用于治疗呈现存活蛋白抗原的肿瘤的组合物和方法.pdf

本发明提供了疫苗组合物，其在人中刺激对人存活蛋白的免疫应答，因此攻击过量表达存活蛋白的肿瘤患病细胞。具体地，本发明提供了疫苗组合物，其包含来自非哺乳动物存活蛋白以及来自修饰的哺乳动物的特别是人的存活蛋白的肽。

权利要求书
1.   用于针对过表达人存活蛋白的肺癌细胞免疫患者的疫苗，其包含:
（a）来自突变的鸡存活蛋白的肽或编码所述肽的核酸，其中所述突变的鸡存活蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:12，和
（b）任选地佐剂，
所述疫苗在人中引起针对人存活蛋白的免疫应答。

2.   权利要求1的疫苗，其中所述疫苗能够活化T细胞，所述T细胞识别与MHC分子复合时的人存活蛋白肽序列，其中所述人存活蛋白肽序列选自下列肽:LTLGEFLKL、CPTENEPDL和EPDLAQCFF。

3.   权利要求1或2的疫苗，其中所述肽与Fc部分融合。

4.   权利要求1－3任一项的疫苗，其中所述疫苗另外编码或包括选自IL‑2、IL‑7、IL‑12、IL‑18、IL‑21、IL‑23和GM‑CSF的细胞因子。

5.   权利要求1‑4任一项的疫苗，其中编码所述肽的核酸包含哺乳动物启动子。

6.   权利要求5的疫苗，其中所述核酸是裸DNA。

7.   权利要求1‑6任一项的疫苗，其中用增强哺乳动物细胞转染的试剂配制所述核酸。

8.   权利要求1‑7任一项的疫苗，其中所述核酸是病毒颗粒的部分。

9.   权利要求8的疫苗，其中所述病毒颗粒是腺病毒颗粒。

10.   权利要求1‑9任一项的疫苗，其中所述疫苗包含含有所述核酸的细菌。

11.   权利要求10的疫苗，其中所述细菌是沙门氏菌。

12.   权利要求1‑11任一项中说明的疫苗的用途，用于生产针对过量表达人存活蛋白的肺癌细胞免疫患者的药物。

13.   用于治疗肺癌的疫苗，其包含
(a)突变的鸡存活蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:12，和
(b)任选地佐剂，
所述疫苗在人中引起针对人存活蛋白的免疫应答。

