复提取一次， 合并收集滤液， 浓缩得到乙醇提取浸膏备用 ； （2） 将乙醇提取浸膏悬浮于 2 倍量的蒸馏水中， 用 2 mol/L HCl 调悬浮水溶液至 pH = 2 3， 静置过夜 ； 抽滤 ； 再用 4 mol/L NaOH 溶液调 pH=10 11， 用氯仿等体积萃取， 减压浓 缩， 得生物碱提取物 ； （3） 将生物碱提取物用 HPD-100 大孔树脂进行。
11、柱层析、 以水， 30%、 50%、 70%、 90%、 100% 乙 醇梯度洗脱， 收集 50-70% 洗脱部分 ； （4） 将大孔树脂柱层析后的 50-70% 洗脱部分， 浓缩， 用 MCI-gel-CHP-20P 树脂柱层析， 用水， 30%、 50%、 70%、 90%、 100% 甲醇梯度洗脱， 收集 50-70% 洗脱部分， 浓缩 ； 浓缩物进行硅胶 柱色谱， 三氯甲烷 - 甲醇 (50 1 1 1) 梯度洗脱， 经过 TLC 硫酸乙醇显色剂检测显色， 合并相同组分， 得到该化合物。 0006 圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物的用途， 该化合物作为单胺氧化酶抑制剂， 用于 制备预防、 。
12、治疗抑郁症和帕金森病的药物。 0007 该化合物作为制备抑郁症和帕金森病药物组分之一的用途。 0008 本发明提供的化合物 （化合物 1） 的结构鉴定方法为 ： 1、 化合物 1 的理化性质数据 无色油状， 旋光度 ： +50 ： 氯仿 ： 甲醇 =1 ： 1 溶剂系统展开， 硫酸乙醇显色为黄色斑点， 碘化铋钾溶液显色为红色斑点， Rf 值 =0.15。IR（溴化钾压片， cm-1） 特征数据 ： 3420- 说明 含有羟基， 1631- 说明含有羰基。 0009 1H-NMR ： 7.23(s ), 7.17(d, J=2.2)， 6.88(dd, J=2.2, 8.8)， 7.31(d, 。
13、J=8.8)， 3.10(t, J=7.4 )， 3.25(t, J=7.4)， 2.80(s)， 1.62(dd, J=2.2, 12.1)， 1.28(dd, J=5.4, 12.1)， 3.83(m)， 2.41(dd, J=7.8, 18.0)， 1.93(dd, J=10.2, 18.0)， 5.40(s)， 2.42(s)， 0.99(s)， 1.05(s)， 1.97(s)。 0010 13C-NMR ： 125.74, 110.58， 128.24， 108.14， 149.95， 115.28， 112.93， 135.03， 22.30， 59.56， 43.98， 37.。
14、72， 49.14， 64.55， 42.30， 136.77， 135.87， 165.79， 119.21， 200.73， 31.37， 29.98， 30.36， 23.30。 0011 2、 化合物 1 分子式的确定 结合 1H-NMR 以及13C-NMR 数据及 HRESIMS（实测值 411.2644M+H+， 计算 C 25H35N2O3值 为 411.2642） ， 确定其分子式为 C25H34N2O3。 0012 3、 化合物 1 结构式的确定 通过IR数据可以知道化合物中含有羟基以及羰基 （max = 1631、 3420 cm1） 。 在 1H, 13C, DEPT 和。
15、 HMQC 核磁共振谱图中显示出 6 个甲基， 4 个 sp3 杂化的亚甲基， 5 个 sp2杂化的 次甲基， 1个氧化的次甲级， 8个sp2杂化的季碳 （包括羰基碳原子， C 200.7） ， 1个sp3杂化 的季碳。 1H 和13C-NMR数据显示了该化合物有一个蟾酥碱结构单元 （a） 和3-羟基-紫罗 兰酮结构单元 （b） 。通过对二维核磁共振谱图 （HMBC, HMQC, NOESY, 1H-1HCOSY） 的分析， 进 一步确认了蟾酥碱结构单元与 3- 羟基 - 紫罗兰酮结构单元的存在。结构单元 a 与 b 有 两种可能的连接方式 ： 一种b通过氧原子连接a， 另一种则是通过连接N原。
