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1、(10)申请公布号 CN 103848848 A (43)申请公布日 2014.06.11 CN 103848848 A (21)申请号 201410057192.X (22)申请日 2014.02.20 C07D 498/18(2006.01) (71)申请人 浙江万马药业有限公司 地址 311305 浙江省杭州市临安市青山湖街 道王家山路 1 号 (72)发明人 单瑞平 桂盼 孙克 张平 郑淑芳 何煜 (74)专利代理机构 浙江杭州金通专利事务所有 限公司 33100 代理人 向庆宁 (54) 发明名称 一种他克莫司已知杂质双烯他克莫司的制备 方法 (57) 摘要 本发明公开了一种他克莫司。
2、已知杂质双烯他 克莫司 (Tacrolimusdiene) 的制备方法， 包括以 他克莫司为原料药， 通过消除反应、 纯化、 重结晶 等反应， 制备双烯他克莫司 (Tacrolimusdiene)。 通过对他克莫司杂质的合成， 为他克莫司杂质的 定性及定量分析提供对照品， 从而建立他克莫司 的质量标准， 为他克莫司的质量研究、 安全用药等 提供重要的指导意义。 且本发明具有合成路线短， 操作简单， 所的产品纯度高， 可应用于质量标准、 对照品研究等特点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 10 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利。
3、要求书1页 说明书6页 附图10页 (10)申请公布号 CN 103848848 A CN 103848848 A 1/1 页 2 1. 一种已知杂质双烯他克莫司的制备方法， 其特征在于经过以下步骤 ： （1） 以他克莫司 （Tacrolimus） 为起始原料， 在催化剂存在下于一种有机试剂中发生消 除反应生成双烯他克莫司， 反应体系的温度为 70-80oC; （2） 用柱层析层析步骤 1 所获得的产物并获得粗品双烯他克莫司， 洗脱剂为正己烷和 丙酮的混合溶剂 ; （3） 粗品杂质用正己烷和丙酮的混合溶剂重结晶数次， 获得纯品杂质。 2. 根据权利要求 1 的所述的制备方法， 其特征在于， 步。
4、骤 （1） 中， 所述他克莫司与催化 剂的摩尔比为 10:1-1:1。 3. 根据权利要求 1 的所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 （1） 中， 所述催化剂为对甲基 苯磺酸， 甲烷磺酸、 苯磺酸中的一种或几种。 4. 根据权利要求 1 的所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 （1） 中， 所述的一种有机溶剂 为无水甲苯、 二甲苯、 四氢呋喃中的一种或几种。 5. 根据权利要求 1 的所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 （2） 中， 所述的洗脱剂， 正己烷 与丙酮混合溶剂体积比为 1:1-8:1。 6. 根据权利要求 1 的所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 （3） 中， 所述的混合溶剂。
5、， 正己 烷与丙酮混合溶剂体积比为 1:1-1:4。 权 利 要 求 书 CN 103848848 A 2 1/6 页 3 一种他克莫司已知杂质双烯他克莫司的制备方法 技术领域 0001 本发明属于药物化学领域， 具体涉及一种他克莫司已知杂质Tacrolimus diene的 制备方法。 背景技术 0002 他克莫司 （tacrolimus） 即 FK506， 是由日本藤泽制药公司于 1982 年提取的一种真 菌代谢产物， 是 1985 年从链球菌的发酵液中提取的大环类代谢产物。他克莫司是全球首个 获批准的非皮质类固醇类外用免疫调节剂， 所谓局部免疫调节剂， 是通过刺激皮肤局部的 免疫因子而产。