说明书用于治疗呈现存活蛋白抗原的肿瘤的组合物和方法
本申请是申请日为2006年9月27日、发明名称为“用于治疗呈现存活蛋白抗原的肿瘤的组合物和方法”的中国专利申请200680034598.X(国际申请号PCT/EP2006/009359)的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于肿瘤治疗的疫苗接种方案。具体地，本发明涉及疫苗组合物，其在人中刺激对人存活蛋白的免疫应答，因此攻击过量表达存活蛋白的肿瘤患病细胞。具体地，本发明涉及疫苗组合物，其包含来自非哺乳动物存活蛋白以及来自修饰的哺乳动物的特别是人的存活蛋白的肽。
背景技术
免疫系统通过监控细胞的蛋白质组成来部分地实现了其监视功能。在称作T细胞抗原呈递的过程中，细胞内的蛋白质被加工为肽。加工的肽的亚组（抗原）被运出至细胞表面，与一类受体的成员特异性结合，所述一类受体被称作主要组织相容性复合体（MHC）受体。这些MHC肽复合体通过与已知为T细胞受体（TCR）的T细胞表面蛋白质相互作用，由特化的免疫细胞T细胞取样。每个给定的T细胞在其表面携带独特的TCR。当T细胞的TCR与MHC‑肽复合体产生性相互作用时，免疫应答被活化，这导致呈递特定MHC‑肽复合体的细胞的消除。通常，如果呈递的抗原来自宿主（所谓的“自身”抗原），相互作用为非生产性的。一般地，免疫应答由与来自外源蛋白质的抗原的相互作用来活化，例如与来自感染病毒的组成性蛋白质的抗原相互作用来活化。
通过活化免疫治疗肿瘤的目的是诱导免疫系统识别和消除肿瘤细胞。正如在任何其他细胞中，肿瘤细胞上的肽抗原来自表达的蛋白质的所有组成成分（repertoire）。正如病毒抗原在受感染的细胞中一样，来自肿瘤中差别表达的蛋白质的肿瘤富含的抗原原则上是免疫监视的靶标。因此，为了消除肿瘤的目的，所述抗原可以被用来控制免疫系统的分支，其已经被进化为对抗细胞内感染。
一种此类肿瘤富含的蛋白质是存活蛋白。肿瘤细胞通常过量表达存活蛋白蛋白质，这被认为阻断了细胞凋亡并且因此干扰阻止肿瘤细胞异常生长的机制。另一方面，正常细胞表达非常少的存活蛋白。（见例如，Ambrosini等人，（1997）Nat.Med.,3:917‑921）。因此，存活蛋白是理想的肿瘤特异性或肿瘤富含的抗原。可以有用地将存活蛋白蛋白质的抗原形式递送到抗原呈递细胞，从而可以刺激对存活蛋白的免疫应答。但是，与病毒感染的细胞相反，存活蛋白与许多其他在肿瘤中差别表达的蛋白质类似，是宿主蛋白质，并且不活化免疫系统。因此，在本领域中仍需要开发引发针对肿瘤细胞，特别是特征为过量表达存活蛋白的那些肿瘤细胞的有效免疫应答的有效组合物和方法。
发明概述
本发明提供了引发针对肿瘤细胞的有效免疫应答的有效组合物和方法。具体地，本发明提供了使用肿瘤富含的蛋白质的抗原形式作为T细胞抗原的接种方案。特别地，本发明提供了肿瘤富含的蛋白质存活蛋白的抗原形式。
因此，本发明一方面涉及包含核酸的疫苗，所述疫苗编码至少一种来自非哺乳动物存活蛋白的肽。备选地，本发明涉及包括至少一种来自非哺乳动物存活蛋白的肽的疫苗。如本文所用的，“非哺乳动物存活蛋白”包括至少任何具有BIR结构域（或IAP结构域）的存活蛋白蛋白质，所述结构域与人存活蛋白BIR结构域具有多于50%的氨基酸同一性但是少于90%的氨基酸同一性，例如与人存活蛋白BIR结构域具有至少55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%的同一性。“非哺乳动物存活蛋白”还包括在本领域普通技术人员已知的非哺乳动物物种中鉴定的任何存活蛋白蛋白质。如本文所用的，“肽”包括具有任何数量氨基酸的肽，包括全长存活蛋白蛋白质。特别地，肽可以包含至少8、9、10、15、20、25、30或更多个氨基酸。
在一个优选的实施方案中，本发明的疫苗包括编码来自非哺乳动物存活蛋白的肽的核酸。核酸可以包括哺乳动物启动子。在一个实施方案中，核酸是裸DNA。在另一个实施方案中，核酸是用增强哺乳动物细胞转染的试剂配制的。本发明的疫苗还可以包括佐剂。
在一个实施方案中，核酸是病毒颗粒例如腺病毒颗粒的一部分。适合于本发明的腺病毒颗粒包括来自能够复制的腺病毒的那些，或来自条件复制腺病毒（“CRAD”）（仅在某些细胞或仅在某些条件中复制）的那些，或来自无能力复制的腺病毒的那些。其他适当的病毒颗粒包括但不限于来自慢病毒或其他RNA病毒、腺伴随病毒、轮状病毒或痘苗病毒等的病毒颗粒。
在一个实施方案中，疫苗包括含有核酸的细菌。优选地，细菌是肠细菌，如沙门氏菌属（Salmonella）、埃希氏菌属（Escherichia）或克雷伯氏菌属（Klebsiella）。其他细菌（例如利斯特菌属物种（Listeria species））也可以用来作为此类核酸的宿主。细菌可以是野生型细菌或可以包含突变，所述突变例如减轻了其致病性。通常，优选使用细菌的突变形式，例如营养缺陷型。
在另一个优选的实施方案中，本发明的疫苗编码或包括来自非哺乳动物存活蛋白的肽。优选地，来自非哺乳动物存活蛋白的肽包括BIR结构域。通常，来自非哺乳动物存活蛋白的BIR结构域与人存活蛋白BIR结构域具有多于50%的氨基酸同一性，但是少于80%的氨基酸同一性。非哺乳动物存活蛋白来自鸟、鱼、爬行动物、两栖动物或其他脊椎动物。在优选的实施方案中，非哺乳动物存活蛋白来自鸡。
在一些实施方案中，本发明的疫苗编码或包括来自非哺乳动物存活蛋白的肽，其具有促进T细胞抗原呈递的突变。例如，非哺乳动物存活蛋白突变肽可以在对应于人存活蛋白Asn97、Thr99、Val100、或Gln101的位置处包含氨基酸取代。更具体地，来自鸡或其他物种的非哺乳动物存活蛋白可以包含下列氨基酸取代之一：N97E、T99M、V100L或Q101G。在另一实例中，来自蛙SIX存活蛋白的肽包含在等价位置Thr110和/或Ser112的取代。在具体的实例中，来自蛙SIX存活蛋白的肽包含取代Thr110Met和/或Ser112Gly。
在其他实施方案中，本发明的疫苗编码或包含来自非哺乳动物存活蛋白的肽，其具有可能消除BIR结构域生物学活性的突变。例如，来自非哺乳动物存活蛋白的肽可以包含在对应于人存活蛋白Arg18、Cys57、Cys60、His77或Cys84的位置处的至少一个氨基酸取代。
另外，非哺乳动物存活蛋白可以任选地包含氨基酸缺失。在一个实例中，非哺乳动物存活蛋白部分包含C端缺失。在另一个实例中，非哺乳动物存活蛋白包含N端缺失。
在其他实施方案中，本发明的疫苗能够活化T细胞，所述T细胞识别癌细胞上与MHC分子复合的人存活蛋白肽序列。具体地，此类人存活蛋白肽序列可以是例如LTLGEFLKL(SEQ ID NO:1)，CPTENEPDL(SEQ ID NO:2)或EPDLAQCFF(SEQ ID NO:3)。
在一些实施方案中，来自非哺乳动物存活蛋白的肽与Fc部分融合或缀合。优选的Fc部分来自哺乳动物Fc区域，更优选来自人Fc区域。Fc部分可以包含突变，所述突变促进装配，例如用丝氨酸取代IgG1铰合部的序列EPKSCDK(SEQ ID NO:4)中的半胱氨酸。因此，Fc部分可以包含修饰的序列EPKSSDK(SEQ ID NO:5)。Fc部分也可以包含突变，所述突变减少不需要免疫应答的区域的免疫原性，例如，融合蛋白部分之间的接头。
在选择的实施方案中，来自非哺乳动物存活蛋白的肽与效应分子协同作用，所述效应分子有助于免疫应答。例如，此类效应分子可以是细胞因子部分，其包括但不限于IL‑2、IL‑7、IL‑12、IL‑18、IL‑21、IL‑23、GM‑CSF或任何其他细胞因子，特别是能够活化Th1免疫应答的那种。此类效应分子也可以是阻抑免疫系统的细胞因子的抑制剂，例如STAT3抑制剂（例如显性失活STAT3蛋白质，如STAT3β）。细胞因子或其他效应分子还可以包含突变。例如，细胞因子可以在对应于IL‑2的Cys125的位置上包含Ser取代。
因此，在优选的实施方案中，本发明的疫苗包括核酸，所述核酸编码来自非哺乳动物存活蛋白的肽和有助于免疫应答的另一种肽，包括上述效应分子。编码非哺乳动物存活蛋白肽和效应分子肽的区域可以在单个转录单元中，或在两个分离的转录单元中。备选地，本发明的疫苗包括编码来自非哺乳动物存活蛋白的肽的核酸和编码另一肽的分离的核酸，所述另一肽包括上述有助于免疫应答的效应分子。
在另一个实施方案中，本发明的疫苗包括来自非哺乳动物存活蛋白的肽和另一肽，所述另一肽包括上述有助于免疫应答的效应分子。在一个实施方案中，来自非哺乳动物存活蛋白的肽与包括效应分子的肽融合或缀合。非哺乳动物存活蛋白和效应分子融合蛋白质可以另外与上述Fc部分融合或缀合。
在另一方面，本发明涉及疫苗，所述疫苗包括编码修饰的哺乳动物存活蛋白肽的核酸。备选地，本发明涉及疫苗，所述疫苗包括修饰的哺乳动物存活蛋白肽。修饰的哺乳动物存活蛋白肽是生物学惰性的，但是在免疫上实质上与哺乳动物存活蛋白类似。如本文所用的，“生物学惰性”是指存活蛋白肽，其不能实质上行使或影响通常与正常存活蛋白相关的活性。例如，“生物学惰性”存活蛋白肽不具有实质的抗凋亡活性，其也不能实质上干扰通常与内源存活蛋白蛋白质相关的抗凋亡活性。生物学惰性存活蛋白一般不具有实质的显性失活的效应。如本文用到的，“免疫上实质与哺乳动物存活蛋白类似”是指修饰的存活蛋白肽，如与对应于非修饰的哺乳动物存活蛋白肽一样，所述修饰的存活蛋白肽能够引发针对相同靶序列的至少一种免疫应答。可以例如通过响应靶序列的CD8+T细胞群体或CD8+T细胞的IFNγ的释放测量免疫应答。
在一个优选的实施方案中，本发明的疫苗包括编码修饰的哺乳动物存活蛋白肽的核酸。核酸可以包括哺乳动物启动子，在一个实施方案中，核酸是裸DNA。在另一个实施方案中，核酸用增强哺乳动物细胞转染的试剂配制。本发明的疫苗还可以包括佐剂。
在一个实施方案中，编码修饰的哺乳动物存活蛋白肽的核酸是病毒颗粒例如腺病毒颗粒的一部分。适合用于本发明的腺病毒颗粒包括来自能够复制的腺病毒的那些，或来自条件性复制腺病毒（“CRAD”）（其仅在某些细胞或仅在某些条件下复制）的那些，或来自不能复制的腺病毒的那些。其他适当的病毒颗粒包括但不限于来自慢病毒或其他RNA病毒、腺伴随病毒、轮状病毒或痘苗病毒等的病毒颗粒。
在一个实施方案中，疫苗包括含有编码修饰的哺乳动物存活蛋白肽的核酸的细菌。优选地，细菌是肠细菌，例如沙门氏菌属（Salmonella）、埃希氏菌属（Escherichia）或克雷伯氏菌属（Klebsiella）。其他细菌例如利斯特菌属物种（Listeria species）也可以被用于容纳此类核酸。细菌可以是野生型细菌或可以包含突变，所述突变例如削弱了其致病性。通常优选使用细菌的突变形式，例如营养缺陷型。
在另一个优选的实施方案中，本发明的疫苗包括修饰的哺乳动物存活蛋白肽。优选地，修饰的哺乳动物存活蛋白肽包括修饰的BIR结构域。修饰的BIR结构域可以在一定位置上包括至少一个氨基酸取代，所述位置对应于人存活蛋白的Arg18、Cys57、Cys60、His77和Cys84。备选地，或另外，修饰的哺乳动物存活肽包括修饰的螺旋结构域。修饰的螺旋结构域可以在一定位置上包括至少一个氨基酸取代，所述位置对应于人存活蛋白的Lys122、Ala128和Ile135。例如，修饰的螺旋结构域可以在对应于人存活蛋白Ala128的位置上包含Pro。修饰的螺旋结构域还可以在对应于Ile135的位置上包括Pro。修饰的哺乳动物存活蛋白肽优选包含一个或多个I类MHC T细胞表位。例如，修饰的哺乳动物存活肽可以包括氨基酸序列LTLGEFLKL(SEQ ID NO:1)或LMLGEFLKL(SEQ ID NO:6)。
在一些实施方案中，修饰的哺乳动物存活蛋白肽与Fc部分融合。修饰的Fc部分来自哺乳动物Fc区域，更优选来自人Fc区域。Fc部分可以包含改善装配的突变，例如在IgG1铰合部的序列EPKSCDK(SEQ ID NO:4)用丝氨酸取代半胱氨酸。因此，Fc部分可以包含修饰的序列EPKSSDK(SEQ ID NO:5)。Fc部分也可以包含这样的突变，所述突变减少不需要免疫应答的区域的免疫原性，所述区域例如融合蛋白部分之间的接头。
在某些实施方案中，修饰的哺乳动物存活蛋白肽与效应分子协调作用，所述效应分子有助于免疫应答。例如，此类效应分子可以是细胞因子部分，其包括但不限于IL‑2、IL‑7、IL‑12、IL‑18、IL‑21、IL‑23、GM‑CSF或任何其他细胞因子，特别是能够活化Th1免疫应答的一个。此类效应分子也可以是抑制免疫应答的细胞因子的抑制剂，例如STAT抑制剂（例如显性失活的STAT3蛋白质，例如STAT3β）。细胞因子或其他效应分子也可以包含突变。例如，细胞因子可以在对应于IL2的Cys125位置上包含Ser取代。
因此，在优选的实施方案中，本发明的疫苗包括核酸，所述核酸编码修饰的哺乳动物存活蛋白肽和另一种肽，所述另一种肽包括上述有助于免疫应答的效应分子。编码修饰的哺乳动物存活蛋白肽和效应分子肽的区域可以是在单个的转录单元中，或在两个分别的转录单元中。备选地，本发明的疫苗包括编码修饰的哺乳动物存活蛋白肽的核酸和编码包括上述描述的有助于免疫应答的效应分子的另一种肽的分离的核酸。
在其他实施方案中，本发明的疫苗包括修饰的哺乳动物存活蛋白肽和另一种肽，所述另一种肽包括上述的有助于免疫应答的效应分子。在一个实施方案中，修饰的哺乳动物存活蛋白肽与包括效应分子的肽融合或缀合。修饰的哺乳动物存活蛋白肽和效应分子融合蛋白可以另外与上述的Fc部分融合或缀合。
在另一方面，本发明涉及能够引发针对表达人存活蛋白的细胞的免疫应答的核酸。该核酸编码包含氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列与人存活蛋白BIR结构域具有多于50%的同一性，但是少于80%的同一性，并且所述核酸包含能够在哺乳动物细胞中表达肽的启动子。
本发明还涉及治疗方法，包括施用上述疫苗或核酸。具体地，本发明提供了治疗癌症和其他疾病的方法，所述疾病包括不希望的细胞增殖。本发明的治疗方法可以任选地包括其他步骤，例如首先测试表达高水平存活蛋白的患者肿瘤的步骤。另一任选的步骤是在施用本发明的疫苗或核酸之前用温和的免疫抑制剂（例如低剂量的环磷酰胺）预治疗患者。不希望被理论束缚，此类预治疗的一个效果是减少T调节细胞的数量。因此，其他具有类似效果的预治疗也包括在本发明中。
除了存活蛋白，本发明还可以应用于可以用作抗原的多种蛋白质，例如肿瘤特异性抗原、病毒抗原和其他抗原。在肿瘤特异性抗原中，除了存活蛋白，本发明还可以应用于表皮细胞粘着分子，癌基因例如Ras、癌胚抗原和其他肿瘤特异性或肿瘤富含的蛋白质。在病毒抗原中，本发明可以应用于HIV的p24、流行性感冒血凝素、和其他病毒蛋白质。
总体来说，本发明涉及下述：
●用于治疗人中肿瘤和肿瘤相关疾病的疫苗，其包含：
（a）来自非哺乳动物存活蛋白的肽或编码所述肽的核酸，其中所述非哺乳动物存活蛋白包含BIR结构域，其与跨越人存活蛋白的Asp16至Leu87的BIR结构域具有50%至90%的氨基酸同一性，或
（b）来自修饰的哺乳动物存活蛋白的肽或编码所述肽的核酸，其中所述修饰的哺乳动物存活蛋白包含BIR结构域中的突变，所述突变基本上消除了BIR结构域的生物学活性，以及（c）任选地佐剂；所述疫苗引发人中对人存活蛋白的免疫应答。
●相应的疫苗，其中所述由疫苗引起的免疫应答产生攻击表达人存活蛋白的细胞的CD8+T细胞。
●相应的疫苗，其中所述肽来自非哺乳动物存活蛋白。
●相应的疫苗，其中所述BIR结构域与所述人存活蛋白BIR结构域具有50%至80%的氨基酸同一性。
●相应的疫苗，其中非哺乳动物存活蛋白来自鸟、鱼、爬行动物或两栖动物，优选来自鸡。
●相应的疫苗，其中来自非哺乳动物存活蛋白的肽包含一个或多个突变，所述突变促进通过结合至MHC分子的T细胞抗原呈递。
●相应的疫苗，其中非哺乳动物存活蛋白是鸡的，且突变是在鸡存活蛋白的Asn97、Thr99、Val100或Gln101的一个或多个位置处的氨基酸取代。优选的突变是N97E、和/或T99M、和/或V100L、和/或Q101G。
●SEQ ID NO:12的疫苗，其中突变是N97E、T99M、V100L和Q101G。
●相应的疫苗，其中非哺乳动物存活蛋白包含BIR结构域中的突变，所述突变基本上丧失了BIR结构域的生物学活性。
●相应的疫苗，其中所述被消除的生物学活性是细胞凋亡。
●相应的疫苗，其中所述来自非哺乳动物存活蛋白的肽在对应于人存活蛋白Arg18、Pro47、Cys57、Cys60、His77和Cys84的一个或多个位置包含氨基酸取代。
●相应的疫苗，其中疫苗能够活化识别与MHC分子复合时的人存活蛋白肽序列的T细胞，所述人存活蛋白肽序列选自下列肽：LTLGEFLKL、CPTENEPDL和EPDLAQCFF。
●相应的疫苗，其中肽来自修饰的哺乳动物存活蛋白，优选的人存活蛋白。
●相应的疫苗，其中所述来自修饰的人存活蛋白的肽包含人的存活蛋白Arg18、Pro47、Cys57、Cys60、His77和Cys84的一个或多个位置处的氨基酸取代。
●相应的疫苗，其中来自修饰的哺乳动物存活蛋白的肽包含修饰的螺旋结构域，并且在人存活蛋白的Lys122和/或Ala128和/或Ile135的位置包含氨基酸取代。
●相应的疫苗，其中突变至少是Ala128P和/或Ile135P。
●SEQ ID NO:56的疫苗，其包含修饰的人存活蛋白，所述人存活蛋白具有下列突变R18E、P47L、Q56L、H77A、C84A、A128P、和I135P。
●相应的疫苗，其中修饰的哺乳动物存活蛋白肽包含氨基酸序列LTLGEFLKL或LMLGEFLKL。
●相应的疫苗，其中来自非哺乳动物存活蛋白的肽和来自修饰的哺乳动物存活蛋白的肽与Fc部分融合。
●相应的疫苗，其中疫苗另外编码或包括来自效应分子的肽，优选的选自IL‑2、IL‑7、IL‑12、IL‑18、IL‑21、IL‑23和GM‑CSF的细胞因子。
●相应的疫苗，其中编码来自非哺乳动物存活蛋白或来自修饰的哺乳动物存活蛋白的肽的核酸包含哺乳动物启动子，且优选是裸DNA。
●相应的疫苗，其中核酸与增强哺乳动物细胞转染的试剂一起配制。
●相应的疫苗，其中核酸是病毒颗粒的部分，优选腺病毒颗粒的部分。
●相应的疫苗，其中疫苗包含含有核酸的细菌，其中细菌优选是肠细菌，更优选是沙门氏菌属。
●用于针对过量表达存活蛋白的肿瘤细胞免疫人的药物组合物，其包含在权利要求和说明书中说明的疫苗，任选地与可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起。
●相应的疫苗的用途，其用于制备针对过量表达人存活蛋白的肿瘤细胞免疫患者的药物。
附图简述：
图1是存活蛋白同源物的蛋白质序列的比对。比对通过Clustal W方法进行（见Thompson等人,(1994)Nucl.Acid Res.22:4673‑4680）。序列从NCBI数据库获得，使用下列检索号：人存活蛋白（检索号:NM_001168,SEQ ID NO:8），狗存活蛋白（NP_001003019,SEQ ID NO:9），猪存活蛋白（NP_999306,SEQ ID NO:39），奶牛存活蛋白（NP_001001855,SEQ ID NO:40），猫存活蛋白（NP_001009280,SEQ ID NO:41），小鼠存活蛋白（NP_033819,SEQ ID NO:10），大鼠存活蛋白（AAF82586,SEQ ID NO:42），猩猩存活蛋白（CAH91231,SEQ ID NO:43），鸡存活蛋白（NP_001012318,SEQ ID NO:11），光滑爪蟾（Xenopus laevis）SIX(AAO20085,SEQ ID NO:13)、光滑爪蟾存活蛋白同源物（AAM76714,SEQ ID NO:46）、光滑爪蟾存活蛋白同源物2（AAH89271,SEQ ID NO:47）、鲶鱼存活蛋白同源物（CK419466,SEQ ID NO:52）、斑马鱼存活蛋白同源物（NP_919378,SEQ ID NO:48），斑马鱼存活蛋白同源物2（NP_660196,SEQ ID NO:49），河豚鱼存活蛋白样同源物（CAG04432,SEQ ID NO:50）、和河豚鱼存活蛋白样同源物2（CAG07433,SEQ IDNO:51）。BIR结构域下划线；星号指示了涉及Zn配位的标记残基；破折号指示了比对中的空位。在非人序列中，与人残基相同的残基以句号表示；其他残基以单字母氨基酸密码子表示。