16、子连接a,b。 HMBC 谱图上没有显示明显的相关性， 无法断定结构单元 a 与 b 如何连接。NOESY 谱图中显示出 H-13 与 H-4, H-13 与 H-6 具有相关性， 表示结构单元 b 应该在苯环一侧而不是在吡咯环 一侧， 即结构单元b通过氧原子与a连接。 在 13C-NMR中C-7 的较大化学位移值 （ C165.79） 说 明 书 CN 103922991 A 4 3/6 页 5 也表明结构单元 b 是通过氧原子与 a 连接的 （如果是通过氮原子相连接， C-7 的化学位移 应该是 145.00） 。化合物的立体化学构型通过 NOESY 和计算旋光值来确定， 在 NOESY 。
17、谱图 中可知 H-8 与 H-4, H-8 与 H-6 相关， 显示出 7 -8 位置的双键为 E 构型。绝对构型是 通过比较相似文献得到的， 比对文献 （T. Miyase, et al. Chem. Pharm. Bull. 1988, 36: 2475-2484） ， 发现当 3- 羟基 - 紫罗兰酮类似物的 3 位羟基为 构型时 （S 型） 旋光值一 般为正值， 而为 构型 （R 型） 时旋光值一般为正值， 因此， 确定化合物 1 为 S 构型 以上结构式为化合物 1 的结构及其子片段 a,b。 具体实施方式 0013 本 发 明 是 圆 锥 山 蚂 蝗 枝 叶 中 分 离 的 化 合。
18、 物 及 其 制 备 方 法 和 用 途， 圆 锥 山 蚂 蝗 （Desmodium elegans）枝 叶 中 分 离 出 的 化 合 物，其 化 学 名 为 ： (S,E)-4-(3-(2-(dimethylamino)ethyl)-1H-indol-5-yloxy)-4-(4-hydroxy-2, 6, 6-trimethylcyclohex-1-enyl)but-3-en-2-one， 其俗名为 Desmodeleganine， 其结构经波 谱解析方法确定， 体内外活性实验表明 ： 该化合物在体外具有单胺氧化酶抑制活性， 在体内 具有抗抑郁及抗帕金森作用。 圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物。
19、是从圆锥山蚂蝗枝叶中经过大孔树脂、 MCI、 硅胶柱层 析分离所得， 化学名为 : (S,E)-4-(3-(2-(dimethylamino)ethyl)-1H-indol-5-yloxy)-4 -(4-hydroxy-2, 6, 6-trimethylcyclohex-1-enyl)but-3-en-2-one, 经波谱解析和化学 方法确定其化学结构为 ： 圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物的制备方法， 包括以下步骤 ： （1） 称取粉碎的山蚂蝗枝叶， 加入 6 倍体积 95% 的工业乙醇， 充分混匀， 回流提取 2 小 时， 过滤， 滤渣重复提取一次， 合并收集滤液， 浓缩得到乙醇提取浸膏备用 。
20、； （2） 将乙醇提取浸膏悬浮于 2 倍量的蒸馏水中， 用 2 mol/L HCl 调悬浮水溶液至 pH = 2 3， 静置过夜 ； 抽滤 ； 再用 4 mol/L NaOH 溶液调 pH=10 11， 用氯仿等体积萃取， 减压浓 缩， 得生物碱提取物 ； （3） 将生物碱提取物用 HPD-100 大孔树脂进行柱层析、 以水， 30%、 50%、 70%、 90%、 100% 乙 醇梯度洗脱， 收集 50-70% 洗脱部分 ； 说 明 书 CN 103922991 A 5 4/6 页 6 （4） 将大孔树脂柱层析后的 50-70% 洗脱部分， 浓缩， 用 MCI-gel-CHP-20P 树脂柱。
