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1、(10)申请公布号 CN 103827136 A (43)申请公布日 2014.05.28 CN 103827136 A (21)申请号 201280047751.8 (22)申请日 2012.09.28 1100722-6 2011.09.30 SE C07K 1/18(2006.01) A61K 38/28(2006.01) B01D 15/08(2006.01) B01D 15/26(2006.01) B01D 15/36(2006.01) B01J 20/285(2006.01) B01J 20/286(2006.01) B01J 20/32(2006.01) C07K 14/06(2。
2、006.01) C07K 14/62(2006.01) (71)申请人 通用电气健康护理生物科学股份公 司 地址 瑞典乌普萨拉 (72)发明人 E. 布雷坎 K. 埃里克斯森 B-L. 约翰逊 J, 沙纳加 (74)专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公 司 72001 代理人 林毅斌 林森 (54) 发明名称 纯化裂解的胰岛素原的方法 (57) 摘要 本发明属于生物分子纯化领域。 更确切地讲， 本发明涉及使用特定种类的具有内核和外部功能 化层的壳珠的色谱纯化胰岛素。所述方法能够以 高流速和超过 90% 的高纯度纯化。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2014.03。
3、.28 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/SE2012/051040 2012.09.28 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2013/048330 EN 2013.04.04 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图4页 (10)申请公布号 CN 103827136 A CN 103827136 A 1/1 页 2 1. 由胰岛素原纯化胰岛素的方法， 所述方法包括以下步骤 ： 将裂解的胰岛素原样品装 载到包含多孔壳珠的色谱介质上， 所述壳珠具有内核和提供有。
4、离子交换配体的外部功能化 层 ； 将胰岛素吸附在所述配体上 ； 和以100-1000cm/h、 优选300-600cm/h的流速从所述色谱 介质上洗脱胰岛素， 其中所述洗脱的胰岛素具有大于 85%、 优选大于 90% 的纯度。 2. 权利要求 1 的方法， 其中该壳珠的直径为 20-100m。 3. 权利要求 1 或 2 的方法， 其中所述壳珠的直径为 40-80m。 4. 权利要求 1、 2 或 3 的方法， 其中所述壳珠的功能化层包括 3-9m 厚的层。 5. 上述权利要求中一项或多项的方法， 其中所述壳珠的功能化层包括 5-7m 厚的层。 6. 上述权利要求中一项或多项的方法， 其中所述。
5、配体为强阳离子交换基团， 诸如磺酸 根 (SO3-)、 硫酸根 (-OSO3-)、 磷酸根 (-OPO32-) 和膦酸根 (PO32-)。 7. 上述权利要求中一项或多项的方法， 其中所述核用诸如琼脂糖、 葡聚糖、 纤维素、 淀 粉、 支链淀粉或完全合成的聚合物的合适极性聚合物填充， 其中所述完全合成的聚合物如 聚丙烯酰胺、 聚甲基丙烯酰胺、 聚 ( 丙烯酸羟基烷基酯 )。 8. 上述权利要求中一项或多项的方法， 其中所述胰岛素在细菌中生成。 权 利 要 求 书 CN 103827136 A 2 1/7 页 3 纯化裂解的胰岛素原的方法 发明领域 0001 本发明属于生物分子纯化领域。更确切地。