图2是多种存活蛋白同源物的BIR结构域比较的氨基酸同一性百分比的表。序列1是人序列；序列2来自狗；序列3来自猪；序列4来自奶牛；序列5来自猫；序列6来自小鼠；序列7来自大鼠；序列8来自猩猩；序列9来自鸡；序列10来自蛙属的光滑爪蟾SIX蛋白质；序列11来自蛙属光滑爪蟾同源物；序列12来自蛙属光滑爪蟾同源物2；序列13来自鲶鱼同源物；序列14来自斑马鱼同源物；序列15来自斑马鱼同源物2；序列16来自河豚鱼存活蛋白样蛋白质1；并且序列17来自河豚鱼存活蛋白样蛋白质2。
图3是来自脊椎动物的BIR结构域序列与人存活蛋白的比对。人存活蛋白BIR结构域序列显示在SEQ ID NO:63中。比对通过ClustalW方法进行（见Thompson等人（1994），Nucl.Acid Res.22:4673‑4680）。序列从NCBI数据库获得，使用下列检索号：人存活蛋白（NM_001168,BIR结构域序列，显示在SEQ ID NO:63中），黑腹果蝇（D.melanogaster）(AAF55399,BIR结构域同源物，显示在SEQ ID NO:53中)和线虫（C.elegans）(NP_505949,BIR结构域同源物，显示在SEQ ID NO:54中)。BIR结构域加下划线；星号指示了涉及Zn配位的标记残基；破折号指示了比对中的空位。在非人序列中，与人残基相同的残基以句号表示；其他残基以单字母氨基酸密码子表示。
图4是用带有编码存活蛋白多肽的质粒的沙门氏菌接种DNA的模式的图示。肠腔中的沙门氏菌通过集合淋巴小结的M细胞侵入肠上皮。一旦穿过上皮，沙门氏菌侵入细胞例如巨噬细胞和树突细胞。细菌死亡并且质粒转移使得质粒通过巨噬细胞表达，导致来自编码的存活蛋白多肽的肽在I类MHC分子中呈递。另外，通过树突细胞对表达存活蛋白多肽的凋亡巨噬细胞的摄取导致由于肽在I类MHC和II类MHC分子中的呈递而得到的交叉引发。
图5是柱状图，其描述了暴露给癌细胞时从存活蛋白接种的小鼠分离的T细胞的IFNγ释放。IFNγ释放在酶联免疫斑点（ELISpot）测定中测量。C57B1/6小鼠用携带鼠或鸡存活蛋白表达质粒的沙门氏菌接种，或不接种（x轴），在T细胞暴露给B16/KSA（条纹柱）或LLC/KSA(黑柱)癌细胞系后，测量每5×105个平板接种细胞的IFNγ点数。
图6是柱状图，其描述了分离自存活蛋白接种的小鼠的T细胞暴露给癌细胞时的IFNγ释放，所述T细胞。IFNγ释放在酶联免疫斑点测定中测量。Balb/c小鼠用携带鼠或鸡存活蛋白表达质粒的沙门氏菌接种，或不接种（x轴），在T细胞暴露给4T1/KSA（条纹柱）或A20(黑柱)癌细胞系后，测量每5×105个平板接种细胞的IFNγ点数。
图7是用沙门氏菌SL7207鸡存活蛋白或鼠存活蛋白接种的小鼠的存活图。存活Balb/c小鼠（y轴）的百分比针对小鼠的CT26/KSA攻击后的天数（x‑轴）作图，所述小鼠用携带有鼠存活蛋白（实心三角）或鸡存活蛋白（实心方块）或PBS(实心菱形)表达质粒的沙门氏菌接种。
图8是用沙门氏菌SL7207鸡存活蛋白或鼠存活蛋白接种的小鼠的存活图。存活C57B1/6小鼠（y轴）的%针对小鼠的LLC/KSA攻击后的天数（x‑轴）作图，所述小鼠用携带有鼠存活蛋白（实心三角）或鸡存活蛋白突变体——鸡存活蛋白（N97E、T99M、V100L、Q101G）（实心方块）或PBS(实心菱形)表达质粒的沙门氏菌接种。
图9是在第10天评估相对于肿瘤攻击的接种计时（vaccination timing）效果的给药日程表的图示。“D”是“天”的缩写。因此，例如，一些小鼠在第1天接受口服接种，在第10天接受肿瘤攻击，在第13天接受口服接种；其他小鼠在第10天接受肿瘤攻击和口服接种，在第18天接受第二次口服接种。在第29天评估肺肿瘤负荷。
图10是在第1和13天；7和13天；10和18天；或13和21天接受疫苗；或接受PBS的小鼠肺重量图表。所有小鼠在第10天接受静脉内LLC/KSA细胞的肿瘤攻击。也提供了每只小鼠的肺转移评分。
图11是给药日程表的图示，包括在第1和15天用鸡存活蛋白的沙门氏菌介导的接种；在第4天用LLC/KSA细胞的静脉内肿瘤攻击；以及在第11天的腹膜内环磷酰胺（CTX）治疗和在第12‑15天的吲哚美辛治疗。在第28天就肿瘤负荷对肺评分。
图12是描述了以下小鼠的肺重量的图：所述小鼠只接受肿瘤攻击（载体）；在第一天（引发）和第15天（加强）接受用鸡存活蛋白接种，且在第4天用肿瘤攻击（PCB）；接受CTX和吲哚美辛和肿瘤攻击C（CI）；接受引发、攻击、CTX、吲哚美辛和加强（PC(CI)B）；接受引发、攻击、CTX和吲哚美辛（PC(CI)）或接受攻击、CTX、吲哚美辛和加强C(CI)B。也提供了每只小鼠的肺转移评分。
图13提供了外周血细胞的流式细胞数据的描述，所述数据表明了在接种了携带编码非哺乳动物存活蛋白的质粒的沙门氏菌后在小鼠中CD44亮、CD33暗细胞的新群体的出现。x‑轴代表了CD3细胞，y‑轴代表了CD44细胞。
图14是剂量方案的图示，包括在第一天皮下肿瘤攻击；在第4、11、18和25天用非哺乳动物存活蛋白的沙门氏菌介导的接种；以及在第8、9和10天的静脉内免疫细胞因子处理。
图15是描述了用PBS、免疫细胞因子、非哺乳动物存活蛋白；或免疫细胞因子和非哺乳动物存活蛋白处理的小鼠一定时间内的肿瘤体积。
发明详述
本发明通过提供有效引发针对疾病细胞的免疫应答的组合物和方法改进了癌症或其他疾病的治疗。癌症是主要的靶标疾病，尽管本发明也可以应用到其他疾病和病症，例如正常细胞例如纤维样组织的不希望的增殖。本发明还涉及用于治疗病毒感染，例如HIV感染、流感病毒感染和其他病毒感染的组合物和方法。
具体地，对于癌症或其他肿瘤的治疗，本发明提供了用于将与肿瘤特异性或肿瘤富含的蛋白质相关的肽呈递到抗原呈递细胞以在哺乳动物中引发针对癌症或肿瘤细胞的适应性免疫应答的组合物和方法。其他优选的用于本发明的肿瘤特异性或肿瘤富含的抗原是存活蛋白。
T细胞抗原呈递综述
抗原呈递是一种细胞过程，其中将细胞中的蛋白质处理成肽，然后沿着分泌途径运输到细胞表面。处理的肽是作为与特化的肽呈递膜蛋白质（称作MHC）的稳定复合体来运输的。这一过程通过取样MHC‑肽复合体，允许免疫系统的组分例如辅助T‑细胞（CD4+T细胞）和细胞毒性T‑细胞（CTL或CD8+T‑细胞）来视察细胞的组分。辅助T细胞与MHC II‑肽复合体相互作用，而细胞毒性T‑细胞与MHC I‑肽复合体相互作用。相互作用通过在T‑细胞表面表达的T‑细胞受体（TCR）来发生。每个T‑细胞表达独特TCR。与抗体类似，通过在染色体TCR基因座的重排产生TCR多样性。与产生抗体的细胞相同，在T‑细胞分化过程中与自身抗原（即从细胞中存在的内源蛋白质产生的抗原肽）的相遇导致特定T‑细胞的负选择。在负选择中未被消除的那些T细胞进一步发育成成熟T‑细胞。最终，与和MHC复合的外源抗原的相互作用导致T细胞活化，特别在二次刺激存在时。
存活蛋白
存活蛋白的特征在于保守的、大约70个氨基酸结构域，称作BIR结构域（或IAP结构域）。在人存活蛋白中，BIR结构域对应于跨越Asp16至Leu87的区域。癌症和肿瘤细胞通常过量表达存活蛋白蛋白质，这认为将阻断这些细胞的凋亡并且因此干扰防止癌症或肿瘤细胞的异常生长的机制。另一方面，正常细胞表达非常少的存活蛋白。因此，存活蛋白是理想的肿瘤特异性或肿瘤富含的抗原。因此，本发明的目标是将存活蛋白蛋白质的抗原形式递送到抗原呈递细胞，从而可刺激对表达存活蛋白的肿瘤细胞的免疫应答。人和哺乳动物存活蛋白蛋白质和基因详细描述在美国专利号No.6,245,523或WO2004/067023。
非哺乳动物存活蛋白
本发明的一个方面围绕着令人惊奇的发现，即非哺乳动物存活蛋白基因和/或蛋白质可以用在癌症和其他疾病的疫苗中。例如，用编码鸡存活蛋白的核酸免疫小鼠或人会产生将分别攻击表达小鼠或人存活蛋白的细胞的CD8+T细胞。这一发现表明鸡存活蛋白在免疫学上与人存活蛋白基本类似，提示鸡存活蛋白可以用作存活蛋白蛋白质的抗原形式，来引发哺乳动物中的免疫应答。
在图1中比对了来自哺乳动物和非哺乳动物物种的存活蛋白蛋白质。包括在比对中的存活蛋白蛋白质是人存活蛋白（Genebank检索号NM_001168或O15392,SEQ ID NO:8），狗存活蛋白（Genebank检索号NP_001003019,SEQ ID NO:9），猪存活蛋白（Genebank检索号NP_999306,SEQ ID NO:39），奶牛存活蛋白（Genebank检索号NP_001001855,SEQ ID NO:40），猫存活蛋白（Genebank检索号NP_001009280,SEQ ID NO:41），小鼠存活蛋白（Genebank检索号NP_033819,SEQ ID NO:10），大鼠存活蛋白（Genebank检索号AAF82586,SEQ ID NO:42），猩猩存活蛋白（Genebank检索号CAH91231,SEQ ID NO:43），鸡存活蛋白（Genebank检索号NP_001012318,SEQ ID NO:11，“野生型”），光滑爪蟾SIX（Xenopus laevis）SIX存活蛋白(Genebank检索号AAO20085,SEQ ID NO:13)、光滑爪蟾存活蛋白同源物（Genebank检索号AAM76714,SEQ ID NO:46）、光滑爪蟾存活蛋白同源物2（Genebank检索号AAH89271,SEQ ID NO:47）、鲶鱼存活蛋白同源物（Genebank检索号CK419466,SEQ ID NO:52）、斑马鱼存活蛋白同源物（Genebank检索号NP_919378,SEQ ID NO:48），斑马鱼存活蛋白同源物2（Genebank检索号NP_660196,SEQ ID NO:49），河豚鱼存活蛋白样同源物（Genebank检索号CAG04432,SEQ ID NO:50）、河豚鱼存活蛋白样同源物2（Genebank检索号CAG07433,SEQ IDNO:51）。将通过基因检索号在本文公开的所有序列引入作为参考。包括在图1中的序列也列在说明书的序列表中。
另外，两个鸡序列也包括在相应的序列表中，变体1（Genebank检索号NM_001012319,SEQ ID NO:44）和变体2（Genebank检索号NP_001012317,SEQ ID NO:45），所述变体1与SEQ ID NO:11显示的野生型鸡存活蛋白序列的差异开始于氨基酸残基116，以给出不同的C端，所述变体2与SEQ ID NO:11显示的野生型鸡存活蛋白序列的差异开始于氨基酸残基38。
下列额外的序列包括在序列表中：人存活蛋白(Genbank检索号NM_001168.2,SEQ ID NO:64);人（Homo sapiens）存活蛋白(Genbank检索号O15392,SEQ ID NO:65);家犬（Canis familiaris）存活蛋白(Genbank检索号NM_001003019.1,SEQ ID NO:66);猪（Sus scrofa）存活蛋白(Genbank检索号NP_999306.1,SEQ ID NO:67);欧洲牛（Bos taurus）存活蛋白(Genbank检索号NP_001001855.2,SEQ ID NO:68);家猫（Felis catus）存活蛋白(Genbank检索号NP_001009280.1,SEQ ID NO:69);小家鼠（Mus musculus）存活蛋白(Genbank检索号NP_033819.1,SEQ ID NO.70);褐家鼠（Rattus norvegicus）存活蛋白(Genbank检索号AAF82586.1,SEQ ID NO:71);猩猩（Pongo pygmaeus）存活蛋白(Genbank检索号CAH91231.1,SEQ ID NO:72);原鸡（Gallus gallus）存活蛋白(Genbank检索号NP_001012318.1,SEQ ID NO:73);光滑爪蟾（Xenopus laevis）SIX存活蛋白(Genbank检索号AAO20085.1,SEQ ID NO:74);光滑爪蟾存活蛋白同源物(Genbank检索号AAM76714.1,SEQ ID NO:75);光滑爪蟾存活蛋白同源物2(Genbank检索号AAH89271.1,SEQ ID NO:76);编码河内鲶鱼（Ictalurus punctatus）存活蛋白的核酸(Genbank检索号CK419466.1,SEQ ID NO:77);鲐（Danio rerio）存活蛋白同源物(Genbank检索号NP_919378.1,SEQ ID NO:78);鲐存活蛋白同源物2(Genbank检索号NP_660196.1,SEQ ID NO:79);黑青斑河豚（Tetraodon nigroviridis）存活蛋白样同源物(Genbank检索号CAG04432.1,SEQ ID NO:80);黑青斑河豚存活蛋白样同源物2(Genbank检索号CAG07433.1,SEQ ID NO:81);黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）存活蛋白(Genbank检索号AAF55399.1,SEQ ID NO:82)和线虫（Caenorhabditis elegans）存活蛋白(Genbank检索号NP_505949.1,SEQ ID NO:83)。
本发明设想不仅使用在天然中发现的存活蛋白序列，例如在图1中公开的存活蛋白序列，而且使用其他氨基酸序列，所述氨基酸序列与在图1中公开的至少一种序列有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性。
如在图1中所示，尽管比对中的哺乳动物存活蛋白蛋白质与人存活蛋白超过80%的同一，但是比对中的非哺乳动物存活蛋白同源物与人存活蛋白的同一性不超过60%。但是，在BIR结构域中（图1比对中用下划线表示的区域），非哺乳动物存活蛋白蛋白质与人存活蛋白的同一性大于60%但是小于80%，而哺乳动物存活蛋白蛋白质与人存活蛋白的同一性超过90%。存活蛋白同源物的BIR结构域的序列对同一性百分比总结在图2中。例如，鸡存活蛋白与人存活蛋白在BIR结构域上有大约78%的同一性。
重要地，如图1所示，在鸡存活蛋白中，在BIR结构域中仅有一个9‑mer肽（18‑26：STRAATFRN）（SEQ ID NO:7），所述BIR结构域相对于对应的人序列包含超过50%的氨基酸变异（在此特定的9‑mer肽中9个氨基酸中的5个）。鸡存活蛋白的BIR结构域中的大多数9‑mer肽包含两个或更少的序列改变（64个肽中的48个）。不希望受到理论限制，要理解这一程度的序列保守性有效使得鸡存活蛋白与人存活蛋白免疫学上基本相似。
一般地，图2中显示的鸡存活蛋白BIR结构域和哺乳动物存活蛋白BIR结构域之间的同一性百分比在大约72%和大约78%之间变化。另外，大约75%的来自鸡存活蛋白的BIR结构域的9‑mer肽与对应的哺乳动物9‑mer肽相比包含两个或更少的序列改变。例如，鸡存活蛋白与小鼠存活蛋白在BIR结构域上有75%的同一性百分比，这与以下结果相一致，即鸡存活蛋白与小鼠存活蛋白在免疫学上基本相似，如在下面实施例6中所描述的。
如在下列实施例中所说明的，非‑哺乳动物存活蛋白组合物（例如鸡存活蛋白组合物）在小鼠中诱导针对表达小鼠存活蛋白的肿瘤的免疫应答的功效强调了以下本发明的原理：即用非哺乳动物存活蛋白分子接种哺乳动物可用于诱导针对哺乳动物存活蛋白或针对过量表达哺乳动物存活蛋白的细胞的免疫应答。因此，鸡存活蛋白也可以用于在人中产生针对过量表达人存活蛋白的细胞（例如任何肿瘤细胞）的有效的免疫应答，因为在哺乳动物之间免疫应答是足够保守的。
相反，非脊椎动物的BIR结构域与人存活蛋白BIR结构域的比对显示黑腹果蝇（AAF55399,SEQ ID NO:53）和线虫（NP_505949,SEQ ID NO:54）BIR结构域与人存活蛋白BIR结构域序列有50%或更少的同一性，尽管对于Zn螯合作用的关键残基是保守的（见图3中的比对中的星号）。例如，苍蝇存活蛋白BIR结构域与人存活蛋白BIR结构域有约50%的同一性。重要地，苍蝇BIR结构域仅包含3个（64中的3个）这样的9‑mer肽，所述肽与对应的人肽相比具有两个或更少的氨基酸取代。
根据本发明，如本文所用的，术语“非哺乳动物存活蛋白”至少包括任一具有BIR结构域（或IAP结构域）的存活蛋白蛋白质，所述BIR结构域与人存活蛋白BIR结构域具有至少多于50%的氨基酸同一性，但是少于90%的氨基酸同一性，例如与人存活蛋白BIR结构域有至少55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%的同一性。
为了计算同一性百分比，将每个序列的比对的氨基酸顺序比较。如果氨基酸是非同一的，配对同一性分数是0，否则配对同一性分数是1.0。原始同一性得分是同一的比对氨基酸的总和。然后将原始分数除以较小的候选序列或参照序列中的氨基酸数并且将结果乘以100来标准化原始分数。标准化的原始分数是同一性百分比。为了计算百分比同一性的目的，忽略插入和缺失。因此，在此计算中不使用空位罚分。
产生多重序列比对的方法是本领域技术人员熟知的。为了比对存活蛋白序列，使用DNASTAR LasergeneTM6软件的Megalign6.1模块，应用ClustalV比对算法，使用缺省设置(Higgins和Sharp(1989)Comput Appl Biosci.5:151‑3)。对于存活蛋白BIR结构域的次级比对，应用ClustalW(“慢准确”)方法，使用缺省设置（Thompson等人.(1994)Nucleic Acids Res.22:4673‑80）。
设想非哺乳动物存活蛋白也包含比哺乳动物存活蛋白更多的肽，所述肽具有产生T辅助细胞应答的潜能。不希望受到理论限制，设想免疫效应可以通过在免疫应答中通过MHC I的细胞毒性T细胞的接合和通过MHC II的T辅助细胞的的接合来实现的。内源人存活蛋白和非哺乳动物存活蛋白之间的序列差异可能引起人免疫系统还没有耐受的一些肽被呈递。可以使用公开可用的预测算法，例如ProPred Analysis(www.imtech.res.in/raghava/propred;Singh等人,(2001)Bioinformatics17:1236‑1237,其内容在本文引用作为参考)，分析潜在的MHC II表位的存在。使用此类算法，发现相对于哺乳动物存活蛋白蛋白质，例如人或狗存活蛋白，非哺乳动物存活蛋白蛋白例如鸡存活蛋白或蛙SIX存活蛋白被预测为包含多个与MHC II分子结合的肽和/或与MHC II分子具有更高的结合亲和性的肽（见表1）。
表1：对人HLA‑DR的肽结合预测