21、层析， 用水， 30%、 50%、 70%、 90%、 100% 甲醇梯度洗脱， 收集 50-70% 洗脱部分， 浓缩 ； 浓缩物进行硅胶 柱色谱， 三氯甲烷 - 甲醇 (50 1 1 1) 梯度洗脱， 经过 TLC 硫酸乙醇显色剂检测显色， 合并相同组分， 得到该化合物。 0014 圆锥山蚂蝗枝叶中分离的化合物的用途， 该化合物作为单胺氧化酶抑制剂， 用于 制备预防、 治疗抑郁症和帕金森病的药物。 0015 该化合物作为制备抑郁症和帕金森病药物组分之一的用途。 0016 实施例 1 ： 化合物 1 的制备 本发明提供的化合物制备方法， 包括以下步骤 ： 10kg 圆锥山蚂蝗， 研成粉末， 用。
22、 6 倍的 95% 工业乙醇在 80水浴中回流提取 2 次， 每次 2小时。 提取完毕后， 合并乙醇提取液， 过滤， 滤液在减压条件下蒸至浸膏样。 醇提浸膏被悬 浮在2倍量蒸馏水中， 搅匀后悬浮溶液用2mol/L盐酸溶液调至pH=2-3左右。 酸液静置8小 时候后， 过滤， 滤液用 4mol/L 氢氧化钠调至 pH=10-11， 立刻用等体积的氯仿萃取三次， 合 并有机相， 减压条件下蒸干得到生物碱提取物。 共计7.5g。 将山蚂蝗总生物碱进行HPD-100 大孔树脂柱色谱， 依次以水， 30%、 50%、 70%、 90%、 100% 乙醇梯度洗脱， 弃去水洗脱部分， 合并 50% 70% 。
23、洗脱部分。将大孔树脂柱层析后的 50-70% 洗脱部分， 浓缩， 用 MCI-gel-CHP-20P 树脂柱层析， 用水， 30%、 50%、 70%、 90%、 100% 甲醇梯度洗脱， 收集 50-70% 洗脱部分， 浓缩 ； 浓 缩物进行硅胶柱色谱， 三氯甲烷 - 甲醇 (50 1 1 1) 梯度洗脱， 经过 TLC 硫酸乙醇显 色剂检测显色， 合并相同组分， 得到化合物 1。 0017 实施例 2 ： 化合物 1 抗单胺氧化酶活性 利用酶标法测定化合物 1 的抗单胺氧化酶活性， 磷酸异丙烟肼为阳性对照药。具体实 验过程如下 ： （1） 单胺氧化酶的制备 ： 将 1 只雌性 wistar。
24、 大鼠脱颈椎处死， 取出其肝脏， 将肝脏剪碎， 用磷酸盐缓冲液 （pH=7.6） 洗涤数次， 待洗涤干净后， 加入 20ml， 0.3M 蔗糖缓冲液进行匀浆， 充分匀浆后， 各 取 10ml 倒入两个 50ml 离心管中。用 20ml， 0.3M 蔗糖缓冲液洗涤匀浆器后， 各取 10ml 倒入 前面所述的离心管中。经托盘天平配平后， 在 -4下， 1000g 离心 10min。吸取上清液， 将 上清液配平， 1200g离心15min， 吸取上清液， 将上清液配平， 10000g离心30min， 弃去上 清液， 沉淀加4ml的磷酸缓冲液混匀， 得到Wistar大鼠肝脏线粒体浓缩物， 即为实验用单。
25、胺 氧化酶。 0018 （2） 样品对单胺氧化酶抑制活性的测定 ： 运用96孔酶标板测定样品对单胺氧化酶的抑制活性。 在96孔酶标板中依次加入40l 单胺氧化酶 (Wistar 大鼠肝脏线粒体 )， 40l 样品溶液， 40l 磷酸异丙烟肼溶液 （阳性 药） ， 37孵育 20min 后， 加 120l 底物 (2.5mM 的酪胺 ) 及 40l 显色液 (0.5mM 的 4- 氨基 安替吡啉， 1mM 的香草酸， 4U/ml 的辣根过氧化酶的混合物 )。37孵育 60min 后， 用酶标仪 在 490nm 下测定各孔 OD 值。其中， 空白孔 （包含 ： 单胺氧化酶 40l， 磷酸缓冲液 4。
