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1、(10)申请公布号 CN 102920759 A (43)申请公布日 2013.02.13 CN 102920759 A *CN102920759A* (21)申请号 201210274788.6 (22)申请日 2012.08.03 A61K 36/254(2006.01) A61K 8/97(2006.01) A61P 39/06(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61Q 19/08(2006.01) A23L 1/29(2006.01) (71)申请人 广东工业大学 地址 510006 广东省广州市番禺区广州大学 城外环西路 100 号 申请人 完美 （中国） 。
2、有限公司 五邑大学 (72)发明人 张焜 胡瑞连 王华倩 艾伦康尼 杜志云 郑希 李晨悦 郑俊霞 卢宇靖 吴盼盼 黄华容 方岩雄 赵肃清 汪舰 曾华强 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 林丽明 (54) 发明名称 一种簕菜提取物及其制备方法和应用 (57) 摘要 本发明提供了一种簕菜提取物及其制备方法 和应用， 首先称取簕菜全草， 用乙醇浸泡， 经旋转 蒸发浓缩后得到水溶液， 然后分别用油醚、 乙酸乙 酯、 正丁醇依次萃取水溶液 ； 萃取液经减压蒸馏 后得到膏体， 即得到石油醚萃取物， 乙酸乙酯萃取 物， 正丁醇萃取物， 水溶物 ； 通过抗自由基氧化实 。
3、验， 巨噬细胞生长实验、 NF-kB 核转录因子的抑制 实验和 Erk1/2 的激活作用实验， 证实簕菜提取物 具有抗氧化和抗炎能力， 添加了簕菜及其提取物 的治疗炎症的药物或抗氧化的化妆品或食品组合 物具有抗炎和抗氧化作用， 而可用于防治炎症或 衰老的化妆品、 药物、 植物性饮料及保健食品。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种簕菜提取物的制备方法， 其特征在于具体步骤如下 ： 1） 称取自然干燥的簕菜 1000g 粉碎。
4、， 过 60 目筛， 取 100g 置于 5L 圆底烧瓶中， 加 70% 乙醇溶液 2000mL 加热至沸腾后保持 2h， 再用纱布过滤， 取滤液， 重复 3 次 ； 2） 将上述提取液减压蒸干， 称重， 加适量蒸馏水， 超声提取， 冷冻干燥， 得醇提物 ； 3） 在醇提物中加入质量比 1:10 的蒸馏水溶解， 加入等体积的石油醚， 摇匀， 在分液漏 斗中静置 1h， 得石油醚层和水层， 分别萃取三次， 收集石油醚层萃取物 ； 继续按照 1:1 的体 积比依次加入乙酸乙酯、 正丁醇溶剂进行萃取， 分液后取上层溶液， 重复 3 次 ； 收集水层 物、 乙酸乙酯层萃取物和正丁醇层萃取物。 2. 一。
5、种簕菜提取物， 其特征在于 ： 采用权利要求 1 所述的制备方法制备而得。 3. 权利要求 2 所述的簕菜提取物在制备治疗炎症的药物或抗氧化的化妆品组合物中 的应用。 4. 权利要求 2 所述的簕菜提取物在制备防治炎症药物或抗氧化的食品组合物中的应 用。 5. 一种治疗炎症的药物或防治炎症药物， 其含有权利要求 2 所述的簕菜提取物， 以及 一种或多种在药学上可接受的辅助剂。 6. 权利要求 5 所述的治疗炎症的药物或药物组合物， 其特征在于所述的药物或药物组 合物包括片剂、 丸剂、 胶囊剂、 悬浮剂或乳剂。 权 利 要 求 书 CN 102920759 A 2 1/4 页 3 一种簕菜提取物。
6、及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及一种簕菜提取物及其制备方法和应用。 背景技术 0002 簕菜 （Acanthopanan trifoliatus (L.) Merr） 又称白簕、 苦刺、 鹅掌霸、 三叶五 加、 三加皮， 为五加科攀援状灌木， 主要分布于我国云南、 四川、 广东等地区， 印度东北部至 印度支那、 日本和菲律宾也有分布。 簕菜自古就是药食同源的地方特产， 其使用具有悠久的 历史。李时珍曰 ：“五加治风湿痪库， 壮筋骨， 其功良深” 。明代 食物本草 中记有 “五加， 叶 作蔬食， 去皮肤风湿” 。据 广东药用植物简编 （吴修仁编） 记载， 簕菜根、 茎、 叶均可。