6、讲， 本发明涉及使用特定种类的具有内 核和外部功能化层的壳珠的色谱纯化胰岛素。所述方法能够以超过 90% 的非常高的纯度纯 化。 0002 发明背景 胰岛素在细菌 (E.coli) 或酵母中生成。在细菌的情况下， 胰岛素 ( 表达为胰岛素原 ) 在内含体中生成， 经过变性、 重折叠和复性之后通过几个步骤进行纯化。通常， 几个色谱步 骤与过滤步骤、 胰岛素原酶促裂解成胰岛素、 沉淀结晶和配制步骤结合。 在酵母表达体系的 情况下， 不形成内含体， 除此之外， 该过程与细菌的情况十分类似。 0003 胰岛素以每年数吨的产量被制造， 且胰岛素的使用逐年增加。越来越多的人将患 糖尿病， 在发展中国家同样。
7、重要。 胰岛素的需求增加使得必需利用有效的制造方法和工艺。 产率日益重要且获得较高产率的方法通常给出较好的工艺经济性， 转变成更实惠的产品。 承受能力是制造可为更广泛基数的患者所用的产品的关键参数。 这对于不断饱受成本增加 压力的卫生保健部门施加不必要的约束同样重要。 0004 因此， 将期望具有以高产率获得纯产物的用于制造胰岛素的更快更经济的方法。 0005 以前并没有提出使用壳珠色谱纯化胰岛素。 0006 发明概述 本发明提供胰岛素纯化方法， 其中， 与常规方法相比较， 色谱介质的荷载 ( 每毫升色谱 介质荷载的产物克数 ) 可增加三倍， 降低了色谱介质的消耗。这可直接转变成更加成本有 效。
8、的方法。 另外， 在本文所述的色谱步骤中使用壳珠的方法可以较高的速度操作， 使得能够 在给定的时间生成更多产物， 即通过缩短该特定色谱步骤的时间而使得该方法更加经济。 0007 本发明提供使用壳珠用于生物分子纯化的方法， 所述壳珠的特征在于仅在所述珠 的最外层中功能化， 即功能配体仅存在于所述最外层内， 而不存在于所述珠的核中。 可控制 所述功能化层的厚度， 且所述珠的未功能化的核可用例如葡聚糖填充或可以是空的。 0008 具有功能化层的色谱珠具有的潜能是， 具有与小得多的完全功能化的珠相当的分 离度， 同时维持较大珠的较好的压力流动性质。所述壳珠的容量 (capacity) 本质上将由功 能。
9、化的珠的体积分数所反映， 因此将低于同样大小的完全功能化珠的容量。 0009 因此， 本发明涉及由胰岛素原纯化胰岛素的方法， 所述方法包括将裂解的胰岛素 原样品装载到包含多孔壳珠的色谱介质上， 所述壳珠具有内核和提供有离子交换配体的外 部功能化层 ； 将胰岛素吸附在所述配体上 ； 和以100-1000cm/h、 优选300-600cm/h的流速从 所述色谱介质上洗脱胰岛素， 其中所述洗脱的胰岛素具有大于 85%、 优选大于 90% 的纯度。 0010 在所述方法中使用的壳珠的直径为 20-100m， 优选为 40-80m。 0011 所述壳珠的功能化层包括 3-9m 厚的层， 优选为 5-7m。
10、 厚的层。 0012 所述离子交换配体为强阳离子交换基团， 诸如磺酸基 (SO3-)、 硫酸基 (-OSO3-)、 磷 酸基 (-OPO32-) 和膦酸基 (PO32-)。 0013 在一个实施方案中， 所述壳珠的核填充有合适的极性聚合物， 以使得所得核更致 说 明 书 CN 103827136 A 3 2/7 页 4 密， 从而给出较好的分离度(窄峰)。 所述极性聚合物可为琼脂糖、 葡聚糖、 纤维素、 淀粉、 支 链淀粉或完全合成的聚合物， 如聚丙烯酰胺、 聚甲基丙烯酰胺、 聚 ( 丙烯酸羟基烷基酯 )。 0014 附图简述 图 1 为在本发明的纯化方法中使用的壳珠的示意图。 0015 图 。
11、2 为显示使用壳珠色谱法纯化胰岛素的图。 0016 图 3 为床高和流速对在充填了两种不同介质的管柱上的背压的影响。 0017 图 4 为使用商品介质和在本发明中使用壳珠介质纯化胰岛素的比较。 0018 图 5 显示流速对商品介质和在本发明中使用的壳珠介质的影响。 0019 图 6 显示商品介质和壳珠介质的胰岛素纯化的结果。 0020 发明详述 下文将更密切地结合一些非限制性实施例描述本发明。 0021 材料和方法 在本文中提供基于 Sepharose HFA 55 和两种参比原型 / 树脂的三种不同壳珠构建体 的结果 ( 图 1， 表 1)。 0022 在图 1 中从左至右 ： 原型 S6 。