表1显示了结合至少一个HLA‑DR等位基因的每个9‑mer肽的起始位置（#）和序列（肽）。#结合是指肽在高于任意的结合阈值（在本案中是20%）下结合的等位基因的数目（50中的）。20%的阈值是指20%的理论最大结合分数，如由在Propred中执行的算法所计算的。分数是指该肽结合的所有HLA等位基因的累积分数。作为参考，来自已知会引起抗MBP抗体的蛋白质的一部分的人髓鞘碱性蛋白（MBP）肽VVHFFKNIV(SEQ ID NO:14)以1087.6的累积分数结合29个HLA等位基因。
希望提供包括或编码来自非哺乳动物存活蛋白的肽的疫苗，所述疫苗能够活化识别与MHC分子复合时的人存活蛋白肽序列的T细胞。此类人存活蛋白肽或来自其的肽包括但不限于EPDLAQCFF(SEQ ID NO:3)、EPDLAQCFY(SEQ ID NO:15)、CPTENEPDL(SEQ ID NO:2)和CPTENEPDY(SEQ ID NO:16)。可用于活化T细胞或增强T细胞活化的额外的人肽和修饰描述在美国专利申请公布号2004‑0210035，其内容在本文被引用作为参考。
因此，以下是有用的：即将对应于已知的人存活蛋白表位的突变引入到非哺乳动物存活蛋白序列中，或引入将增强那些肽序列对MHC的结合的突变。例如，将氨基酸取代引入鸡存活蛋白序列的第Asn97、Thr99、Val100或Gln101位是有用的。不希望受到任何理论的限制，在鸡存活蛋白的第Thr99位的取代可以增强衍生的肽对MHC分子的结合。在具体的实例中，衍生自鸡存活蛋白的肽可以包含下列氨基酸取代的至少一个：Asn97Glu、Thr99Met、Val100Leu和Gln101GIy。在另一个实例中，将氨基酸取代在Thr110或Ser112处引入到蛙SIX存活蛋白是有用的。爪蟾属SIX存活蛋白的氨基酸序列（T110M、S112G）显示在SEQ ID NO:55中。不希望受到任何理论限制，在第Thr110位的取代可以增强衍生的肽对MHC分子的结合。在具体的实例中，来自蛙存活蛋白的肽可以包含下列取代的至少一个：Thr110Met、Ser112Gly。
适合于本发明的非哺乳动物存活蛋白肽也可以包含氨基酸缺失。例如，非哺乳动物存活蛋白肽可以包含C端截短或N端截短。
可能在非哺乳动物存活蛋白蛋白质中某些不太保守的序列段与其他非存活蛋白人蛋白质的相同，它们不具有与人存活蛋白相同的表达模式，因此不是肿瘤特异性的。这可以通过进行BLAST搜索，以初始方式评估，所述BLAST搜索是将来自非哺乳动物存活蛋白的趋异区域的序列针对非冗余人蛋白质数据库进行的，设置为鉴定短的、几乎精确的匹配。例如，用鸡存活蛋白序列的C端结构域（aa90‑aa142）仅鉴定了具有近似精确匹配的一些人蛋白质（少于5个命中（hit））。然后可以将那些人蛋白质在它们的表达模式和它们产生抗原性肽的潜能方面进一步分析，最初是使用下文描述的在计算机芯片上的方法。
修饰的存活蛋白：
另一方面，本发明通过向哺乳动物存活蛋白蛋白质引入修饰而产生了存活蛋白的抗原形式。具体地，本发明设想修饰的哺乳动物存活蛋白肽，其为生物学惰性的但是与哺乳动物存活蛋白在免疫学上基本相似。本发明的这一方面还使用在抗原呈递细胞的胞质中简单表达存活蛋白蛋白质的简单方法解决了两个特定问题。第一个问题是生物学活性的存活蛋白蛋白质可以破坏抗原呈递细胞的生理。第二个问题是当存活蛋白或基本上任何其他蛋白质在细胞中表达时，只有小部分的蛋白质以一定的方式被降解，所述方式使得通过I类MHC将抗原肽呈递到细胞表面上。
因此，本发明涉及修饰的哺乳动物存活蛋白，包括人存活蛋白的突变形式或非人哺乳动物存活蛋白的突变形式。本发明还涉及不仅使用在天然中发现的存活蛋白序列，如在图1中公开的存活蛋白序列，而且使用其他氨基酸序列，所述氨基酸序列与图1中公开的至少一种序列具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%的氨基酸同一性。
已经确定了人存活蛋白的结构（Chantalat等人,(2000)Mol.Cell6:183‑189;蛋白质结构的蛋白质数据文库(PDB)储存库检索号:PDB ID 1E31;Verdecia等人(2000)Nat.Struct.Bio.7:602‑608;蛋白质结构的蛋白质数据文库(PDB)储存库检索号:PDB ID1F3H,上述每个的教导在本文引用作为参考）。基于3D结构，人存活蛋白包含至少2个结构域：包括锌结合位点的N端球形结构域（称为BIR或IAP结构域），以及延伸的C端α螺旋结构域（在本文中称为螺旋结构域）。在优选的实施方案中，本发明提供了在N端BIR结构域和/或在C端螺旋结构域中具有突变的存活蛋白形式。本发明指出可以通过突变两个结构域来实现最优效果。不希望受到任何理论限制，认为N端BIR结构域和C端螺旋结构域各自具有生物学活性。例如，即使不存在螺旋结构域时，BIR结构域仍然具有一定水平的抗凋亡活性。另外，螺旋结构域具有细胞骨架结合活性，并且具有不同的生物学活性。
具体地，在BIR结构域中，例如，优选的突变包括但不限于，在对应于人存活蛋白的Cys57、Cys60、His77或Cys84的位置的氨基酸取代。例如，修饰的BIR结构域可以包含下列取代的至少一种：Cys57Ser、Cys60Ser、His77Phe、和Cys84Ser。任何这些氨基酸向丙氨酸或脯氨酸的取代是优选的。认为这些突变破坏了BIR结构域中的锌结合位点。也可以使用具有破坏锌结合位点作用的其他突变。另外，在对应于人存活蛋白Arg18的位置的突变（优选向天冬氨酸或谷氨酸的突变）可以用来产生无活性的BIR结构域。其中在至少两个、三个或四个位置突变锌结合氨基酸的修饰的BIR结构域是特别优选的。
通常有用的是在螺旋结构域的任何位置引入脯氨酸残基，来破坏其功能。具体地，可以在对应于人存活蛋白Ala128或Ile135的位置引入脯氨酸取代。其他可以破坏螺旋结构域的氨基酸取代也是优选的。
优选的修饰的哺乳动物存活蛋白可以包含在Arg18、Cys57、Cys60、His77和/或Cys84的突变和在螺旋结构域中的脯氨酸。在位置Arg18、Cys57、Cys60、His77、Cys84、Ala128和Ile135的每个前述氨基酸在人和鸡存活蛋白之间是保守的，因此可以引入相同的突变来产生生物学惰性的鸡存活蛋白。类似的突变也可以引入到其他非哺乳动物存活蛋白蛋白质的对应位置中。
任何上述突变可以与在对应于人存活蛋白的Leu98的位置的突变（例如Leu98Arg、Leu98Lys和Ley98Ala）组合。在鸡存活蛋白中，对应于人Leu98的位置是Val100。
可以通过常规实验鉴定其他有用的突变，如在实施例中描述的。例如，将突变引入到存活蛋白中并且就例如生物学活性的丧失和/或增强的降解、和/或诱导针对肿瘤的免疫应答的能力进行测试。这些测试的例示性测定在下文描述在实施例中并且是本领域已知的。
通常，优选的修饰的存活蛋白肽包含3个、4个、5个或更多个突变。但是，本发明涉及的修饰的存活蛋白的一种效用是通过I类MHC分子呈递来自存活蛋白的T细胞表位肽。因此，通常优选是突变少于50个（或少于30个或少于20个）氨基酸，以维持与哺乳动物存活蛋白的免疫学基本相似性。
抗原呈递
本发明提供了将突变最优地引入存活蛋白或其他蛋白质序列从而使得I类MHC表位的加工相对地不被阻碍的指导。
可能某些存活蛋白突变位于肽区段内，所述肽区段由I类MHC分子所呈递并且由特定的T细胞受体所识别。还可能突变会改变存活蛋白向肽表位的蛋白水解加工，使得肽表位被切割，或该肽表位未被切割但是优先产生新的表位。为了解决抗原呈递的问题，可以使用公开可用的数据库和信息来鉴定存活蛋白蛋白质中候选I类MHC分子表位，然后确定突变是否改变了表位。例如，可以使用SYFPEITHI算法（www.unituebingen.de.uni.kxi;也见Rammensee等人,(1999)Immunogenetics50:213‑219,其教导在本文引用作为参考）。备选地，可以使用BIMAS算法（bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/;也见Parker等人(1994)J.Immunol.152:163‑175,其教导在本文引用作为参考）。由于编码人I类MHC蛋白质的HLA基因是高度多态性的（不同的I类MHC蛋白质结合不同的肽基序），制作了潜在表位的表，其在一个轴上是不同的I类MHC分子，而在另一轴上是存活蛋白序列。表中的条目标识了给定I类MHC分子的表位位置。基于对多种表位的效应鉴定候选突变的效应。最后，基于疫苗的需要选择一个或多个突变，要考虑到例如不同HLA等位基因的等位基因频率或HLA等位基因的组特异性频率。为了解决蛋白水解加工的问题，根据本发明，可以使用公开可用的数据库和信息来鉴定候选蛋白酶体切割位点，然后确定突变是否改变了此类切割位点。例如可以使用公开可用的数据库NetChop（www.cbs.dtu.dk/services/NetChop/）。通常优选避免改变切割位点。
为了举例说明目的，实施例12提供了确定存活蛋白蛋白质中有用取代的例示性分析。
根据本发明，考虑“免疫蛋白酶体”也是有用的。在抗原呈递细胞中，蛋白酶体多少有些不同的蛋白质组成，并且其蛋白水解特异性受到将C端切割成疏水残基的酶的控制。因此，蛋白酶体产生了可以用C端疏水锚定残基结合I类MHC的肽。如果需要维持免疫蛋白酶体切割模式的特异性，优选避免此类疏水残基的突变，特别是亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。类似地，还优选避免将其他残基突变成亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。因此在Arg18、Cys57、Cys60、His77、和Cys84处的突变具有以下优势：去稳定存活蛋白的结构并且不消除免疫蛋白酶体切割位点。另外，优选避免在蛋白质序列中紧邻N端的7至9个氨基酸中引入向亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的突变。
因此，本发明提供了在蛋白质序列中鉴定优选的突变位点以产生具有增强的免疫原性的蛋白质的一般方法。基于此方法，蛋白质序列中的优选的突变位点具有下列性质。第一，位点的一个或多个突变去稳定了蛋白质结构。第二，去稳定突变不引入亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、色氨酸或苯丙氨酸。第三，在该位置的正常氨基酸不是亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、色氨酸或苯丙氨酸。这一方法可以用于广泛多种的蛋白质，所述蛋白质可以用作抗原，例如肿瘤特异性抗原、病毒抗原或其他抗原。在肿瘤特异性抗原中，除了存活蛋白，该方法也可以用于表皮细胞粘着分子、癌基因例如Ras、癌胚抗原和其他肿瘤特异性抗原。在病毒抗原中，该方法可以用于HIV的p24、流感血凝素和其他病毒蛋白质。
包含非哺乳动物和/或修饰的存活蛋白的融合蛋白质
为了促进存活蛋白部分的降解和其加工成可以通过I类MHC分子呈递的肽，希望将上述非哺乳动物存活蛋白或突变存活蛋白肽融合到适当的第二蛋白质上。例如，对于此目的，泛蛋白是特别优选的融合配偶体。可以以下列构型之一构建泛蛋白‑存活蛋白融合蛋白质：N端‑泛蛋白‑存活蛋白‑C端或N端‑存活蛋白‑泛蛋白‑C端。N端‑泛蛋白‑存活蛋白‑C端是优选的方向。另外，希望将存活蛋白N端甲硫氨酸优选突变成精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。还希望在泛蛋白‑存活蛋白融合蛋白质中在对应于人存活蛋白Ile19或Val21的位置引入赖氨酸。
还希望将本发明的存活蛋白融合到Fc部分。优选的Fc部分包含抗体CH2和CH3结构域，以及任选地包含铰链区。可以将Fc部分融合到存活蛋白N端或C端。成熟人Fc‑鸡存活蛋白的蛋白质序列显示在SEQ ID NO:25中。成熟鼠Fc‑鸡存活蛋白的蛋白质序列显示在SEQ ID NO:27中。
另外，包含存活蛋白和Fc部分的融合蛋白质还可以包含其他部分，例如在PCT公开WO01/07081中描述的刺激免疫系统的细胞因子。不希望受到理论限制，Fc部分的存在可以增强包含存活蛋白的融合蛋白质被摄取到抗原呈递细胞中。通常优选Fc部分来自待治疗的生物。例如，为了治疗人，优选使用人Fc部分。
Fc‑存活蛋白融合蛋白质或编码该融合蛋白质的核酸可以优选包含用于分泌的信号序列。信号序列的存在有助于融合蛋白质在哺乳动物细胞系例如NS/0细胞中的表达，并且如果对应的核酸被施用到患者中，可以允许融合蛋白质在体内的分泌。Fc‑存活蛋白融合蛋白质的编码序列优选以5’至3’方向开始，具有“前导序列”，所述“前导序列”来自例如抗体轻（L）链（符合读框地与免疫球蛋白重链或其突变形式的至少一部分融合），优选来自人免疫球蛋白γ1基因的Fcγ1区域。免疫球蛋白γ1基因的Fcγ1区域优选包括至少一部分的铰链结构域和CH3结构域，更优选至少包括铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。
编码信号序列的DNA部分优选编码肽区段，所述肽区段指导Fc融合蛋白质的分泌并且其后被从Fc融合蛋白质的剩余部分切除掉。本发明的信号序列是编码氨基酸序列的多核苷酸，所述氨基酸序列起始蛋白质转运通过内质网的膜。可用于本发明中的信号序列包括抗体轻链信号序列，例如抗体14.18（Gillies等人（1989）J.Immunol.Meth,125:191）、抗体重链信号序列，例如MOPC141抗体重链信号序列（Sakano等人（1980）Nature,286：5774），和本领域已知的任何其他信号序列（见例如Watson(1984)Nucleic Acid Research,12:5145）。
信号序列已经在本领域中详细表征并且已知通常包含16至30个氨基酸残基，并且可以包含较多或较少的氨基酸残基。典型的信号肽由三个区域组成：碱性N端区域、中心疏水区域和更有极性的C端区域。中心疏水区域包含4至12个疏水残基，它们在转运新生多肽的过程中将信号肽锚定穿过膜脂双层。在起始后，信号肽通常由已知为信号肽酶的细胞酶在内质网的腔内将其切割。信号肽的潜在切割位点通常依照“（‑3、‑1）规则”。因此，典型的信号肽在第‑1和‑3位具有小的中性氨基酸残基，并且在该区域缺乏脯氨酸。信号肽酶将在‑1和+1氨基酸之间切割此类信号肽。因此，可以在分泌过程中将信号序列从融合蛋白质的氨基端切割下来。这导致Fc融合蛋白质的分泌。可用于本发明的实践中的信号肽序列是本领域已知的。见例如von Heijine(1986)Nucleic Acid Res.,14:4683。
术语“信号序列”、“信号肽”、“前导序列”或“前导肽”在本文中互换使用。
分泌的融合蛋白质通常具有正确折叠的Fc结构域，但是具有不正确折叠的存活蛋白部分。不希望受到理论限制，认为当通过Fc‑存活蛋白融合蛋白质的Fc部分迫使存活蛋白进入到分泌途径中时，存活蛋白折叠受到损害，特别是因为存活蛋白包含可以参与二硫键合的多个半胱氨酸。存活蛋白部分的正确折叠对于本发明疫苗的活性不是必需的。
作为通过遗传改造技术的蛋白质融合的备选，使用常规化学交联剂的化学缀合可以用来连接蛋白质部分。
核酸
本发明还提供了编码上述非哺乳动物和/或修饰的存活蛋白和包括该存活蛋白的融合蛋白质的核酸。例如，人存活蛋白的核苷酸序列显示在SEQ ID NO:57中，爪蟾SIX存活蛋白的核苷酸序列显示在SEQ ID NO:58中，爪蟾SIX存活蛋白同源物的核苷酸序列显示在SEQ ID NO:59中，斑马鱼存活蛋白同源物的核苷酸序列显示在SEQ ID NO:60中，以及鲶鱼存活蛋白同源物的核苷酸序列显示在SEQ ID NO:61中。核酸优选与允许在真核细胞特别是在哺乳动物细胞中表达的元件连接和交错，以形成表达盒。通常，编码存活蛋白的表达盒包括至少一个下列调节元件，例如启动子、增强子、内含子、终止子、聚腺苷酸化信号等。优选地，包括哺乳动物启动子。如本文用到的，“哺乳动物启动子”意思是来自在哺乳动物中或在通常生长在哺乳动物的病毒中发现的启动子的基因启动子。例如，优选的启动子包括存在于生长在哺乳动物细胞中的病毒的那些，所述病毒例如巨细胞病毒（CMV）、猿猴病毒40（SV40）、EB病毒（EBV）、劳斯肉瘤病毒（RSV）、莫洛尼猴病毒、人免疫缺陷病毒（HIV）、小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）；或优选的启动子包括来自哺乳动物基因的那些，例如来自哺乳动物肌动蛋白、β‑珠蛋白、肌球蛋白，或任选地来自优选表达在抗原呈递细胞中的哺乳动物基因，例如Fascin或其他本领域已知的APC‑特异性基因。有用的聚腺苷酸化信号的实例是来自SV40聚腺苷酸化信号的信号。
表达元件可以指导存活蛋白蛋白质在所有真核细胞中的表达，或者可以具有指导在例如抗原呈递细胞中的表达的细胞类型特异性增强子。也优选将表达盒的编码部分设计为具有在真核细胞（特别是在哺乳动物或人细胞）中最常用的密码子。
本发明的表达盒可以用来在培养的细胞中产生本发明的蛋白质。因此，表达盒可以与适当的抗药性基因、DNA复制原点和其他元件连接以促进表达盒的选择和复制。在一个实施方案中，将表达盒的核酸序列掺入到能够在细菌中复制的质粒中。适合于本发明的质粒具有用于在细菌细胞中选择的标记，例如抗生素抗性基因。备选地，适当的质粒可以缺乏抗生素抗性基因但是可以任选地包括编码代谢酶、阻抑型tRNA的基因、或在非抗药性细菌的基因组中正常发现的其他此类基因。因此，本发明的例示性实施方案是包含与哺乳动物启动子有效连接的编码本发明存活蛋白肽的核酸并且没有抗生素抗性标记的质粒。可以将此类质粒转化到细菌中，并且然后可以将细菌用于接种患者，而不用将抗生素抗性基因引入患者。备选地，可以不用活载体将此类质粒引入患者。例如，可以将此类质粒作为裸DNA或作为包埋在珠子中或包被在珠子表面的DNA引入。
可以将本发明的表达盒掺入到病毒基因组、适合于裸DNA施用的质粒或细菌基因组中。在病毒基因组的情形中，希望使用双链DNA病毒例如腺病毒和腺伴随病毒，以及RNA病毒例如逆转录病毒。通过标准技术将表达盒插入到此类病毒的基因组中。因此，本发明提供了核酸的DNA和RNA形式。