6、生治疗作用的一类药物。由于这类药物为局部外用， 不具有系统性的免疫抑 制作用， 因此不良反应小。 0003 他克莫司对 T 细胞具有选择性的抑制作用， 主要是通过抑制 TH 细胞释放 IL-2、 IL-3、 IFN-， 以及抑制 IL-2R 的表达而发挥其强大的免疫抑制作用。是世界上非激素治疗 特异性皮炎 （AD） 的第一种外用免疫调节剂。适用于防治器官移植后的排斥反应， 其临床疗 效是环孢菌素 A（CsA） 的 100 倍。 0004 1993 年首次在日本上市， 1994 年获 FDA 批准， 现已在 50 多个国家和地区上市销 售。在中国上市的有胶囊、 注射液、 软膏以及滴眼液。目前他克。
7、莫司软膏获批 (FDA、 CFDA 批 准 ) 的适应症是因潜在危险而不宜使用传统疗法 , 或对传统疗法反应不充分， 或无法耐受 传统疗法的中至重度特应性皮炎患者， 作为短期或间歇性长期治疗。其中 0.03% 他克莫司 软膏被批准用于2岁的儿童及成人AD患者， 0.1%他克莫司软膏被批准用于成人AD患者 ； 他克莫司胶囊、 注射液的适应症为 （1） 预防肝脏或肾脏移植术后的移植物排斥反应 （2） 治 疗肝脏或肾脏移植术后应用其他免疫抑制药物无法控制的移植物排斥反应。 0005 对他克莫司杂质的相关研究意义非常重大， 他可以用于他克莫司研发生产中杂质 的定性及定量分析， 从而建立他克莫司的质量标。
8、准， 为他克莫司的质量研究、 对照品研究、 安全用药等提供重要的指导意义。 0006 美国药典 USP37 版他克莫司胶囊标准收载了他克莫司两个已知杂质双 烯 他 克 莫 司，其 中 (Tacrolimus diene) 化 学 名 称 分 别 为 ： (14E,18E)-17- 烯 丙 基 -1- 羟基 -12-(E)-2-(4- 羟基 -3- 甲氧环己基 )-1- 甲基乙烯基 -23,25- 二甲氧 基-13,19,21,27-四甲基-11,28-二氧杂-4-氮杂三环22,3,1,O4,9二十八环-14,18-二 烯 -2,3,10,16- 四酮和 (4E,11E)-10- 烯丙基， 其结。
9、构式如下 ： 0007 说 明 书 CN 103848848 A 3 2/6 页 4 发明内容 0008 本发明的目的是提供克莫司已知杂质双烯他克莫司的制备方法。 0009 一方面， 本发明的目的可以通过以下方法达到。 0010 已知杂质双烯他克莫司 （Tacrolimus diene） 的制备方法， 其特征在于经过以下步 骤 ： 0011 0012 （1） 、 以他克莫司 （Tacrolimus） 为起始原料， 在催化剂存在下与一种有机试剂中发 生消除反应生成双烯他克莫司， 反应体系的温度为 70-80， 获得双烯他克莫司粗品。 0013 （2） 、 用柱层析获得粗品双烯他克莫司， 洗脱剂为。
10、正己烷和丙酮的混合溶剂。 0014 （3） 、 粗品杂质用正己烷和丙酮的混合溶剂重结晶数次， 获得纯品杂质。 0015 在一些优选的方式中， 在步骤 （1） 中， 所述他克莫司与催化剂的摩尔比为 10:1 1:1。 优选为5:1。 优选的， 所述催化剂为对甲基苯磺酸， 甲烷磺酸、 苯磺酸中的一种或几种。 优选的为对甲基苯磺酸。 0016 在一些优选的方式中， 在步骤 （1） 中， 所述的一种有机溶剂为无水甲苯、 二甲苯、 四 氢呋喃中的一种或几种。优选无水甲苯。 0017 在一些优选的方式中， 在步骤 （2）中， 所述的正己烷与丙酮混合溶剂体积比为 1:1 8:1。优选的体积比为 4:1。 0。
11、018 在一些优选的方式中， 在步骤 （3） 中， 所述的混合溶剂， 正己烷与丙酮混合溶剂体 积比为 1:1 1:4。优选体积比为 1:2。 0019 本发明以他克莫司为原料， 通过消除反应、 纯化、 重结晶等反应， 制备双烯他克莫 说 明 书 CN 103848848 A 4 3/6 页 5 司 （Tacrolimus diene） 。通过对他克莫司杂质的合成， 为他克莫司杂质的定性及定量分析 提供对照品， 从而建立他克莫司的质量标准， 为他克莫司的质量研究、 安全用药等提供重要 的指导意义。 附图说明 0020 图 1.Tacrolimus diene（双烯他克莫司） 红外光谱图。 002。