12、： S- 配体在最外层中且核保持未功能化 ； 原型 S20 ： 像 原型 S6 一样， 但核用葡聚糖 T150 (Mp 150,000) 填充 ； 原型 S26 ： 像原型 S20 一样， 但 S- 配 体偶合在葡聚糖增量剂 (Mp 10,000) 上 ； 原型 S12 ： 参比原型， 其中整个珠被功能化 ； 以及， Capto SP ImpRes。前四种原型具有 77m 的粒度， 而 Capto SP ImpRes 具有 40m 的粒度。 0023 表 1. 所试验原型的性质。 0024 制备基于 Sepharose HFA 55 的壳介质 合成原型 S6 烯丙基活化 Sepharose H。
13、FA 55 将 Sepharose HFA 55 在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。称量凝胶 -700ml 排干凝胶 (drained gel) 到三颈圆底烧瓶中。加入 NaOH(/700ml， 50%- 溶液 ) 并开始机械搅拌。将 浆液在水浴中加热到 50。在大约 1 小时之后， 加入 126ml 烯丙基缩水甘油醚 (AGE)。随 后使该浆液在强烈搅拌下过夜。在约 20 小时之后， 将该浆液转移到玻璃过滤器并用蒸馏水 (x4)、 乙醇 (x4) 和蒸馏水 (x4) 洗涤。 0025 烯丙基含量随后经滴定测定 ： 215mol/ml。 0026 壳活化 ( 部分溴化 ) 称量 100ml 烯丙基化。
14、凝胶到烧瓶中， 加入 100ml 蒸馏水。将 0.524ml 溴溶解于 800ml 蒸馏水中， 并加到该烯丙基化凝胶浆液中。该用量的溴应该获得 ( 对应于 ) 约 7.5m 的壳 说 明 书 CN 103827136 A 4 3/7 页 5 厚度。在强烈搅拌下将该溴溶液瞬间加到该烯丙基凝胶浆液中。大约 10 分钟之后， 将该凝 胶在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。 0027 SO3- 基团的壳偶合 将 100ml 该部分溴化的凝胶 ( 参见上文 ) 转移到烧瓶中并与溶解于 100ml 蒸馏水中的 10g 亚硫酸钠混合。在搅拌的同时， 加入 50% NaOH 以使 pH 值达到 12， 接着在 50下。
15、搅拌 16 小时并在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。随后将该凝胶在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。 0028 所附着 SO3- 的基团的量估计为 43mol/ml。 0029 核烯丙基去除 将 50ml S- 壳凝胶 ( 参见上文 ) 与溶解于蒸馏水 (50ml) 中的 20% (v/v) 硫代甘油混 合。将 pH 调节到 10， 接着在 50下搅拌 20 小时。随后将该凝胶在玻璃过滤器上用蒸馏水 洗涤。 0030 合成原型 S12 烯丙基活化 Sepharose HFA 55 将 Sepharose HFA 55 在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。称量凝胶 -700ml 排干凝胶到三 颈圆底烧瓶中。加入 Na。
16、OH (/700ml， 50%- 溶液 ) 并开始机械搅拌。将浆液在水浴上加热到 50。大约 1 小时之后， 加入 245ml 烯丙基缩水甘油醚 (AGE)。随后使该浆液在剧烈搅拌下 过夜。约 20 小时之后， 将该浆液转移到玻璃过滤器并用蒸馏水 (x4)、 乙醇 (x4) 和蒸馏水 (x4) 洗涤。 0031 烯丙基含量随后经滴定测定 ： 290mol/ml。 0032 珠活化 ( 溴化 ) 称量 50ml 烯丙基化凝胶到烧瓶中， 加入 50ml 蒸馏水和 2.0g 乙酸钠。加入溴 ( 饱和 水溶液 ) 直至获得持久的黄色， 接着用甲酸钠破坏过量的溴并在玻璃过滤器上用蒸馏水洗 涤。 0033。