效应分子
本发明还提供了这样的实施方案：其允许非哺乳动物肽或修饰的哺乳动物存活蛋白肽与有助于免疫应答的效应分子协同起作用。例如，此类效应分子可以是细胞因子部分，包括但不限于IL‑2、IL‑7、IL‑12、IL‑18、IL‑21、IL‑23、GM‑CSF，或任何其他细胞因子，特别是能够活化Th1免疫应答的细胞因子。此类效应分子也可以是抑制免疫系统的细胞因子抑制剂，例如STAT3抑制剂（例如显性失活的STAT3蛋白质，例如STAT3β）。细胞因子或其他效应分子也可以包含突变。例如，细胞因子可以在对应于Il‑2的Cys25的位置包含Ser取代。
因此，在优选的实施方案中，本发明的疫苗包括编码非哺乳动物或修饰的哺乳动物存活蛋白肽和另一种肽的核酸，所述另一种肽包括上述有助于免疫应答的效应分子。编码非哺乳动物或修饰的哺乳动物存活蛋白肽和效应分子肽的区域可以在单个转录单元中，或在两个分开的转录单元中。备选地，本发明的疫苗包括编码非哺乳动物或修饰的哺乳动物存活蛋白肽的核酸和编码包括上述有助于免疫应答的效应分子的另一种肽的分离的核酸。
在其他实施方案中，本发明的疫苗包括非哺乳动物或修饰的哺乳动物存活蛋白肽和另一种肽，所述另一种肽包括上述的有助于免疫应答的效应分子。在一个实施方案中，非哺乳动物或修饰的哺乳动物存活蛋白肽与包括效应分子的肽融合或缀合。存活蛋白肽和效应分子融合蛋白可以另外与上述的Fc部分融合或缀合。
施用
本发明的疫苗用于治疗表现出与存活蛋白过量表达相关的疾病或处于所述疾病风险的人或哺乳动物。此类疾病包括以过量表达存活蛋白的细胞为特征的癌症或其他肿瘤。
可以将根据本发明产生的疫苗通过任何途径施用给哺乳动物。蛋白质抗原的注射通常用来引发哺乳动物中的免疫应答。但是，也可以通过核酸例如DNA注射将本发明的疫苗递送给APC。常用的技术是将编码抗原蛋白质的DNA表达载体注射到肌肉。相信特化的APC例如巨噬细胞和树突细胞迁移到注射或施用位点，通过已知为抗原呈递过程的过程获得并且呈递抗原。
因此，根据需要，可以口服或肠胃外施用，包括静脉内和腹膜内途径施用。另外，施用可以通过疫苗推注的周期性注射，或者可以通过从外部的储存器（例如包）静脉内或腹膜内施用来更连续地进行。在某些实施方案中，本发明的疫苗可以是药物级别的，也就是说，某些实施方案符合纯度标准和施用给人所需的质量控制。兽医应用也在本文所用的预期的意义内。
根据本发明疫苗的用于兽医和人类药物用途的制剂通常包括与可药用佐剂、载体或任选的其他成分结合的疫苗。在与制剂的其他成分相容且对于其受体无害的意义下，载体是“可接受的”。在这一方面，可药用的载体意图包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等，其与药物施用相容。此类介质和物质对药物活性物质的用途是本领域已知的。除了在常规介质或物质不与活性化合物或其施用载体相容的情况，可以预期其用于组合物中。还可以将补充活性化合物（根据本发明鉴定的和/或本领域已知的）掺入到组合物中。可以以单位剂型容易地给出制剂，并且可以通过药学/微生物学领域熟知的任何方法制备所述制剂。通常，一些制剂通过将疫苗与液体载体或细分的固体载体或前述二者相结合制备，然后根据需要，将产品成型为所需的制剂。
将本发明的疫苗组合物配制成与其想要的施用途径相容。施用途径的实例包括口服或肠胃外，例如静脉内、皮内、吸入、经皮（局部）、经粘膜、和直肠施用。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液剂或混悬剂可以包括下列成分：用于注射的无菌稀释剂例如水、盐溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸；缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调整张力的物质如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱，如盐酸或氢氧化钠调整pH。
可以用药学领域中熟知的任何方法制备用于口服或肠胃外施用的有用溶液，例如在Remington’s Pharmaceutical Sciences,(Gennaro,A.编著)中所描述的。用于肠胃外施用的制剂也可以包括用于含服施用的甘胆酸盐、用于直肠施用的甲氧基水杨酸盐、或用于阴道施用的柠檬酸。肠胃外制品可以封装在安瓿、一次性注射器或用玻璃或塑料制备的多剂量瓶中。用于直肠施用的栓剂也可以通过将药物与非刺激性赋形剂例如可可脂、其他甘油酯或其他在室温下是固体而在体温下是液体的组合物混合来制备。制剂还可以包括例如聚（亚烷基）二醇例如聚乙二醇、植物来源的油、氢化萘等。用于直接施用的制剂可以包括甘油和其他高粘度的组合物。其他潜在有用的用于这些疫苗的肠胃外载体包括乙烯‑乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入的灌注系统和脂质体。用于吸入施用的制剂可以包含作为赋形剂的例如乳糖，或可以是包含例如聚氧乙烯‑9‑月桂醚、甘胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液，或者是用于以滴鼻剂形式施用的油溶液剂，或可以作为待鼻内施用的凝胶剂。滞留灌肠剂也可以用于直肠递送。
适合用于口服施用的本发明制剂可以是离散单位的形式，例如胶囊剂、明胶胶囊剂、囊剂、片剂、含片（troches）或锭剂,各自包含预定量的药物；可以是粉剂或胶囊剂的形式；水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液的形式；或可以是水包油乳剂或油包水乳剂的形式。疫苗也可以推注、煎膏剂或糊剂的形式施用。可以任选地与一种或多种辅助剂压制或制模药物来制备片剂。可以通过在适当的机器中压制自由流动形式例如粉末或胶囊的药物，任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性或分散剂混合来制备压制的片剂。通过在合适的机器中将粉状药物与用惰性液体稀释剂湿润的合适载体的混合物制膜来制备模制片。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用的载体。为了口服疫苗施用的目的，活性化合物可以与赋形剂混合。使用液体载体制备的用作漱口剂的口服组合物包括在液体载体中的化合物，并且口服应用，漱口并吐出或吞下。药物相容的粘合剂和/或辅剂材料可以作为组合物的部分包括在内。片剂、丸剂、胶囊剂、含片等可以包含任何下列成分或类似性质的化合物：粘合剂例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；崩解剂，例如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或Sterote；助流剂例如胶体二氧化硅；甜味剂例如蔗糖或糖精；或芳香剂例如薄荷油、水杨酸甲酯、橙调味料（orange flavoring）。
适合于注射使用的疫苗组合物包括无菌水溶液（其中水溶性的）或分散剂和用于即时制备无菌注射液或分散剂的无菌粉末。对于静脉内施用，适当的载体包括生理盐水、抑菌水、克列莫佛ELTM(BAST,Parsippany,NJ)或磷酸缓冲的盐溶液（PBS）。在所有情形中，组合物可以是无菌的，并且可以使其流动到容易注射的程度。在制备和储存条件下其是稳定的并且可以保存防止微生物例如真菌的污染。载体可以是溶剂或分散剂介质，包含例如水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等），以及其适当的混合物。可以维持适当的流动性，例如，通过使用包衣如卵磷脂、通过在分散剂的情形中维持所需颗粒大小、以及通过使用表面活性剂。在许多情形中，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇和氯化钠。可以通过在组合物中包括延迟吸收的物质例如单硬脂酸铝或明胶造成可注射的组合物延长的吸收。
可以通过在具有（根据需要）上述列举的成分之一或组合的适当的溶剂中掺入所需量的活性化合物，然后过滤灭菌来制备无菌可注射的溶液。通常，通过将活性化合物掺入包含基本分散介质和所需的其他来自上述列举的成分的无菌载体来制备分散剂。在用于制备无菌可注射物质的无菌粉末的情形中，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，这产生了活性成分的粉末和来自其以前无菌过滤的溶液的任何其他所需成分。
适合于关节内施用的制剂可以是疫苗的无菌含水制品的形式，其可以是微晶形式，例如含水微晶混悬剂的形式。脂质体制剂或生物可降解的聚合物系统也可以用于将疫苗用于关节内施用和眼睛施用。
适合于局部施用的制剂包括液体或半液体制品例如搽剂、洗剂、凝胶剂、applicants、水包油或油包水乳剂例如乳膏剂、软膏剂或糊剂；或溶液剂或混悬剂例如滴剂。用于皮肤表面的局部施用的制剂可以通过将疫苗用皮肤病学可接受的载体分散来制备，例如洗剂、乳膏剂、软膏剂或肥皂。在一些实施方案中，有用的是能够在皮肤上形成膜或层以定位应用和阻止移除的载体。当希望粘着到组织表面时，组合物可以包括分散在血纤蛋白原‑溶血酶组合物或其他生物粘合剂中的疫苗。然后可以将疫苗涂布、喷雾或以其他方式应用到所需组织表面。对于局部施用到内部组织表面，可以将活性剂分散到粘连的液体组织或其他已知将增强组织表面吸收的物质中。例如，使用羟丙纤维素或血纤蛋白原/凝血酶溶液是有利的。备选地，可以使用组织涂布溶液，例如包含果胶的制剂。
对于吸入治疗，可以使用用喷雾器、喷洒器或雾化器分散的粉末（自身推进或喷雾制剂）的吸入。此类制剂可以是用于从粉末吸入装置进行经肺施用的精细研碎的粉末、或自身推进粉末分散制剂的形式。在自身推进溶液和喷雾制剂的情形中，效果可以通过选择具有所需喷雾特征（即能够产生具有所需颗粒大小的喷雾）的阀或通过将活性成分以受控颗粒大小的悬浮的粉末掺入来实现。对于吸入施用，疫苗还可以以气雾剂喷雾的形式从受压的容器或分液器或喷洒器递送，所述容器或分液器包含适当的推进物质，例如气体如二氧化碳。也可以使用滴鼻剂。
全身施用也可以通过经粘膜或经皮的方式。对于经粘膜或经皮施用，在制剂中也可以使用适合于待透过的屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域已知的，包括例如用于经粘膜施用的去污剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来实现。对于经皮施用，通常将疫苗配制进软膏剂、油膏剂、凝胶剂或乳膏剂，这是本领域公知的。
在一个实施方案中，用载体制备疫苗，所述载体将保护免于从机体快速消除，例如控释制剂，包括埋植剂和微型胶囊递送系统。也可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚羟乙酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类制剂的方法对于本领域技术人员是已知的。也可以从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals,Inc通过商业途径获得所述材料。也可以将脂质体混悬液用于可药用的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如在美国专利号4，522，811中描述的。也可以使用微粒体和微颗粒。
可以将口服或肠胃外组合物以剂量单位形式配制用于容易的施用和剂量均一。剂量单位形式是指物理上分离的单位，其适合于作为用于待治疗受试者单一剂量；每个单位包含预先确定量的活性化合物，所述量被计算用来产生与需要的药物载体联合产生所需的疫苗效果。本发明的剂量单位形式的规格由以下因素所控制并且直接依赖于以下因素：活性化合物的独特性质和待实现的特定疫苗效果，以及配制此类活性化合物用于个体治疗的领域中固有的限制。
通常，可以将根据本发明鉴定的疫苗配制用于肠胃外或口服施用给人或其他哺乳动物，例如，以治疗有效的量，例如提供适当浓度的药物到靶组织足够的时间来诱导所需效果的量。另外，本发明的疫苗可以独自施用或与其他分子组合施用，所述分子已知对于特定疾病或目的适应症具有有益效果。仅仅为了举例，有用的辅因子包括减轻症状的辅因子，包括防腐剂、抗生素、抗病毒剂和抗真菌剂，以及镇痛剂和麻醉剂。
待以疫苗组合物递送的根据本发明鉴定的疫苗的有效浓度将取决于多种因素而变化，所述因素包括待施用药物的最终所需剂量和施用途径。待施用的优选剂量也可能取决于此类变量，例如待治疗的疾病或适应症的类型和程度、特定患者的总体健康状态、递送疫苗的相对生物学功效、疫苗的剂型、制剂中赋形剂的存在和类型，以及施用途径。在一些实施方案中，可以使用典型的剂量单位向个体提供本发明的疫苗，所述剂量单位为使用非人灵长类和啮齿类，从早先描述的哺乳动物研究中推论得到。如上所述，剂量单位是指单一的，即单次剂量，其能够施用给患者，并且可以被容易的操作和包装，保持为物理和生物稳定的单位剂量，其包含原样的疫苗或所述疫苗与固体或液体药物稀释剂或载体的混合物。
存活蛋白核酸与珠子的递送结构
在另一个实施方案中，可以将本发明的核酸用递送运载体例如珠子装配。例如，根据在美国申请公开号2003‑0166594（其教导在本文引用作为参考）描述的方法，可将本发明的核酸包被到纤维素珠子上。根据在美国专利号5783567（其教导在本文引用作为参考）描述的方法，可以将本发明的核酸掺入聚合珠子内。
在某些实施方案中，改造生物（例如细菌、哺乳动物细胞和病毒颗粒）以产生本发明的存活蛋白。这些生物可以释放用于收集的存活蛋白，或者可以将其作为疫苗直接引入到患者中。
病毒中存活蛋白核酸的递送结构
可以用病毒递送运载体装配本发明的核酸。病毒递送运载体任选地具有辅助效果。例如，适当的病毒包括但不限于腺病毒、腺伴随病毒、反转录病毒或疫苗病毒。通常优选使用病毒的突变体或削弱的形式，例如复制机能不全的病毒。将本发明的核酸插入到病毒基因组中并且另外掺入到病毒颗粒中。使用基因疗法领域中熟知的辅助病毒系统包装核酸。
细菌中存活蛋白核酸的递送结构
可以在微生物宿主中装配本发明的核酸用于递送，例如由Gentschev等人(2000)J.Biotechnol.，83:19‑26;或由Stocker BAD(2000)J.Biotechnol.，83:45‑50描述的，所述文献各自的教导在本文引用作为参考。用于核酸（例如DNA）递送的适当的细菌包括但不限于沙门氏菌属（Salmonella）、志贺氏菌属（Shigella）、利斯特菌属、或大肠杆菌（E.coli）。通常优选使用细菌的突变的减毒形式，例如营养缺陷型。例如适当的沙门氏菌属菌株包括但不限于鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）aroA营养缺陷型SL7202(见例如Darji等人,(1997)Cell,91:765‑775)、鼠伤寒沙门氏菌aroA、dam‑营养缺陷型RE88(见例如Heithoff等人,(1999)Science.284:967‑70)、鼠伤寒沙门氏菌msb‑、purI营养缺陷型VNP20009(见例如Clairmont等人,(2000)J.Infect.Dis..181(6):1996‑2002;Low等人,(2004)Methods Mol.Med.,90:47‑60)，或鼠伤寒沙门氏菌原养型LT2（ATCC#700720）。通过沙门氏菌属的DNA接种的例示性模式显示在图4中。
组合疗法
本发明的疫苗可以与在患者护理中使用的其他治疗形式组合。在治疗的一个实施方案中，疫苗与肿瘤的手术切除协同使用。在另一组治疗实施方案中，疫苗与减小肿瘤尺寸、可能破坏肿瘤脉管系统或使得肿瘤对免疫应答敏感的化学疗法或放射疗法组合。特别用于与本发明疫苗的组合疗法的化学疗法或放射治疗剂包括但不限于DNA损伤剂如环磷酰胺；抗代谢物例如吉西他滨，以及破坏细胞骨架功能的活性剂例如紫杉醇。此类活性剂减少了肿瘤生长并且可以破坏肿瘤脉管系统，不希望受到理论限制，相信这将使得肿瘤对免疫应答更敏感。
在组合疗法中，通常在化学疗法或辐射后以这样的方式施用疫苗，所述方式使得有效抗肿瘤免疫应答的形成不被先前治疗的潜在剩余效果所破坏。
在组合疗法的另一实施方案中，疫苗治疗可以与免疫细胞因子治疗组合。不希望受到理论限制，当促进免疫应答的细胞因子在肿瘤微环境中存在时，相信疫苗产生更有效的免疫应答。例如，特别有用的免疫细胞因子是引发Th1应答的那些，例如IL‑2或IL‑12。在组合疗法过程中，例如患者可以首先接受本发明的疫苗以产生针对肿瘤的免疫应答，然后接受能够靶向肿瘤并且支持肿瘤中免疫应答的免疫细胞因子。优选的免疫细胞因子一般具有例如识别肿瘤的表面抗原特征的抗体部分（例如EpCAM），或识别肿瘤的坏死核心的特征（例如DNA）的抗体部分。免疫细胞因子一般具有细胞因子部分例如IL‑2、IL‑12，或优先指导Th1应答的其他细胞因子部分。适合于本发明的免疫细胞因子描述在美国专利号5650150，其内容在本文引用作为参考。
实施例
本发明的实践将从下列实施例中更充分理解，所述实施例在本文被给出仅用于例示性目的，并且不应当被理解为以任何方式限制本发明。
实施例1.克隆鸡存活蛋白、产生鸡存活蛋白变体、构建在沙门氏菌中复制并且在哺乳动物细胞中表达鸡存活蛋白的质粒