7、入药， 其辛、 微苦、 涩、 凉， 气微香。根， 祛风除湿、 散痕、 止痛。叶， 疏风， 消肿， 止痒， 有舒筋活血、 消 肿解毒之功效。 据 中国高等植物图鉴 ， 簕菜味苦、 辛、 凉， 具有清热解毒、 祛风利湿、 舒筋活 血、 止咳平喘之功效。 在广东恩平等地， 簕菜因其色泽翠绿、 口感脆嫩、 品味清香、 苦中带甘， 可泡茶、 熬汤、 清炒， 且具有清热除湿降火等作用而深受当地人们的喜爱。 0003 国内外有研究者对簕菜进行了初步研究与开发。研究发现簕菜叶中含有大量的 萜烯、 萜醇类化合物以及少量的长链脂肪族和芳香族化合物， 推测其应具有明显的镇咳、 祛 痰、 抗真菌、 抗炎和祛痛等作用，。
8、 但至今未见有系统深入研究和开发应用。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供来源于植物， 用于炎症治疗或抗氧化的化妆品、 药物和保 健食品。 0005 本发明以五加科植物簕菜 （Acanthopanan trifoliatus (L.) Merr） 为原料。 0006 本发明制备簕菜提取物能有效清除各种自由基 （如超氧阴离子、 羟基自由基和过 氧化氢） 。 0007 本发明制备簕菜提取物能抑制炎症细胞巨噬细胞的生长， 抑制核转录因子 NF-B 活性， 降低小鼠巨噬细胞 RAW264.7 中 Erk1/2 的活化程度， 从而有效地减轻或抑制炎症。 0008 本发明提供了一种簕菜提取物的制备方。
9、法， 其具体步骤如下 ： 1） 称取自然干燥的簕菜 1000g 粉碎， 过 60 目筛， 取 100g 置于 5L 圆底烧瓶中， 加 70wt% 乙醇溶液 2000mL 加热至沸腾后保持 2h， 再用纱布过滤， 取滤液， 重复 3 次 ； 2） 将上述提取液减压蒸干， 称重， 加适量蒸馏水， 超声提取， 冷冻干燥， 得醇提物 ； 3） 在醇提物中加入质量比 1:10 的蒸馏水溶解， 加入等体积的石油醚， 摇匀， 在分液漏 斗中静置 1h， 得石油醚层和水层， 分别萃取三次， 收集石油醚层萃取物 ； 继续按照 1:1 的体 积比依次加入乙酸乙酯、 正丁醇溶剂进行萃取， 分液后取上层溶液， 重复 。
10、3 次 ； 收集水层 物、 乙酸乙酯层萃取物和正丁醇层萃取物。 0009 本发明提供的一种簕菜提取物， 采用上述的制备方法制备而得。 0010 本发明提供的一种用于制备治疗炎症的药物或抗氧化的化妆品组合物， 其含所述 的簕菜提取物。 说 明 书 CN 102920759 A 3 2/4 页 4 0011 本发明提供的一种用于制备防治炎症药物或抗氧化的食品组合物， 其含有所述的 簕菜提取物。 0012 本发明提供的一种用于治疗炎症的药物或药物组合物， 其含有所述的簕菜提取 物， 以及一种或多种在药学上可接受的辅助剂。 0013 所述的治疗炎症的药物或药物组合物， 包括片剂、 丸剂、 胶囊剂、 悬。
11、浮剂或乳剂。 0014 上述簕菜的石油醚萃取物在制备抗炎抗氧化剂中的用途。 0015 上述簕菜的乙酸乙酯萃取物在制备抗炎抗氧化剂中的用途。 0016 一种用于抗炎抗氧化的饮料、 化妆品、 药物或保健食品， 其中含有簕菜及其提取 物， 以及药学上可接受的辅助剂。 0017 上述用于抗炎抗氧化的饮料、 化妆品、 药物或保健食品， 其中含有簕菜石油醚萃取 物， 以及药学上可接受的辅助剂。 0018 上述用于抗炎抗氧化的饮料、 化妆品、 药物或保健食品， 其中含有簕菜乙酸乙酯萃 取物， 以及药学上可接受的辅助剂。 0019 所述的抗炎抗氧化的饮料、 化妆品、 药物或保健食品是制成片剂、 丸剂、 胶囊剂。