17、 SO3- 基团的壳偶合 将 50ml 溴化的凝胶 ( 参见上文 ) 转移到烧瓶中并与溶解于 25ml 蒸馏水中的 10g 亚硫 酸钠混合。在搅拌的同时， 加入 50% NaOH 以使 pH 值达到 12， 接着在 50下搅拌 18 小时。 随后将该凝胶在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。 0034 所附着的 SO3- 基团的量估计为 103mol/ml。 0035 合成原型 S20 烯丙基活化 Sepharose HFA 55 将 Sepharose HFA 55 在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。称量凝胶 -700ml 排干凝胶到三 颈圆底烧瓶中。加入 NaOH (/700ml， 50%- 溶液 ) 并。
18、开始机械搅拌。将浆液在水浴中加热到 50。大约 1 小时之后， 加入 126ml 烯丙基缩水甘油醚 (AGE)。随后使该浆液在剧烈搅拌下 过夜。约 20 小时之后， 将该浆液转移到玻璃过滤器并用蒸馏水 (x4)、 乙醇 (x4) 和蒸馏水 (x4) 洗涤。 0036 烯丙基含量随后经滴定测定 ： 215mol/ml。 0037 壳活化 ( 部分溴化 ) 称量 100ml 烯丙基化凝胶到烧瓶中， 加入 100ml 蒸馏水。将 0.524ml 溴溶解于 800ml 蒸馏水中并加到该烯丙基化凝胶浆液中。该用量的溴应该获得 ( 对应于 ) 约 7.5m 的壳厚 说 明 书 CN 103827136 A。
19、 5 4/7 页 6 度。在强烈搅拌期间将该溴溶液瞬间加到该烯丙基凝胶浆液中。大约 10 分钟之后， 将该凝 胶在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。 0038 SO3- 基团的壳偶合 将 100ml 该部分溴化的凝胶 ( 参见上文 ) 转移到烧瓶中并与溶解于 100ml 蒸馏水中的 10g 亚硫酸钠混合。在搅拌的同时， 加入 50% NaOH 以使 pH 值达到 12.5， 接着在 50下搅拌 18 小时。随后将该凝胶在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。 0039 所附着的 SO3- 基团的量估计为 43mol/ml。 0040 核活化 ( 溴化 ) 称量 50ml 壳偶合的珠 ( 参见上文 ) 到烧瓶中， 。
20、加入 50ml 蒸馏水和 2.0g 乙酸钠。加入 溴 ( 饱和水溶液 ) 直至获得持久的黄色， 接着用甲酸钠破坏过量的溴并在玻璃过滤器上用 蒸馏水洗涤。 0041 在珠的核中偶合葡聚糖 通过在环境温度下缓慢搅拌 2-4 小时， 将 50g 葡聚糖 (MW ： 150 000g/mol) 溶解于 50ml 蒸馏水中。在搅拌的同时， 加入 6.25ml 50% NaOH。将该溶液在 50下搅拌 16 小时， 随后 在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。 0042 合成原型 S26 烯丙基活化 Sepharose HFA 55 将 Sepharose HFA 55 在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。称量凝胶 -40。