分离所需DNA分子的方法是本领域技术人员熟知的。例如，当所需DNA分子的序列是已知的，通常使用反转录和聚合酶链式反应（RT‑PCR），或者可以通过使用商用提供者如Blue Heron Biotechnology Inc.(Bothwell,WA)通过化学合成获得DNA分子。为了获得编码野生型鸡存活蛋白的DNA，对从鸡肝分离的多聚A+mRNA（BD Biosciences，货号636307）进行RT‑PCR，在第一轮反转录和扩增中使用长模板上标一步PT‑PCR试剂盒（Superscript One‑Step RT‑PCR for Long Templates Kit）(Invitrogen,Carlsbad,CA)和一组外部引物，并且使用Supermix高保真试剂盒（High Fidelity Kit）(Invitrogen)和一组内部引物用于第二轮扩增。外部引物是有义引物5'‑GAAAAATGGCGGCCTATGC‑3'(SEQ ID NO:17)和反义引物5'‑CACCGTAGACCCAGAGGAACC‑3'(SEQ ID NO:18),内部引物分别是有义引物5'‑CTCTAGAATGGCGGCCTATGCTG‑3'(SEQ ID NO:19)（掺入Xba I限制性位点（以下划线表示））和反义引物5'‑CCTCGAGACCTAAGGGCCCATGTTCTC‑3'(SEQ ID NO:20)（掺入了Xho I限制性位点（以下划线表示））。将扩增的PCR产物用凝胶电泳分开、分离并且克隆到pCR2.1载体（Invitrogen），并且检验其序列。野生型鸡的核苷酸和氨基酸序列分别以SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:11显示在序列表中。
将编码全长野生型鸡存活蛋白的核酸片段转移到适合于其在哺乳动物中表达的表达载体中。例如将野生型鸡存活蛋白编码序列的XbaI/XhoI消化的片段插入到类似切割的质粒pdCs中（见Lo等人，（1998）Protein Engineering11:495），将野生型鸡存活蛋白基因放置在受到CMV启动子调控之下。
作为另一个实例，将编码野生型鸡存活蛋白的片段掺入到表达载体pdCs‑huFc(见Lo等人，（1998）Protein Engineering11:495)，将缺乏起始甲硫氨酸的全长野生型鸡存活蛋白片段置于编码人Fc序列的下游，产生编码huFc‑鸡存活蛋白融合蛋白质的质粒。简言之，使用PflMI/XhoI野生型鸡存活蛋白片段（PflMI位点是在野生型鸡存活蛋白的核苷酸26）、Smal/Xhol pdCs‑huFc质粒片段(见Lo等人,(1998)Protein Engineering11:495)，以及恢复野生型鸡存活蛋白序列5’末端（省略起始ATG密码子）的接头寡核苷酸双链体分子来进行三元连接。通过杂交互补寡核苷酸：有义5'‑GGGTGCAGCGGCCTATGCTGAAATGCTGCCCAAGGA‑3'(SEQ ID NO:22)和反义5'‑TTGGGCAGCATTTCAGCATAGGCCGCTGCACCC‑3'(SEQ ID NO:23)寡核苷酸形成双链体接头分子。通过测序检验正确编码的融合蛋白质的产生。成熟人Fcγ‑鸡存活蛋白（鸡存活蛋白减去起始Met）核苷酸序列以SEQ ID NO:24显示在序列表中。
为了获得编码muFc‑鸡存活蛋白的表达载体，将来自pdCs‑huFc‑鸡存活蛋白的用Sma I/XhoI消化的野生型鸡存活蛋白片段转移到类似处理的pdCs‑muFc衍生的表达载体，得到muFc和野生型鸡存活蛋白之间的嵌合序列，其中鸡存活蛋白符合读框地直接位于编码muFc的CH3部分的序列下游。通过此表达载体编码的muFc部分是IgG2a同种型的。成熟muFcγ2‑鸡存活蛋白的核苷酸序列（鸡存活蛋白减去起始Met）显示在SEQ ID NO:26中。成熟mu‑Fc鸡存活蛋白的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:27中。
编码鸡存活蛋白（N97E、T99M、V100L、Q101G）的鸡存活蛋白序列通过掺入诱变引物的PCR方法来产生。在诱变有义引物（Mutls)5'‑CCTCTGAACTGATGTTGGGGGAGTTCTTGAAGCTGGAT‑3'(SEQ ID NO:28)和反义引物(Mutla)5'‑AACTCCCCCAACATCAGTTCAGAGGGATCTTTCTG‑3'(SEQ ID NO:29)中的密码子取代以下划线表示，并且消除EcoRI位点的A到G的取代以粗体表示。从野生型鸡存活蛋白DNA模板产生两个重叠的PCR片段，上游片段使用侧翼引物Pr1s(5'‑CCGCGGCCGCCCCCTTCACCATGGCGGCCTATGCTGAAATG‑3')(SEQ ID NO:30)和Mutla，并且下游片段使用侧翼引Pr1a(5'‑AGATCTGGATCCCTAAGGGCCCATGTTCTCTATC‑3')(SEQ ID N0:31)和Mutls分别用于扩增。用得到的PCR片段进行PCR反应，结合引物Pr1s和Pr1a，产生全长产物，将所述全长产物克隆到pCR2.1载体（Invitrogen），并且检验其序列。将编码鸡存活蛋白（N97E、T99M、V100L、Q101G）的片段用Not I/Bam HI切割并且连接到类似消化的pdCs表达载体中。鸡存活蛋白（N97E、T99M、V100L、Q101G）的蛋白质序列显示在SEQ ID NO:12中，并且氨基酸序列显示在SEQ ID NO:62中。
实施例2从其他非哺乳动物合成存活蛋白基因并且构建哺乳动物表达载体
根据本发明，在疫苗组合物中使用来自其他脊椎动物非哺乳动物的存活蛋白基因和蛋白质。例如，通过与实施例1中描述的类似的方法或通过分子生物学领域技术人员已知的其他方法获得来自鱼例如河豚鱼、鲨鱼、鲶鱼或斑马鱼，或来自两栖动物如爪蟾属，或来自爬行动物如短吻鳄、鳄鱼、龟、蜥蜴或火蜥蜴，或来自除鸡外的其他鸟的存活蛋白基因。在一些情形中，例如已经描述了爪蟾属、斑马鱼、鲶鱼和河豚鱼的存活蛋白同源物（其序列在本申请的序列表中提供）存活蛋白同源物并且是从公共数据库例如PubMed可得到的。当已知存活蛋白同源物的基因序列时，从可商业的DNA合成公司（例如Blue Heron Biotechnology(Bothell,WA)）获得相应的DNA。
通过与实施例3、4和5中类似的方法将来自此类鱼、两栖动物、爬行动物和鸟的存活蛋白同源物构建到疫苗组合物中。例如，将来自爪蟾、斑马鱼、鲶鱼和河豚鱼的存活蛋白基因在编码序列的末端添加了5’XbaI位点和3’XhoI位点后，放置到质粒pdCs中。这是例如使用与实施例1中类似的PCR方法或通过连接体侧接的相关编码序列的总基因合成来进行。然后将pdCs‑存活蛋白质粒通过实施例3中描述的方法放置到沙门氏菌属菌株中。
备选地，如实施例1中的，将存活蛋白基因构建到表达Fc存活蛋白融合蛋白质的质粒中，并且将Fc‑存活蛋白融合蛋白质用作疫苗。例如，将来自爪蟾、斑马鱼、鲶鱼或河豚鱼的存活蛋白基因在编码序列的末端添加了5’XmaI位点和3’XhoI位点后，放置到质粒pdCs中。这是例如使用与实施例4中类似的PCR方法或通过连接体侧接的相关编码序列的总基因合成来进行。然后将Fc‑存活蛋白质粒放置到适合于高水平表达的哺乳动物细胞系，例如NS/0细胞，将得到的分泌的蛋白质收集并且按照实施例4中的纯化，与佐剂一起配制，并且如实施例5所示接种人或动物。
实施例3.构建包含本发明质粒的沙门氏菌属菌株
通过本领域技术人员熟知的下面说明的标准电穿孔方案产生用于接种的携带本发明质粒的沙门氏菌属菌株。例如，将质粒pdCs‑鸡存活蛋白转化到没有质粒的沙门氏菌属菌株（例如减毒的鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）aroA菌株SL7207）中。其他减毒的沙门氏菌属菌株也可以使用，例如具有基因型aroA,dam‑的RE88、具有基因型msb‑,purI的VNP20009或备选地原养型LT2菌株。也可以使用伤寒沙门氏菌（Salmonella typhii）菌株，优选是减毒的。
为了制备电感受态细菌，在至少0.5的OD600时收获50ml沙门氏菌属的对数期培养物，将其在冰上冷却，继而将细胞在等体积然后在一半体积的冰冻1mM HEPES中洗涤，并且再次沉淀。然后将细胞重悬在1ml冷的10%甘油、1mM HEPES中，沉淀并且通过温和吹打最终重悬在0.5ml冷的10%甘油、1mM HEPES中。将细胞保持在冰上直到使用，或者等分试样储存在‑80℃.
对于电穿孔，将40毫升电感受态的细菌添加到预冷的1.5ml微量离心管中，与高达2微升体积中的高达200ng的超螺旋质粒pdCs‑鸡存活蛋白组合，并且通过轻打混合。将细菌‑DNA混合物转移到预冷的0.2cm有口样品池（gap cuvette）（Bio‑Rad，Hercules，CA），并且用2500V、25μF、200ohm的电脉冲电穿孔，通常导致4.5+/‑0.2的时间常数，其后添加1ml的SOC培养基。在37℃温育1小时后，将0.1ml的细胞接种在LB抗生素选择平板（100微克/ml氨苄青霉素）上。
获得并且培养单菌落隔离群，并且分离质粒DNA以通过限制性分析证实其身份。将新生长的确认的培养物补充15%的甘油，以500毫升等分试样速冻，并且储存在‑80℃中。
实施例4Fc‑存活蛋白融合蛋白质的转染、表达、初步表征和纯化
A.Fc‑存活蛋白融合蛋白质的转染和表达
例如，对于蛋白质表达、质粒表达的快速分析，通过使用脂质转染胺试剂（Invitrogen）的瞬时转染，通常将muFc‑鸡存活蛋白或muFc‑mu存活蛋白引入到细胞系，例如人胚胎肾HEK293细胞（ATCC#CRL‑1573）。
为了获得表达Fc‑存活蛋白的稳定转染的克隆，例如，通过电穿孔将适当的质粒DNA引入到小鼠骨髓瘤NS/0细胞。NS/0细胞生长在Dulbecco的修饰的Eagle培养基，所述培养基补充了10%热‑灭活胎牛血清培养基、2mM谷氨酰胺和青霉素/链霉素。将大约5×106细胞用PBS洗涤一次，并且重悬在0.5ml的PBS中。然后将10μg线性化的质粒DNA与细胞一起在Gene Pulser Cuvette（0.4cm电极间隙，BioRad，Hercules，CA）中在冰上温育10分钟。使用设置为0.25V和500mF的Gene Pulser（BioRad）进行电穿孔。将细胞在冰上恢复10分钟，然后将它们重悬在生长培养基中并且在2个96孔板上平板接种。稳定转染的克隆通过在100nm氨甲喋呤（MTX）存在下选择，其中氨甲喋呤在转染后两天添加到生长培养基。每3天向细胞喂饲两次或多次,在2到3周中出现MTX‑抗性克隆。通过抗‑Fc ELISA测定来自克隆的上清液来鉴定高生产者。分离高生产克隆并且将其在包含100nm MTX的生长培养基中繁殖。通常使用H‑SFM或CD培养基（Invitrogen）生长培养基。
备选地，通过与上述描述方法类似的方法，用氨甲喋呤选择在人胚肾HEK293细胞中获得稳定表达Fc‑存活蛋白融合蛋白质的克隆。将HEK293克隆保持在补充10％FBS的DMEM上。
B.Fc‑存活蛋白融合蛋白质的纯化和分析
基于Fc蛋白质部分对A蛋白的亲和性进行包含Fc的融合蛋白质的标准纯化。简言之，用编码Fc‑存活蛋白融合蛋白质的质粒转染的细胞通常在补充了0.1μM MTX的H‑SFM中在滚瓶中生长，并且将包含融合蛋白质的细胞上清液上样到预先平衡的（50mM磷酸钠、150mM NaCl、中性pH的0.01%TWEEN80）A蛋白琼脂糖快速流动（Sepharose Fast Flow）柱上。将柱子在此缓冲液中充分洗涤，在低pH（pH2.5）下在与上面相同的缓冲液中洗脱结合的蛋白质，将级分用1M的Tris碱（pH11）变成pH6.7.
将A蛋白琼脂糖‑纯化的Fc‑存活蛋白融合蛋白质通过分析型大小排阻层析（SEC）进行分析，并且发现通常大部分物质处于聚集状态。这一结果是意料之外的，因为存活蛋白通常是细胞质蛋白质。不希望受到理论限制，认为当存活蛋白被Fc‑存活蛋白融合蛋白质的Fc部分强制进入分泌途径中时，存活蛋白折叠受损害，特别是因为存活蛋白包含很多参与二硫键形成的半胱氨酸。由于这一聚集会干扰生物学活性，因此当蛋白质要被使用作疫苗时，聚集是不希望的。
融合蛋白质的完整性和纯度是通过还原性SDS‑PAGE电泳来验证的。在大约45kDa（即融合蛋白质的希望大小）看到最强的条带。也存在大量次级条带：蛋白质确实聚集的另一证据。
C.ELISA步骤
通过抗‑Fc ELISA测定MTX‑抗性克隆和其他测试样品的上清液中包含Fc的蛋白质产物的浓度。
i包被平板
用PBS中的5μg/mL的AffiniPure山羊抗鼠IgG（H+L）（Jackson Immuno Research Laboratories,West Grove,PA）包被ELISA，包被为96孔板中100μL/孔（Nunc‑Immuno plate Maxisorp）。盖上包被的平板并且在4℃过夜温育。然后用PBS中的0.05%Tween（Tween20）将平板洗涤4此，并且用PBS中的1%BSA/1%山羊血清以200μl/孔封闭。在用封闭缓冲液在37℃温育2小时后，用PBS中的0.05%Tween将平板洗涤4次，并且在纸巾上吸干。
ii.用测试样品和二级抗体温育
根据需要在样品缓冲液（PBS中的1%BSA/1%山羊血清/0.05%Tween）中稀释测试样品。使用浓度已知的嵌合抗体（具有人Fc）制备标准曲线。为了制备标准曲线，在样品缓冲液中进行顺序稀释以提供范围在125ng/mL到3.5ng/mL内的标准曲线。将稀释的样品和标准品以100μl/孔添加到平板上，并且在37℃将平板温育2小时。温育后，将平板用PBS中的0.05%Tween洗涤8次。向每孔添加100μl的二级抗体（辣根过氧化酶缀合的抗人IgG（Jackson Immuno Research）），所述抗体在样品缓冲液中稀释大约1:120000。对于每批来说，待使用的二级抗体的精确稀释度是不同的。在37℃温育2小时后，用PBS中的0.05%Tween洗涤8次。
iii.显色
将底物溶液以100μL/孔添加到平板中。底物溶液按照以下制备：将30mg的OPD(邻苯二胺二盐酸盐)（OPD）（1片）溶解到15mL的0.025M柠檬酸/0.05M Na2HPO4缓冲液（pH5,其包含0.03%新鲜添加的过氧化氢）中。在室温下黑暗中显色大约30分钟。显色时间可以根据包被的平板、二级抗体等的批次间的差异而改变。通过以100μL/孔添加4N硫酸来终止反应。通过平板读数器读出平板，所述读数器设定在490和650nm，并且设定程序为从490nm OD减去650nm的背景OD。
实施例5疫苗递送和肿瘤攻击的方法
从Jackson Laboratories（Bar Harour，ME）购买C57Bl/6和Balb/c小鼠（7‑8周龄）。在EMD Lexigen Research Center Corp.,Billerica,MA,保持小鼠，并且根据许可的动物设施操作程序（Animal Facilities Operating Procedure）进行所有动物实验。
为了制备沙门氏菌属疫苗样品，将5ml LB/AMP培养物用单个转化的细菌菌落接种，在37℃生长过夜，在2000×g下离心10分钟，在PBS中洗涤1次，并且重悬在2ml的PBS中。测量PBS中1:10稀释的培养物的OD600，将培养物的浓度用PBS调整成109细胞/ml，其中假设1个OD600单位对应大约109细菌/ml（从将培养物的连续稀释液涂布到LB/氨苄青霉素平板来测量）。用配备有20G×1.5”的一次性进样针（穿入到胃中）的注射器进行通过经口管饲的接种。小鼠用0.1ml的10%碳酸氢钠的管饲预先处理小鼠，来中和胃酸，5分钟后，对小鼠施用0.1ml的疫苗样品（108细菌）。
测量疫苗对表达哺乳动物存活蛋白并且将存活蛋白衍生的抗原呈递到MHC上的肿瘤细胞系的效应。下面实施例中使用的肿瘤细胞系是小鼠肺癌细胞系D121、小鼠淋巴瘤细胞系A20、小鼠乳腺肿瘤系4T1、小鼠Lewis肺癌细胞系LLC、小鼠结肠癌细胞系CT26和小鼠黑素瘤细胞系B16，也可以使用表达哺乳动物存活蛋白并呈递存活蛋白衍生的抗原的其他细胞系。在一些实验中，使用已经被改造为表达人上皮细胞粘着分子（EpCAM）的肿瘤细胞系，其被称为“KSA”(例如LLC/KSA)。可以通过标准方法，用Western印迹容易地评估存活蛋白表达。以1:500稀释使用针对人和鼠存活蛋白的兔多克隆抗体（AHP604,Serotec,Raleigh,NC）。
在下列实施例中使用的肿瘤细胞系维持在下列培养基中。D121生长在补充了1%青霉素/链霉素（P/S）1%L‑谷氨酰胺、1%的丙酮酸钠和1%的非必需氨基酸的具有10%胎牛血清（FBS）的DMEM中。A20和4T1生长在具有10%FBS、1%P/S、1%L‑谷氨酰胺的RPMI。LLC生长在具有10%FBS、1%P/S、1%L‑谷氨酰胺的DMEM中。CT26生长在具有10%FBS、1%P/S、1%L‑谷氨酰胺和1%维生素B16的DMEM培养基中。CT26/KSA培养基也包括1%丙酮酸钠和1%非必需氨基酸。另外表达EpCAM的细胞系的培养基也包含1μg/ml G418。
为了评估疫苗对小鼠存活蛋白或对待治疗小鼠的肺肿瘤负荷的效应，将肿瘤细胞静脉内施用。将肿瘤细胞用PBS洗涤，胰蛋白酶化3分钟，并且用条件培养基中和胰蛋白酶。将细胞沉淀并且用PBS洗涤2次，或在D121细胞的情形中，用PBS、1%胎牛血清、50μM EDTA洗涤。通过将重悬的细胞应用到多个一次性100μM尼龙网筛(BD Falcon）来获得单细胞悬液。以每只小鼠200μl体积的细胞悬浮液，使用27计量注射针对小鼠静脉内注射到尾部静脉中。移除肺，称重并且通过评估肺被肿瘤所覆盖的面积的百分比来评分，以比较转移肿瘤负荷。
实施例6.用编码鸡存活蛋白的DNA免疫产生与哺乳动物存活蛋白交叉反应的抗体
为了检测用编码鸡存活蛋白的核酸接种是否会产生与哺乳动物存活蛋白交叉反应的抗体，进行下列实验。使用Davis((1996)Adv.Drug Delivery Reviews21:33)所描述的免疫方案作为实验基础。用编码野生型鸡存活蛋白（ChSur）或muFc‑鸡存活蛋白（FcChSur）的表达质粒或用编码muFc‑癌胚抗原（CEA）（FcCEA）的对照表达质粒，对7‑8周龄的雌性Balb/c小鼠（每个处理组n=2）免疫一次（第一天）或三次（第1、21和46天）。用100μl的10μM心脏毒素在胫骨前肌中注射小鼠，5天后用100μg的质粒DNA注射小鼠。在第62天，对小鼠取血，并且测定血清中针对鼠存活蛋白的抗体。将顺序稀释的血清应用到用muFc‑mu存活蛋白融合蛋白质包被的ELISA平板上，洗涤平板，将样品与过氧化物酶缀合的抗小鼠IgG2a抗体一起温育。通过比色测定与阴性对照幼稚小鼠相比，ELISA检测到抗存活蛋白抗体的存在。表2中显示的结果表明存活蛋白DNA疫苗在引发对鼠存活蛋白反应的抗体中是有效的，而对照DNA疫苗则无效。
表2:抗鼠存活蛋白抗体效价