12、1 图 2.Tacrolimus diene（双烯他克莫司） 紫外光谱图。 0022 图 3.Tacrolimus diene（双烯他克莫司） 核磁共振氢谱。 0023 图 4.Tacrolimus diene（双烯他克莫司） 核磁共振碳谱。 0024 图 5.Tacrolimus diene（双烯他克莫司） 核磁共振 1H-1H COSY 谱。 0025 图 6.Tacrolimus diene（双烯他克莫司） 核磁共振 NOESY 谱。 0026 图 7.Tacrolimus diene（双烯他克莫司） 核磁共振 HSQC 谱。 0027 图 8.Tacrolimus diene（双烯他克。
13、莫司） 核磁共振 HMBC 谱。 0028 图 9.Tacrolimus diene（双烯他克莫司） ESI 图。 0029 图 10.Tacrolimus diene（双烯他克莫司） HPLC 图。 0030 有益效果 0031 本发明具有合成路线短， 操作简单， 所的产品纯度高， 可应该用于质量标准、 对照 品研究等特点。 0032 具体实施案例 0033 实施例一 ： Tacrolimus diene（双烯他克莫司） 的制备 0034 1、 Tacrolimus diene（双烯他克莫司） 的制备方法 0035 (1) 将原料他克莫司 （30g,37.3mmol） 溶于无水甲苯 （750。
14、ml） ， 氮气保护下， 加入对 甲基苯磺酸 （1.5g,7.44mmol,0.2eq） ， 将反应液加热到 75， 反应 0.5 1 小时， TLC（薄层 色谱） 监控反应进行， 点板显示原料点消失， 停止反应。 0036 (2) 当原料消失后， 将反应液冷却到室温后， 然后再控制水浴 70时旋蒸除去溶 剂， 得到粘稠油状物， 粘稠油状物用柱层析 （洗脱剂为正己烷 ： 丙酮 4 ： 1） 纯化， 得到白色 的发泡状固体粗品。 0037 (3) 固体粗品再用丙酮 / 正己烷 （2 ： 1）重结晶两次， 得到双烯他克莫司 （Tacrolimus diene） 的白色固体 （7g， HPLC 纯度。
15、 ： 98.31） , 收率为 ： 24。 0038 2. 结构确证 0039 2.1 红外光谱 0040 测试条件 ： KBr 压片法 0041 测试结果 ： 主要的吸收峰及归属列于表 1， 谱图见图 1。 0042 表 1、 红外光谱数据列表 0043 说 明 书 CN 103848848 A 5 4/6 页 6 0044 2.2 紫外光谱 0045 测试条件 ： 溶剂为乙腈， 扫描范围 （200nm-800nm） 。 0046 测试结果 ： 紫外光谱显示在230nm和325nm处有最大吸收。 紫外吸收光谱见图2。 0047 2.3 核磁共振谱 0048 测试条件 ： 溶剂为 CDCl3 。
16、0049 测试项目 ： 1H-NMR,13C-NMR,1H-1H COSY,HSQC,HMBC,NOESY 0050 测试结果 ： 样品 NMR 谱图见图 3-8， 归属情况列于表 2。 0051 表 2、 核磁共振氢谱、 碳谱数据列表 0052 0053 说 明 书 CN 103848848 A 6 5/6 页 7 0054 2.4ESI-MS 0055 测试条件 ： Interface:350， DL Temperature:250 ,Nebulizing Gas:1.5L/ min,Heat Block:200 , 质量范围 100-1000 0056 结果分析 ： 样品的 ESI-MS。
17、 报告见图 9， ESI-MS 观测到的主要离子归属为 m/ z=809(M+Na+),m/z=769(M-OH+)。 0057 2.5 纯度测定 0058 测试条件 ： 0059 流动相 :A: 水 (0.1%TFA)B: 乙腈 (0.1%TFA) 0060 梯度 :0min50%B,3min50%B,20min90%B,23min90%B,24min50%B,30min stop 0061 流速 :1.5ml/min 0062 色谱柱 :Waters X Bridge-C18,4.6150mm,3.5m 0063 柱温 :55 0064 测试结果 ： HPLC 报告见图 10， 样品平均纯。