21、0ml 排干凝胶到三 颈圆底烧瓶中。加入 NaOH (400ml， 50%- 溶液 ) 并开始机械搅拌。将该浆液在水浴中加热 到 50。大约 1 小时之后， 加入 72ml 烯丙基缩水甘油醚 (AGE)。随后使该浆液在剧烈搅拌 下过夜。 约20小时之后， 将该浆液转移到玻璃过滤器并用蒸馏水(x4)、 乙醇(x4)和蒸馏水 (x4) 洗涤。 0043 烯丙基含量随后经滴定测定 ： 215mol/ml。 0044 珠活化 ( 溴化 ) 称量 400ml 烯丙基化的珠 ( 参见上文 ) 到烧瓶中， 加入 400ml 蒸馏水和 2.0g 乙酸钠。 加入溴 ( 饱和水溶液 ) 直至获得持久的黄色， 接着。
22、用甲酸钠破坏过量的溴并在玻璃过滤器 上用蒸馏水洗涤。 0045 葡聚糖偶合 通过在环境温度下缓慢搅拌2-4小时， 将320g葡聚糖(MW ： 10 000g/mol)溶解于400ml 蒸馏水中。将 400ml 排干的活化的 HFA 55 珠 ( 参见上文 ) 加到该葡聚糖溶液中， 且将该溶 液在 50下搅拌 1 小时。在搅拌的同时， 加入 50ml 50% NaOH。将该溶液在 50下搅拌 16 小时， 随后在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。 0046 所附着的葡聚糖的量为 17mg/ml。 0047 烯丙基活化葡聚糖改性的 Sepharose HFA 55 将葡聚糖改性的 Sepharose HF。
23、A 55 在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。称量凝胶 -200ml 排干凝胶到三颈圆底烧瓶中。加入 NaOH (200ml， 50%- 溶液 ) 并开始机械搅拌。将该浆液 在水浴中加热到 50。在大约 1 小时之后， 加入 36ml 烯丙基缩水甘油醚 (AGE)。随后使该 浆液在剧烈搅拌下过夜。约 16 小时之后， 将该浆液转移到玻璃过滤器并用蒸馏水 (x4)、 乙 醇 (x4) 和蒸馏水 (x4) 洗涤。 说 明 书 CN 103827136 A 6 5/7 页 7 0048 烯丙基含量随后经滴定测定 ： 220mol/ml。 0049 壳活化 ( 部分溴化 ) 称量 50ml 烯丙基化凝胶到烧瓶。
24、中， 加入 500ml 蒸馏水。将 0.27ml 溴溶解于 50ml 蒸馏 水中并将其加到该烯丙基化凝胶浆液中。该用量的溴应该获得 ( 对应于 ) 约 7.5m 的壳厚 度。在强烈搅拌期间将该溴溶液瞬间加到该烯丙基凝胶浆液中。大约 10 分钟之后， 将该凝 胶在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。 0050 其余烯丙基含量 ( 在珠的核中的烯丙基 ) 为 130mol/ml。 0051 SO3- 基团的壳偶合 将 50ml 该部分溴化的凝胶 ( 参见上文 ) 转移到烧瓶中并与溶解于 100ml 蒸馏水中的 5g 亚硫酸钠混合。在搅拌的同时， 加入 50% NaOH 以使 pH 值达到 12， 接着在 5。
25、0下搅拌 16 小时。随后将该凝胶在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。 0052 所附着的 SO3- 基团的量估计为 50mol/ml。 0053 核活化 ( 溴化 ) 称量 50ml 壳偶合的珠 ( 参见上文 ) 到烧瓶中， 加入 50ml 蒸馏水和 2.0g 乙酸钠。加入 溴 ( 饱和水溶液 ) 直至获得持久的黄色， 接着用甲酸钠破坏过量的溴并在玻璃过滤器上用 蒸馏水洗涤。 0054 在珠的核中偶合葡聚糖 通过在环境温度下缓慢搅拌 2-4 小时， 将 50g 葡聚糖 (MW ： 150 000g/mol) 溶解于 50ml 蒸馏水中。将 50ml 排干的核活化的 HFA 55 珠 (SO3- 基团。