在Western印迹或ELISA中，进一步测试小鼠抗‑存活蛋白抗体对人存活蛋白的交叉反应性。期望通过用鸡存活蛋白疫苗组合物接种小鼠获得的小鼠存活蛋白抗体也结合人存活蛋白蛋白质。
实施例7.用编码存活蛋白的DNA接种哺乳动物引发对癌细胞的T细胞免疫应答
为了确定基于沙门氏菌属的存活蛋白疫苗刺激针对癌细胞的T细胞应答的能力，进行下列实验。如实施例5所示，用SL7207沙门氏菌属菌株在第0和第14天接种Balb/c小鼠，所述沙门氏菌属菌株携带AroA突变（Medina等人,(1999)Infection and Immunity,第1093‑1099页），并且还携带编码鼠存活蛋白（n=2）或野生型鸡存活蛋白（n=2）的哺乳动物表达载体。在此实验中将幼稚的未免疫的小鼠（n=2）用作阴性对照。
第一次接种后一个月，提取并且合并每组的脾细胞。将CD8+T细胞纯化并且在鼠IFNγELISpot测定中用作应答者，基本上如下述。在此测定中，将A20和4T1肿瘤细胞系用作效应细胞（图6）。4T1细胞已被改造为表达人上皮细胞粘着分子（EpCAM），但是认为这与本实验无关。与对照动物相比，接种的小鼠中存在显著更多的IFNγ应答T细胞。用包含鼠或鸡存活蛋白表达质粒的沙门氏菌属接种与响应不同肿瘤细胞系的IFNγ分泌前体T细胞的数量提高相关。
对C57B1/6小鼠也进行相同的接种方案。在鼠IFNγELISpot测定中，将这些小鼠脾的CD8+T细胞与Lewis肺癌细胞（LLC）或B16黑素瘤细胞一起温育。LLC和B16细胞已被改造为表达人上皮细胞粘着分子（EpCAM），但是认为这与本实验无关。与幼稚C57B1/6动物相比，两种疫苗都导致了应答性T细胞的相对数量的增加，所述应答T细胞针对在I类MHC背景中表达的靶抗原的肽。与用SL7207鼠存活蛋白接种的小鼠相比，在用SL7207鸡存活蛋白接种的小鼠中产生了显著更多的针对LLC肿瘤细胞和B16细胞的IFNγ分泌细胞。
总之，这些结果表明两种接种方法都引发了CD8+T细胞前体的数量增加，所述前体与在I类MHC表位背景中展示哺乳动物存活蛋白肽的癌细胞反应。这些观察也表明用鸡存活蛋白免疫在破坏耐受性以及产生针对表达哺乳动物存活蛋白的靶细胞的免疫应答中是更有效的。
在本实施例和若干下列实施例中，使用鼠伤寒沙门氏菌菌株SL7207，但是可以使用其他沙门氏菌属菌株，例如伤寒沙门氏菌。当用人中的伤寒沙门氏菌治疗人时，通常优选使用营养缺陷型，其任选地携带额外的减毒突变。
鼠IFNγELISpot测定方案:
基本上如Power等人(Power等人,(1999)J.Immunol.Meth.227:99‑107)所述进行ELISpot测定。使用Miltenyi CD8+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotech,Auburn,CA)，从脾细胞分离CD8+T细胞，并且将其在自动磁珠分选仪上根据制造商说明书分选。将CD8+T细胞保持在补充0.7ng/ml IL‑2(R&D Systems)的RPMI中。24小时内，将活细胞在梯度上纯化并且重悬终浓度106细胞/ml。将CD8+T细胞以从105细胞/孔起始的连续稀释接种在鼠IFNγELISpot平板（BD Biosciences,San Jose,CA）中，所述平板用5μg/ml的抗鼠IFNγ抗体预包被。所有肿瘤细胞系以5×104细胞/孔的浓度添加。18‑24小时后，移除细胞，将抗IFNγ包被的膜用PBS中的0.05%Tween洗涤，与在PBS中的针对IFNγ的二级生物素化抗体和2%胎牛血清一起温育，通过暴露于链霉抗生物素蛋白缀合的HRP和AEC(3‑氨基‑乙基咔唑)乙酸盐溶液显示结合的二级抗体。将对应于分泌IFNγ的CD8+T细胞的点用Zeiss KS ELISpot系统(Muenchen‑Hallergmoss,德国)定量。
实施例8.用鸡存活蛋白体外免疫来自人的免疫细胞
为了证实非哺乳动物存活蛋白序列例如鸡存活蛋白序列对引发人中抗存活蛋白应答的能力，使用患者外周血细胞（hu PBMC）进行体外免疫测定。大体上，从hu PBMC纯化树突细胞（DC）和T细胞，用所选择的抗原装载树突细胞，并将其与T细胞一起温育，并且使用本领域技术人员熟悉的标准方法，测定暴露于例如以表达人存活蛋白的靶细胞的形式存在的存活蛋白肽的T细胞的应答。
例如，DC(来自HLA‑A2+患者的huPBMC并且使用IL‑4和GM‑CSF衍生)用已知为HLA‑A2+等位基因表位的对照存活蛋白肽序列如LMLGEFLKL(SEQ ID NO:6)脉冲，或者用实验肽脉冲，所述实验肽例如(i)30‑mer鸡存活蛋白衍生的肽GCAFAALQKDPSELMLGEFLKLDRERAKNV(SEQ ID NO:32);(ii)野生型鸡存活蛋白肽;或(iii)突变的鸡存活蛋白肽，例如鸡存活蛋白(N97E,T99M,V100L,Q101G)(SEQ ID NO:12)。备选地，将表达这些序列的DNA构建体引入DC中。在与肽或蛋白质温育后，或在表达了引入的DNA后，将DC辐射并且洗涤以移除过量的外源添加的肽，然后与同基因的T细胞在IL7和IL‑2的存在下混合。在每周基础上通过混合培养的T细胞与新鲜处理的和辐射的DC再次刺激T细胞。
在一个测定中，存活蛋白反应T细胞的存在通过IFNγELISpot测定检测，基本上如实施例7所描述的。备选地，常规[51Cr]释放测定用于评估这些细胞的功能活性，其中在I类MHC分子背景中呈递存活蛋白肽的靶肿瘤细胞被装载[51Cr]，并且与这些T细胞一起温育，通过[51Cr]释放定量肿瘤细胞裂解。将不表达存活蛋白的对照靶细胞系用作阴性对照。希望实验制品在产生T细胞中至少与对照制品一样有效，所述T细胞应答存活蛋白，这表明鸡存活蛋白衍生的序列可以作用为指导针对表达人存活蛋白的特异性免疫应答的表位。
实施例9.对肺癌的接种效应
为了确定在第二次治疗被延迟到肿瘤攻击后，疫苗引发的免疫应答是否能够抑制转移肿瘤的生长，进行下列实验。
在第0天，C57B1/6小鼠（每个处理条件n=5）用100μl的10%碳酸氢钠口服接种，随后用108个SL7207沙门氏菌接种，所述沙门氏菌包含:编码突变的鸡存活蛋白（鸡存活蛋白(N97E,T99M,V100L,Q10lG)）的质粒；编码muFc‑鸡存活蛋白的质粒；或具有两个转录单元的质粒，其中一个编码鸡存活蛋白(N97E,T99M,V100L,Q10lG)，另一个编码作为佐剂的融合蛋白质muFc‑muIL2。用PBS处理对照小鼠。
小鼠用100μl的10%碳酸氢钠口服预先给药，并且施用在PBS中的SL7207沙门氏菌（如上文描述制备）。引发接种10天后，将小鼠用200μl的PBS中的1×106LCC/KSA细胞的单细胞悬液静脉内注射，并且使用相同浓度的沙门氏菌用第二次口服接种加强。在第32天处死小鼠。
典型结果显示在下表（表3）中。结果显示用携带有鸡存活蛋白构建体的表达载体的沙门氏菌接种提供了针对转移肺癌的相似保护。
表3.用存活蛋白疫苗治疗的具有肺癌的小鼠的肺重量和转移评分。