12、、 悬 浮剂或乳剂。 0020 本发明的有益效果是 ： 通过抗自由基氧化以及炎性因子实验验证簕菜及其提取物具有抗炎抗氧化能力。 其中 簕菜的石油醚及乙酸乙酯萃取物有很强的抗炎抗氧化能力。 附图说明 0021 图 1. 簕菜提取物对 RAW264.7 细胞 NK-B 转录活性的影响。 0022 图 2. 簕菜提取物对 Erk1 / 2 活化的抑制作用。 0023 上述图中 ： C ： 对照组 ； WE ： 水提物 ； EE ： 醇提物 ； PEL ： 石油醚部分 ； EAL ： 乙酸乙酯部分 ： NBL: 正丁 醇部分 ； WL ： 水溶物 ； CUR ： 姜黄素。 0024 磷酸化丝裂原活蛋白。
13、激酶 1 即 Phospho-Erk1 ； 磷酸化丝裂原活蛋白激酶 2 即 Phospho-Erk2 ； 肌动蛋白即 -actin。 具体实施方式 0025 本发明是通过以下方案实现 ： 实施例 1 ： 簕菜提取物的制备 提取 ： 首先称取自然干燥的簕菜 1000g 粉碎， 过 60 目筛， 取 100g 置于 5L 圆底烧瓶中， 加70%乙醇溶液2000mL加热至沸腾后保持2h， 再用纱布过滤， 取滤液， 重复3 次 ； 将上述提 取液减压蒸干， 称重， 加适量蒸馏水， 超声提取， 冷冻干燥， 得醇提物 ； 在醇提物中加入质量 比 1:10 的蒸馏水溶解， 加入等体积的石油醚， 摇匀， 在分。
14、液漏斗中静置 1h， 得石油醚层和水 层， 分别萃取三次， 收集石油醚层萃取物 ； 继续按照 1:1 的体积比依次加入乙酸乙酯、 正丁 醇溶剂进行萃取， 分液后取上层溶液， 重复 3 次 ； 收集水层物、 乙酸乙酯层萃取物和正丁醇 层萃取物。得到石油醚萃取物 1.1g， 乙酸乙酯萃取物 7.66g， 正丁醇萃取物 7.43g， 水溶物 说 明 书 CN 102920759 A 4 3/4 页 5 18.05g。 0026 实施例 2 ： DPPH 法测定簕菜提取物抗氧化活性 使用 1， 1- 二苯基 -2- 三硝基苯肼 （DPPH） 测定簕菜提取物的抗氧化活性。DPPH 是一种 比较稳定的脂性。
15、自由基， 其 N 上有一个游离电子， 其乙醇溶液呈紫色， 在 517nm 处有最大的 吸收峰。加入簕菜提取物以后， DPPH 捕捉一个电子与游离电子配对， 紫色褪去， 变为无色物 质， 在 517nm 处的吸收消失， 其褪色程度与其接受的电子数成定量关系。依此原理用分光光 度计检测 DPPH 自由基与簕菜提取物反应后吸光值的变化， 可检定试样提供氢原子、 清除自 由基抗氧化的能力。 方法 ： 称取0.02g的DPPH晶体， 用无水乙醇溶解， 定容至500ml， 配制成 0.04mg/L 溶液， 避光保存。分别称取各种簕菜提取物样品， 配制成 0.5mg/ml 的样品溶液。 使用 1.5ml 的。
16、离心管作为反应容器， 参比管中加 900l 的 DPPH 溶液和 100l 的无水乙 醇， 以 1ml 的无水乙醇做为空白对比。样品管中分别按 5l、 10l、 20l、 40l、 80l 的 梯度体积加入样品溶液和900l的DPPH溶液， 再加无水乙醇使总体积为1ml。 4恒温反 应30min。 用紫外可见分光光度计测得参比管的吸光度为AC， 样品管的吸光度为AS， 通过公 式计算其清除率， 并计算其 IC50值 （IC50值指清除率达到 50% 时对应的样品浓度） 。簕菜提 取物的清除效果如表 1 所示。 0027 表 1 各组分抗氧化活性测试结果 （DPPH 法） 醇提物 水提物 石油醚。
17、部分乙酸乙酯部分正丁醇部分水溶物 IC50（g/mL）28.834.515.817.319.135.4 实施例 3 ： ABTS 法测定簕菜提取物抗氧化活性 ABTS 法测定总抗氧化能力的原理是， ABTS 在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的 ABTS +， 在抗氧化物存在时 ABTS + 的产生会被抑制， 在 734nm 或 405nm 测定 ABTS + 的吸 光度即可测定并计算出样品的总抗氧化能力。方法 ： 称取 0.0192g 的 ABTS 溶解在 5ml 的无 水乙醇中， 配制成浓度为 7mmol/L 的溶液。称取 0.0378g 的过硫酸钾粉末， 溶解在 1ml 的蒸 馏水中， 配制。