18、度 98.31%。 0065 3. 结论 0066 样品的质谱 ESI-MS m/z809M+Na+ 推测它的分子式为 C44H67NO11； 通过化合 物的 1H NMR 和13C NMR 的数据与文献对照 （Journal of Antibiotics(2012)00,1-6） ， 23、 24 号 碳 化 学 位 移 基 本 一 致 23 号 碳 H为 6.1 与 24 号 碳 H为 6.80， 可 以 确 定 23 号与 24 号碳之间形成双键。结合核磁共振、 质谱等数据结果以及文献报道 （Journal of Antibiotics(2012)00,1-6）确定了本发明的方法合成的结。
19、构就是预期 的结构 (14E,18E)-17- 烯丙基 -1- 羟基 -12-(E)-2-(4- 羟基 -3- 甲氧环己基 )-1- 甲 基乙烯基 -23,25- 二甲氧基 -13,19,21,27- 四甲基 -11,28- 二氧杂 -4- 氮杂三环 22,3,1,O4,9 二十八环 -14,18- 二烯 -2,3,10,16- 四酮和 (4E,11E)-10- 烯丙基， 而且 其纯度很高为 98.31%。 。其光谱数据为 ： IR(KBr)max cm-1： 3468.60， 2933.56， 2826.19， 1744.31， 1691.19， 1650.31， 1380.65 ； 1H-。
20、NMR(400MHz,CDCl 3) ： 1.55(1H,m,H-17),1. 89(1H,m,H-18),5.07(1H,d,J=9.0Hz,H-20),3.53(1H,m,H-21),6.16(1H,d,J=15. 21Hz,H-23),6.80(1H,dd,J=15.78,5.85Hz,H-24),2.72(1H,m,H-25),5.26(1H,d, J=2.8Hz,H-26),5.08(1H,m,H-28),2.31(1H,m,H-29),1.02(1H,d,J=6.5Hz,H-35) 说 明 书 CN 103848848 A 7 6/6 页 8 ,0.99(1H,d,J=6.5Hz,。
21、H-36),2.20-2.47(1H,m,H-38),5.69(1H,m,H-39),4.97( 1H,m,H-40),0.94(1H,d,J=6.5Hz,H-41),1.65(1H,s,H-37,42);13C-NMR(400MHz,CDC l3):27.35,48.89,123.18,51.39,127.80,148.13,38.78,79.86,131.50,35.06,12.90,14 .74,16.09,15.93,14.66,36.57,136.54,116.68,56.94,56.75,56.51; 正 离 子 ESIMS:m/ z809M+Na+,m/z769M-OH+， ES。
22、IMS:m/z809C44H67NO11Na+。 说 明 书 CN 103848848 A 8 1/10 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 103848848 A 9 2/10 页 10 图 2 说 明 书 附 图 CN 103848848 A 10 3/10 页 11 图 3 说 明 书 附 图 CN 103848848 A 11 4/10 页 12 图 4 说 明 书 附 图 CN 103848848 A 12 5/10 页 13 图 5 说 明 书 附 图 CN 103848848 A 13 6/10 页 14 图 6 说 明 书 附 图 CN 103848848 A 14 7/10 页 15 图 7 说 明 书 附 图 CN 103848848 A 15 8/10 页 16 图 8 说 明 书 附 图 CN 103848848 A 16 9/10 页 17 图 9 说 明 书 附 图 CN 103848848 A 17 10/10 页 18 图 10 说 明 书 附 图 CN 103848848 A 18 。