26、0l， 底 物 120l， 显色剂 40l） ， 样品孔 （包含 ： 单胺氧化酶 40l， 样品 40l， 底物 120l， 显色 剂 40l） ， 空白阴性孔和磷酸异丙烟肼对照孔用 120l 磷酸缓冲液 (pH=7.6) 代替 120l 底物。每组实验重复三次， 并以下面公式计算样品对单胺氧化酶的抑制率。 说 明 书 CN 103922991 A 6 5/6 页 7 0019 抑制率 %= 100% 根据量效关系和直线回归法可以计算出样品对单胺氧化酶的半数抑制浓度值 (IC50)。 结果表明新化合物 1 对单胺氧化酶具有明显的抑制活性。又测定了其半数抑制浓度值 (IC50)， 发现该新化合物。
27、 IC50较小， 说明具有强的单胺氧化酶抑制活性。实验数据见表 1。 0020 表 1 山蚂蝗枝叶中新生物碱化合物单胺氧化酶抑制活性 ： 实施例 3 ： 化合物 1 小鼠体内抗抑郁试验 采用小鼠强迫游泳实验评价新化合物 1 的抗抑郁活性。 0021 将昆明种小鼠单个放入水深为 15cm 的玻璃圆筒中 ( 高 40cm 直径 18cm)， 水温 (242)， 水深可稍作调整， 以小鼠后足刚可触及筒底又不足以支撑身体为宜。 初放入时， 小鼠强迫游泳并挣扎向上爬或潜入筒底， 2-3min 后活动逐渐减弱， 出现间歇性不动状态， 且 时间越来越长， 5-6min后不动状态的时间占总时间的80左右， 预。
28、试15 min以后将小鼠烘 干。实验分组 ： 剔除预试中的不合格者， 将合格的 10 只小鼠随机分成 2 组， 每组 5 只， 空白 对照组、 氟西汀阳性对照组每天灌胃给予生理盐水， 受试药物组灌胃给予相应剂量的药物， 各组给药体积均为 0.1mL/lOg， 1 次 /d。灌胃 3d 后， 第 4d 实验前 30min， 除氟西汀阳性对照 组灌胃给予盐酸氟西汀 10mg/kg 外， 其余各组按上述给药不变。灌胃给药后 30min， 把小鼠 放入圆筒中， 观察6min， 记录后4min内小鼠强迫游泳的不动时间。 结果表明， 新化合物1能 明显缩短强迫游泳致抑郁小鼠 4min 内的不动时间， 即能。
29、明显改善抑郁小鼠的行为能力。实 验数据见表 2。 0022 表 2 新化合物 1 对强迫游泳抑郁小鼠行为能力的影响 * ： 与空白对照组比较 PO.O5 采用小鼠强迫游泳实验评价新化合物 1 的抗抑郁活性。 0023 实施例 4 ： 化合物 1 大鼠体内抗帕金森试验 采用旋转实验 ( 帕金森大鼠模型 ) 评价新化合物 1 的抗帕金森作用。 0024 SD 雄性大鼠模型 : 以前囱为准， 根据包新民等著 ( 大鼠脑立体定位图谱 M. 北 京:人民卫生出版社,1991:5)大鼠脑立体定位图谱， 确定右侧黑质两处坐标 ： 前囟后5.2 mm， 正中线右侧1.0mm， 硬膜下9.0 mm ； 前囟后5。
30、.2 mm， 正中线右2.5mm， 硬膜下8.5mm。 在 两处坐标处注射 6-OHDA( 溶于含 O.02抗坏血酸的生理盐水中， 浓度为 2g/L， 每处 3L) 造 模。正常对照组只固定大鼠， 不进行任何处理。10d 后用 APO (0.5mg/kg) 经腹腔注射诱发 说 明 书 CN 103922991 A 7 6/6 页 8 动物向健侧旋转， 记录开始旋转至 30min 内的旋转圈数， 以 2-6 圈 /min 者为合格的轻度损 伤帕金森病模型。将造模成功的 SD 雄性大鼠 14 只， 随机分为模型组， 化合物 1 组 (2 mg/ ml)， 每组 7 只。另纳入正常对照组大鼠 7 只。其中化合物 1 组每日给予 1mL 灌胃， 模型组、 正常对照组给予等量生理盐水灌胃， 持续 10d。实验结束后， 大鼠腹腔注射 APO， 观察神经行 为学变化。结果表明， 化合物 1 能明显缩短 6-OHDA 致帕金森小鼠 30min 内的旋转圈数， 即 能明显改善帕金森大鼠的行为能力。实验数据见表 3。 0025 表 3 新化合物 1 对 6-OHDA 致帕金森小鼠行为能力的影响 * ： 与模型组比较 PO.O5。 说 明 书 CN 103922991 A 8 。