表3中，（*）肿瘤负荷在0‑3（0=肺中没有肿瘤、1=<5%肿瘤负荷、2=5‑50%肿瘤负荷、3=>50%的肺被肿瘤覆盖）的标度上评分。斜体并且粗体的肿瘤分数表明在尾根部发现额外的肺肿瘤。
实施例10.用SL7207鸡存活蛋白或鼠存活蛋白接种显著延迟了死亡
为了确定用携带存活蛋白表达质粒的沙门氏菌SL7207接种是否降低了肿瘤负荷并且增加了存活，将Balb/c小鼠（每个处理条件n=5）如前所述用经口管饲法用PBS、具有鼠存活蛋白表达质粒的SL7207沙门氏菌或具有野生型鸡存活蛋白表达质粒的SL7207沙门氏菌给药两次，间隔两周。第二次接种两周后，将小鼠静脉内注射200μl5×l05细胞/ml CT26/KSA同基因细胞（其还表达人EpCAM蛋白质，这认为与本实验不相关）的PBS悬液。监测小鼠的存活。如在图7中所示，与用PBS或SL7207鼠存活蛋白处理的小鼠相比，在用SL7207鸡存活蛋白处理的小鼠中存活谱更长。
实施例11.由于用携带存活蛋白表达载体的沙门氏菌接种，具有癌转移的哺乳动物的延长的存活
为了解决具有预先存在的癌症的哺乳动物是否可以用携带存活蛋白表达质粒的沙门氏菌接种，进行下列实验。在该实验中，用0.1ml的10%碳酸氢钠预处理C57B1/6，然后在第0天用PBS中的大约1亿个包含鼠存活蛋白（n=5）或鸡存活蛋白(N97E,T99M,V100L,Q101G)(n=5)的载体的SL7207沙门氏菌（如上所述制备）口服接种。用碳酸氢钠和PBS(n=5)管饲对照小鼠。在引发接种10天后，将小鼠静脉内注射200μl1×l06LLC/KSA细胞（其还表达人EpCAM蛋白质，这认为与本实验不相关）的PBS悬液。所有小鼠用在肿瘤注射4小时施用的第二次口服接种加强，使用相同浓度的为引发免疫应答所施用的沙门氏菌。
在肿瘤攻击后，在12周内跟踪存活。所有对照小鼠在肿瘤施用35天内死亡。重要地，所有用一种存活蛋白构建体接种的小鼠在第35天仍然存活。在SL7207鸡存活蛋白（N97E,T99M,V100L,Q101G）处理组中的所有小鼠在LLC/KSA注射10周内死亡。在用SL7027鼠存活蛋白处理的组中三个月后有一只动物存活。两个处理组之间没有显著差异（p=0.243）。
在图8中，显示了针对用LLC/KSA细胞的肿瘤攻击的接种的存活曲线。
实施例12.使用预测算法评估存活蛋白序列中的取代
预测算法可以用来评估本发明的存活蛋白变体是否包含潜在的抗原表位，或相反，亚优势的抗原表位是否可能是改良的。例如，hu存活蛋白变体huSur(R18E,H77A,C84A,A128P)(SEQ ID NO:84)可以使用公开可用的数据库就蛋白体切割位点预测进行分析，所述数据库例如NetChop(www.cbs.dtu.dk/NetChop)，并且使用数据库就主要的MHC I HLA超型的表位预测进行分析，所述数据库例如SYFPEITHI(www.syfpheithi.de)。使用NetChop，发现将取代R18E、H77A、C84A、A128P引入人存活蛋白不剧烈改变切割模式（“S”表明高于阈值0.8的潜在切割位点），如所示:
E
mgaptlppawqp flkdhrist fknwp flegcactpermaeag fihcptenepdl
S....S...S..SSSS..S..SS......S.......S...............S野生型
S....S....S.SSSS..S..SS......S.......S...............S变体
A A
aqcffcfkel egwepdddpi eehkkhssgcafl svkkqfeeltlgeflkldrer
...SS.SS.S............SSS.......S........S.SS...SS....野生型
...SS.SS.S............SS........S...S....S.SS...SS....变体
P
Aknkiaketnnkkkefeetakkvrraieqlaamd(SEQ ID NO：8)
....S.......SS.....S.SS......S..S.野生型
....S.......SS.S.....SS.S....S..S.变体
以粗体和下划线显示预先鉴定的结合HLA‑A0201亚型的的抗原表位，并且NetChop不预测此表位的C端切割位点。
使用SYFPEITHI，就结合HLA超型A2、A3和B7的表位分析huSur(R18E,H77A,C84A,A128P)(SEQ ID NO:84)，所述超型一起覆盖了大约至少85%的人群（见Sette等人,(1999)Immunogen.50:201‑212）。当与野生型hu存活蛋白相比时，对HLA‑A0201和HLA‑A03，顶端级别的表位是相同的，而对于HLA‑B0702，变体存活蛋白序列提供了顶端级别的表位，这是因为取代H77A实现的更偏好的C端锚定残基。因此，肽EPDDDPIEEA(SEQ ID NO:33)可以是比肽EPDDDPIEEH(SEQ ID NO:34)更好的抗原肽。
如NetChop分析所表明的，另外的取代如P47L和Q56L，可以被引入到huSur(R18E,H77A,C84A,A128P)，并且该序列可以通过上述SYFPEITHI再次分析。人存活蛋白（R18E,H77A,C84A,A128P）的序列显示在SEQ ID NO:84中。人存活蛋白(R18E,P47L,Q56L,H77A,C84A,A128P,I135P)的序列显示在SEQ ID NO:56中。具体地，突变P47L加强了肽CPTENEPDL(SEQ ID NO:2)（其被改变为CLTENEPDL(SEQ ID NO:35)）中的锚定位置2。
类似地，取代Q56L产生了肽ALCFFCFKEL(SEQ ID NO:36)，其与AQCFFCFKEL(SEQ ID NO:37)（其被预测为是HLA‑A0201的弱结合物）相比在位置2具有优选的锚定残基。当与野生型hu存活蛋白相比时，Q56L变体存活蛋白序列产生了预测作为抗原的肽，所述肽与验证的hu存活蛋白抗原肽ELTLGEFLKL(SEQ ID NO:38)一样强（Andersen等人(2001)Cancer Res.61:869‑872）。
根据本发明，此类分析可以产生存活蛋白序列，所述序列包含高抗原肽，所述肽是CTL较不可能耐受的，例如，通过促进应答亚优势的表位。
实施例13.用包含表达非哺乳动物存活蛋白的疫苗治疗人癌症患者
根据本发明，如下用本发明的疫苗治疗患癌的人。首先，用诊断试剂任选地将用于治疗的候选者分类，所述诊断试剂测试他们的癌细胞是否过量表达存活蛋白。例如，可以用抗存活蛋白抗体通过免疫荧光分析肿瘤样品。备选地，候选患者的肿瘤样品可以通过与检测存活蛋白mRNA水平的基因芯片的杂交、通过反转录酶PCR、或通过检测存活蛋白mRNA或蛋白质水平的任何其他方法进行分析。也可以同样基于其他诊断测试将患者分类，所述测试为例如MHC表达水平的测试、已知涉及T细胞介导的杀伤的信号转导分子的水平，或基于功能未被了解但是其通过经验已知与免疫治疗的应答相关的分子的水平。
特别有用的是选择已经经历了大多数肿瘤手术切除的人类患者。这允许如上所述进行肿瘤的诊断分析。另外，不希望受到理论限制，有利地在手术切除后治疗，因为大块肿瘤可以简单的逐步增强免疫系统。另外，肿瘤分泌可扩散的免疫抑制因子，其在大块中比在小的转移中更容易达到更高的浓度。
选择用来治疗的患者具有黑素瘤、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、肾癌、成胶质细胞瘤、头颈癌和其它癌症。
在适当的诊断和患者选择后，用具有非哺乳动物存活蛋白表达载体（在哺乳动物细胞中用于表达非哺乳动物存活蛋白的载体）的沙门氏菌菌株治疗患者。例如，患者可以接受大约109到1013个活的沙门氏菌LT2，所述LT2携带具有哺乳动物启动子驱动的鸡存活蛋白表达的质粒。优选地，使用大约1010‑1012个细菌，更优选大约2×1011个沙门氏菌被施用。沙门氏菌菌株优选是营养缺陷型的，可以使用实施例中提到的任一种菌株。
可以使用两种备选方法解决在胃的酸性环境中沙门氏菌细菌的存活问题。通过第一种方法，患者首先摄入安全和有效量的碳酸氢钠以中和胃酸。通过另一种方法，将沙门氏菌细菌与肠包衣一起配制为丸剂，所述肠包衣允许通过胃并且在小肠中溶解。
当使用鼠伤寒沙门氏菌细菌菌株时，副作用可以包括轻微的腹泻；鼠伤寒沙门氏菌天然是小鼠病原体并且对于人通常不是致病性的。优选针对症状治疗此类温和腹泻，但是不用抗生素治疗，因为后一治疗会破坏疫苗效果。
实施例14.相对于肿瘤攻击的接种定时
进行实验来测试相对于肿瘤攻击时间，用鸡存活蛋白接种的定时的重要性。将小鼠通过经口管饲用包含编码鸡存活蛋白(N97E,T99M,V100L,Q101G)的质粒的沙门氏菌给药。给药方案显示在图9中。如所示，在第1和13天；第7和13天；第10和18天或第13和21天进行经口管饲，相对的在第10天由LLC/KSA细胞静脉内攻击并且在第29天评估肿瘤肺负担。如图10所示，用包含编码鸡存活蛋白(N97E,T99M,V100L,Q101G)的质粒的沙门氏菌经口管饲对于减少肺肿瘤负荷是有效的，而无论所使用的给药方案如何。当肿瘤攻击之前3天以上施用引发疫苗剂量时，疫苗效果更显著。
也评估了改变给药方案对肺转移的效果。肺转移如下评分，肺表面肿瘤覆盖超过50%的小鼠得分为3；肺表面肿瘤覆盖5‑50%的小鼠得分为2；肺表面肿瘤覆盖不足5%的小鼠得分为1；没有可见的肺肿瘤集落的小鼠得分为0。如图10所示，与更靠后的给药方案相比，或与未用鸡存活蛋白(N97E,T99M,V100L,Q101G)口服免疫的小鼠相比，包括在肿瘤攻击前的首次剂量的给药方案倾向于减少肺转移分数。
实施例15.用存活蛋白疫苗与化学疗法的组合疗法
也评估了组合针对存活蛋白接种的化学疗法的效果。测试方案显示在图11中。如图中所示，接受完全治疗的小鼠用具有编码野生型鸡存活蛋白的质粒的沙门氏菌在第1天引发。将LLC/KSA细胞在第4天静脉内引入（攻击）。在第11天腹膜内施用环磷酰胺（CTX），在第12‑15天施用吲哚美辛。在第15天，用携带野生型鸡存活蛋白质粒的沙门氏菌为小鼠提供第二次经口管饲（加强），在第28天评估肺肿瘤负荷。
其他小鼠仅接受部分治疗，接受例如:只有引发、攻击和加强（PCB）、攻击、CTX和吲哚美辛，但是没有引发或加强（C(CI)）；引发、攻击、CTX和吲哚美辛，但是没有加强(PC(CI))；或攻击、CTX、吲哚美辛和加强，但是没有引发（C(CI)B）。
如图12所示，与阴性对照相比，仅接受引发、攻击和加强的小鼠表现出减少的肿瘤负荷和减少的肺转移评分。CTX和吲哚美辛对于肺转移具有类似的效果，并且对肿瘤负荷具有更大的总体上减少。最低的肿瘤负荷和最低的肺转移评分在至少接受了引发和CTX和吲哚美辛的小鼠中观察到，表明接种治疗和化学疗法可以协同减少肿瘤负荷和肺转移。
实施例16.用编码非哺乳动物存活蛋白的DNA的基于沙门氏菌的接种与具有激活的‑记忆表型的T细胞的出现相关
从进行了前述实施例中描述的PCB、CI、PC(CI)、C(CI)B或完全(PC(CI)B)治疗的小鼠中分离外周血淋巴细胞。通过流式细胞仪分析细胞以确定治疗是否导致激活的记忆T细胞的出现。记忆T细胞的存在或不存在通过监测高表达CD44和低表达CD3(CD44亮CD3低)的细胞来确定。如图13所示，用引发‑攻击‑加强（PCB）方案治疗的小鼠显现出具有CD44亮表达模式的T细胞，这表明激活的记忆T细胞的出现。类似的模式在包括用携带编码鸡存活蛋白的质粒的沙门氏菌免疫的每个方案中观察到，而没有在仅用化学疗法治疗的小鼠中观察到（也没有在阴性对照中观察到）。
实施例17.用免疫细胞因子和用编码非哺乳动物存活蛋白的DNA接种的组合疗法
为了确定使用非哺乳动物存活蛋白的接种是否可以增强基于免疫细胞因子的肿瘤治疗的功效，将小鼠在第1天用LLC/KSA细胞皮下攻击，并且根据图14中显示的方案治疗。接受用具有编码鸡存活蛋白(N97E,T99M,V100L,Q101G)经口管饲的小鼠在第4、11、18和25天给药。选择用于本实验中的免疫细胞因子是与IL‑2与去免疫的抗‑EpCAM抗体的融合，如在美国专利申请公布2003‑0157054中所描述的。接受免疫细胞因子的小鼠在第8、9、10天静脉内接受20μg的免疫细胞因子。
在一定时间内得到的肿瘤体积显示在图15中。用免疫细胞因子的接种或治疗随时间足够减缓肿瘤生长。接受疫苗和免疫细胞因子的小鼠甚至更好，表明肿瘤生长速度与仅仅接种或与仅仅免疫细胞因子治疗相比进一步减少。
实施例18.本发明的存活蛋白构建体的生物活性的评估
将本发明的某些存活蛋白变体设计为生物学惰性的。因此，当在一定条件下在细胞中表达时，蛋白质本身不表现出抗凋亡活性，所述条件通常诱导细胞凋亡，其可以通过野生型存活蛋白蛋白质阻止。类似地，所述蛋白质不干扰内源野生型存活蛋白保护细胞免受凋亡诱导剂的影响的活性。
存活蛋白蛋白质的生物学惰性可以使用BaF3淋巴细胞前体细胞测试。BaF3细胞依赖于IL‑3生长，并且在生长因子撤除时经历凋亡，这是可以通过存活蛋白活性来抵消的（见例如Ambrosini等人,(1997)Nat.Med.3:917‑921）。将BaF3细胞用编码本发明存活蛋白构建体、野生型存活蛋白蛋白质或空的插入片段以及额外的标记蛋白质如GFP（使得可以监测外源引入的DNA）的质粒转染。在从转染回收后，从培养基中撤除IL‑3，并且监测BaF3‑细胞的凋亡，通过例如在第1、2、3和4天评估%生存力，或者通过本领域技术人员熟悉的指示凋亡的测定法，例如通过核形态（DNA浓缩和断裂）。发现尽管用野生型存活蛋白转染的BaF3细胞在4天时间内大部分保持存活，但是用空质粒或本发明存活蛋白变体转染的BaF3细胞不保持存活并且主要表现出指示凋亡的核形态。
本发明存活蛋白构建体的生物学惰性也可以使用Hela细胞测试。Hela细胞以显著水平表达内源存活蛋白，并且已知特定的突变（如hu存活蛋白(C84A)）作为存活蛋白的显性失活形式（DN存活蛋白）并且在这些细胞中诱导凋亡（见例如Li等人,(1999)Nat.Cell Biology1:461‑466）。将Hela细胞用编码DN存活蛋白或本发明的存活蛋白构建体（还有标记蛋白质如GFP，从而表达外源引入的DNA可以被监测）的质粒转染。在从转染回收后，Hela细胞生长48小时，固定，将核酸用DAPI染色，并且细胞的核形态用免疫荧光显微术分析分析。发现尽管用DN存活蛋白转染的Hela细胞通常具有经历细胞凋亡的标志，例如浓缩和断裂的细胞核，但是用本发明存活蛋白构建体转染的Hela细胞正常生长。
实施例19:本发明存活构建体稳定性的评估
为了评估存活蛋白构建体的稳定性，其可以从载体表达，所述载体另外表达标记基因如GFP从而可以相对于标准品测量表达的存活蛋白蛋白质的量。将组织培养细胞例如BHK细胞瞬时转染，并且在Western印迹中测定存活蛋白构建体的表达水平，标准化到标记表达。如果可用的抗存活蛋白抗体不识别该蛋白质，那么可以使用这些变体的C端标记的形式。发现与野生型存活蛋白相比，本发明某些优选修饰的存活蛋白构建体，如具有多个去稳定突变的那些以大量降低的水平被检测得。
除了测定稳态水平，在时间进程实验中也评估降解速度。在时间0向细胞添加翻译抑制剂放线酮，将细胞温育4小时。在0、2、5、10、20、60和240分钟，移除样品进行Western印迹分析。为了比较修饰的存活蛋白构建体和野生型存活蛋白之间的速度，将量标准化成0时间点。发现本发明某些优选修饰的存活蛋白构建体比野生型存活蛋白降解更快。
为了评估降解是否通过蛋白酶体介导的途径加工，将细胞任选在蛋白酶体抑制剂例如乳胱素存在或不存在时温育（2小时，100μM），再次通过Western印迹测定存活蛋白水平。在乳胱素存在时，发现以类似的水平检测到本发明的存活蛋白变体和野生型hu存活蛋白。