18、成浓度为140mmol/L的溶液。 分别取5ml的7mmol/L的ABTS+溶液和88l的 140mmol/L 的过硫酸钾溶液混合， 静置 12h， 配制成 ABTS+ 自由基储备液。将该溶液避光条 件下保存， 使用前， 用无水乙醇稀释成工作液， 使其在 734nm 波长下的吸光度为 0.700.02 （稀释比例大概为 1 100） 。使用 1.5ml 的离心管作为反应容器， 参比管中加 900l 的 ABST溶液和100l的无水乙醇， 以1ml的无水乙醇做对比。 样品管中分别按5l、 10l、 20l、 40l、 80l 的体积梯度加入样品溶液和 900l 的 ABST 溶液， 再加无水乙醇。
19、使总 体积为 1ml。4恒温反应 30min。用紫外可见分光光度计测得参比管的吸光度为 AC， 样品 管的吸光度为 AS， 通过公式计算其清除率， 并计算其 IC50值。簕菜提取物的抗氧化活性测 定结果如表 2 所示。 0028 表 2 各组分抗氧化活性测试结果 （ABTS 法） 醇提物 水提物 石油醚部分乙酸乙酯部分正丁醇部分水溶物 IC50（g/mL）15.716.17.78.69.718.1 实施例 4 ： 簕菜提取物对小鼠巨噬细胞 RAW264.7 细胞的生长影响作用 方法 ： 小鼠巨噬细胞 RAW264.7 细胞以 0.1105个 / ml 的浓度接种于 35mm 培养皿中， 生长 。
20、24 小时后使用不同的簕菜提取物 （40 g/ml） 作用 96 小时， 台盼蓝染色法测定存活和 死亡细胞数。结果如表 3 所示， 簕菜提取物能抑制 RAW264.7 细胞的生长， 其中石油醚层和 说 明 书 CN 102920759 A 5 4/4 页 6 乙酸乙酯层有较强的抑制作用。 0029 表 3 不同簕菜提取物对巨噬细胞 RAW264.7 细胞生长的影响作用 对照组 石油醚部分乙酸乙酯部分正丁醇部分水溶物 活细胞数 * 10021.141.886.777.4 死细胞数 * 0.926.011.14.02.5 * 与对照组比较的百分数 实施例 5 ： 簕菜提取物对小鼠巨噬细胞 RAW2。
21、64.7 中 NF-B 转录活性的影响作用 方法 ： 使用荧光素酶报告基因表达分析法检测簕菜提取物对小鼠巨噬细胞 RAW264.7 中 NF-B 转录活性的影响作用。RAW264.7 细胞以 0.2105个 /ml 的浓度接种在 35mm 培 养皿中， 生长 24 小时后用不同的簕菜提取物 （80 g/ml） 与细胞共孵育 24 小时， 使用荧光素 酶活性测定方法测定 NF-B 的转录活性。结果如图 1 所示， 图中所列为三次实验平均值 SE。结果表明， 簕菜提取物会降低小鼠巨噬细胞 RAW264.7 中 NF-B 的转录活性。 其 中石油醚层， 乙酸乙酯层和正丁醇层比其他成分抑制活性更强 （。
22、C ： 对照组 ； WE ： 水提物 ； EE ： 醇提物 ； PEL ： 石油醚部分 ； EAL ： 乙酸乙酯部分 ： NBL: 正丁醇部分 ； WL ： 水溶物） 。 0030 实施例 6 ： 簕菜提取物对小鼠巨噬细胞 RAW264.7 中 Erk1/2 的激活作用 Erk1/2 的活化在炎症发生中起着重要作用。使用 Western blot 分析方法对 RAW264.7 细胞中 Erk1/2 的影响作用进行了分析。RAW264.7 细胞以 1105个 / ml 的浓度接种， 生长 24 小时后使用不同簕菜提取物 （80 g/ml） 与细胞共孵育。使用抗磷酸化 Erk1/2 抗体进行 Western Blot 测定 Erk1/2。以 - 肌动蛋白作为对照组。结果如图 2 所示， 簕菜提取物能 降低 RAW264.7 细胞中的磷酸化 Erk1/2 的表达水平 （C ： 对照组 ； CUR ： 姜黄素 ； WE ： 水提物 ； EE ： 醇提物 ； PEL ： 石油醚部分 ； EAL ： 乙酸乙酯部分 ： NBL: 正丁醇部分 ； WL ： 水溶物） 。 说 明 书 CN 102920759 A 6 1/1 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102920759 A 7 。