26、附着在壳中 ) 加到该葡聚糖溶液 中， 且将该溶液在 50下搅拌 1 小时。在搅拌的同时， 加入 6.25ml 50% NaOH。将该溶液在 50下搅拌 16 小时， 随后在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。 0055 实验 1 ： 在参比树脂 Capto SP ImpRes 上由裂解的胰岛素原纯化胰岛素 胰岛素由裂解的胰岛素原纯化。存在三种有待除去的污染物 ： 前峰、 截断的胰岛素 (truncated insulin) 和主要污染物。这通过使用参比树脂 Capto SP ImpRes 成功地完成 ( 图 2)。 0056 图 2 显示在 1-ml Capto SP ImpRes (0.5cm 内径。
27、 ) 上的胰岛素纯化。胰岛素进料 浓度为 9mg/ml 树脂， 荷载体积为 2ml。缓冲液 A 为 50mM 乙酸钠， pH 4 + 47.5% 乙醇。缓冲 液 B 为 50mM 乙酸钠， pH 4、 250mM NaCl + 47.5% 乙醇。洗脱梯度为在 10 柱体积中缓冲液 B 以 0-60% 变化。该主要污染物用含有 1M NaCl 的缓冲液 A 洗脱。流速为 0.4ml/min (5 分 钟停留时间 )。显示了 UV 迹线和传导率。 0057 实验 2 ： 在不同壳珠原型上纯化胰岛素与在参比树脂上纯化胰岛素的比较。 0058 在高浓度的乙醇存在下进行纯化， 且由于可能的聚集 / 原纤。
28、维化问题， 荷载相对 较低(约18g/L)。 乙醇的存在给出并不符合需要的相对较高的背压。 因此， 已经研究了使用 较大珠的壳珠构建体 ( 较低背压 ) 以避免压力流动限制的潜在性。在图 3 中显示在 Capto SP ImpRes 和较大壳珠上的背压的比较。 0059 图 3 显示床高和流速对在充填了 Capto SP ImpRes (40m) 及壳珠 S6、 S20 和 S26 (77m)的管柱的背压的影响。 流速0.4ml/min和0.8ml/min分别对应于120cm/h和240cm/ h 的线性流速。 0060 试验壳珠构建体的胰岛素纯化潜能。结果显示用这些壳珠可以将胰岛素纯化到 说。
29、 明 书 CN 103827136 A 7 6/7 页 8 90% 的纯度 ( 用原型 S20)( 图 4)。正如所料， 在完全功能化的参比原型 S12 上的分离度比 在壳珠原型上的分离度差得多。 0061 图 4 显示在 1-ml Capto SP ImpRes (0.5cm 内径 ) 上纯化胰岛素和在 2-ml 壳珠 原型 (0.5cm 内径 ) 上纯化胰岛素的比较。胰岛素进料浓度为 9mg/ml 树脂， 荷载体积为 2ml (Capto SP ImpRes) 或 4ml( 壳珠原型 )。缓冲液 A 为 50mM 乙酸钠， pH 4 + 47.5% 乙醇。缓 冲液 B 为 50mM 乙酸钠。
30、， pH 4、 250mM NaCl + 47.5% 乙醇。洗脱梯度为在 10 柱体积中缓冲 液 B 以 0-60% 变化。该主要污染物用含有 1M NaCl 的缓冲液 A 洗脱。对于壳珠原型， 停留 时间为 2.5 分钟 (240cm/h)， 而对于 Capto SP ImpRes， 停留时间为 5 分钟。 0062 实验 3 ： 在壳珠原型和参比树脂上， 流速对从污染物中分离出胰岛素的影响 该分离在参比树脂 Capto SP ImpRes 上， 分别在 120cm/h 和 240cm/h 的流速下是良好 的。然而， 对于壳珠， 分离在高达 480cm/h 的流速下良好 ( 图 5)。在壳珠。
31、上在高达 480cm/h 的流速下纯度 90%。 0063 图 5 显示研究在 Capto SP ImpRes 和壳珠原型 (S20) 上流速的影响。对于两种树 脂， 柱体积为 2ml。胰岛素进料浓度为 9mg/ml 树脂。荷载体积为 4ml。缓冲液 A 为 50mM 乙 酸钠， pH 4 + 47.5% 乙醇。缓冲液 B 为 50mM 乙酸钠， pH 4、 250mM NaCl + 47.5% 乙醇。洗 脱梯度为在 15 柱体积中缓冲液 B 以 0-90% 变化。 0064 实验 4 ： 在参考树脂上纯化胰岛素和在用与参比树脂 (Capto SP ImpRes) 相同的 基体 (base m。
32、atrix) 制成的壳珠原型上纯化胰岛素 在上述实验中已经显示如果使用壳珠原理， 在大珠 (77m) 上可实现良好的纯化。 0065 在该实验中， 将壳珠原理应用到 Capto SP ImpRes 的较小珠 (40m) 上。将分别是 2m和5m的两种不同壳厚度功能化。 正如所料， 壳珠原型具有超过Capto SP ImpRes的改 善的分离度 ( 图 6)。 0066 图 6 显示在 Capto SP ImpRes 上纯化胰岛素和在用与 Capto SP ImpRes 相同的基 体制成的壳珠原型上纯化胰岛素。壳珠原型具有分别 2m 和 5m 的功能化层。荷载为在 50mM 乙酸钠， pH 4 。
33、和 10% 乙醇中的 6.5mg 裂解胰岛素 /ml 树脂。洗脱步骤 1 用 50mM 乙酸 钠， pH 4、 170mM NaCl、 50% 乙醇进行。洗脱步骤 2 与洗脱步骤 1 一样， 不同之处在于 NaCl 浓 度为 1M。 0067 结果和讨论 使用来自胰岛素方法的实际数据， 进行在HFA SP壳珠原型和Capto SP ImpRes上获得 的估计产率的比较。 0068 产率计算仅在 CIEX 步骤审核进行。 0069 对于所有模拟， 使用得自 Intelligen Inc. 的 SuperPro Designer， 8.5 版， Build 3。进行该模拟以便在 15g/L 的浓度。
34、下加工胰岛素。选择 15g/L 的浓度作为在该步骤中胰 岛素的平均浓度。对于两种树脂， 产率皆为 85%。模拟使用的床高 ： 20cm。 0070 对于 HFA SP 壳珠原型通过使用 480cm/h 的荷载步骤流速， 对于 Capto SP ImpRes 通过使用 120cm/h 的荷载步骤流速来进行模拟。这对于 HFA SP 壳珠原型产生 2.5 分钟的 停留时间 (RT)， 对于 Capto SP ImpRes 产生 10 分钟的停留时间 (RT)。除了在再生 /CIP 步 骤中对两种树脂均设定在限定的时间 ( 即 15 分钟 )， 对于 HFA SP 壳珠原型， 所有其他流速 都设定到。
35、 600cm/h， 对于 Capto SP ImpRes， 所有其他流速都设定到 250cm/h。对于两种树 说 明 书 CN 103827136 A 8 7/7 页 9 脂， 使用 20g 胰岛素 /L 树脂的工作 / 有效容量。 0071 模拟的精加工步骤 (polishing step) 包括以下操作 ： 平衡 ： 对于 Capto SP ImpRes， 4CV ； 对于 HFA SP 壳珠， 2CV 荷载 ： 50g 胰岛素 /L 树脂 洗涤 ： 3CV 洗脱 ： 15CV 梯度 0-70% 25CV 和 3CV 100% CIP ： 15 分钟 再平衡 ： 对于 Capto SP I。
36、mpRes， 4CV ； 对于 HFA SP 壳珠， 2CV。 0072 使用HFA SP壳珠原型的工艺的操作时间为1小时8分钟， 而包括Capto SP ImpRes 的工艺耗时 2 小时 39 分钟。表 1 显示得自这两种模拟的结果。 0073 表 1. 在产率模拟的结果。 0074 基于这些模拟组可见， 与 Capto SP ImpRes 相比， 采用 HFA SP 壳珠原型的产率大 致翻倍。 说 明 书 CN 103827136 A 9 1/4 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103827136 A 10 2/4 页 11 图 3 说 明 书 附 图 CN 103827136 A 11 3/4 页 12 图 4 说 明 书 附 图 CN 103827136 A 12 4/4 页 13 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103827136 A 13 。