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1、(10)申请公布号 CN 102935226 A (43)申请公布日 2013.02.20 CN 102935226 A *CN102935226A* (21)申请号 201210464105.3 (22)申请日 2012.11.16 A61K 39/116(2006.01) A61K 39/112(2006.01) A61K 47/48(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (71)申请人 罗益 (无锡) 生物制药有限公司 地址 214028 江苏省无锡市国家高新技术产 业开发区长江南路 32 号 (72)发明人 周富昌 陈宣洪 周家富 任晓莉 朱少军 (74)专利代理机。
2、构 广州市越秀区海心联合专 利代理事务所 ( 普通合伙 ) 44295 代理人 黄为 (54) 发明名称 伤寒甲型副伤寒结合疫苗及其制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种伤寒甲型副伤寒结合疫 苗, 包括伤寒 Vi 多糖和甲型副伤寒菌体特异多糖 O-SP。本发明还公开了该疫苗的制备方法, 包括 制备伤寒 Vi 多糖、 制备甲型副伤寒菌体特异多糖 O-SP、 制备伤寒Vi多糖-载体蛋白结合物、 制备甲 型副伤寒菌体特异多糖 O-SP- 载体蛋白结合物及 制备成品的步骤。 通过动物实验证明, 本发明能诱 导出高水平的抗伤寒 Vi 多糖、 抗甲型副伤寒 LPS 抗体, 且具有免疫记忆反应 , 并无。
3、急性毒性反应。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 1/1 页 2 1. 一种伤寒甲型副伤寒结合疫苗, 其特征在于, 包括 : 伤寒 Vi 多糖和甲型副伤寒菌体 特异多糖 O-SP。 2. 根据权利要求 1 所述的伤寒甲型副伤寒结合疫苗, 其特征在于 : 所述伤寒 Vi 多糖和 甲型副伤寒菌体特异多糖 O-SP 均与载体蛋白形成结合物。 3. 根据权利要求 2 所述的伤寒甲型副伤寒结合疫苗, 其特征在于 : 所述载体蛋白为破 伤风类毒素。 4. 根据权利要求 1 所述的伤寒甲。
4、型副伤寒结合疫苗, 其特征在于 : 所述疫苗含伤寒 Vi 多糖和甲型副伤寒菌体特异多糖 O-SP 均不低于每人份 10ug。 5. 一种制备权利要求 1-4 任一所述伤寒甲型副伤寒结合疫苗的方法, 包括以下步骤, 1) 精制伤寒 Vi 多糖 : 伤寒沙门氏菌种经甲醛杀菌后, 高速离心去除菌体, 上清液中加 入十六烷基三甲基溴化铵, 充分混匀形成沉淀, 离心收集沉淀物, 用 CaCl2溶液解离, 再用乙 醇沉淀制得粗制品 ; 将粗制品溶解于 10饱和醋酸钠溶液中, 然后用冷酚提取, 离心收集 上清液, 并用 0.1mol/L 氯化钙溶液透析 ; 再加乙醇至最终浓度为 75 80 (V V) ; 。
5、离心 收集沉淀物, 洗涤后离心, 弃上清, 溶解沉淀的多糖, 得精制伤寒 Vi 多糖 ; 2) 制备甲型副伤寒菌体特异多糖 O-SP: 甲型副伤寒沙门氏菌种经甲醛杀菌后, 高速离 心收集菌体, 热酚法粗制菌体中的副甲脂多糖 ; 再用低温乙醇沉淀法精制副甲脂多糖, 然后 将副甲脂多糖以 10mg/ml 浓度溶解于 1醋酸溶液中, 沸水浴后冷却, 离心弃沉淀, 透析上 清, 再以低温乙醇沉淀法收集沉淀, 经分子筛层析法纯化 ; 3) 制备伤寒 Vi 多糖 - 载体蛋白结合物 : 衍化载体蛋白 ; 将精制伤寒 Vi 多糖溶液加入 碳二亚胺, 然后加入衍化的载体蛋白, 维持 pH 在 5.75 进行结。
6、合反应, 然后调 pH 至中性终止 反应, 反应物在生理盐水中透析过夜, 过层析柱纯化, 得伤寒 Vi 多糖 - 载体蛋白结合物 ; 4) 制备甲型副伤寒菌体特异多糖 O-SP- 载体蛋白结合物 : 用己二酰肼与甲型副伤寒 菌体特异多糖O-SP进行连接反应, 制得O-SP-AH衍生物, 将其与载体蛋白混合, 加入碳二亚 胺进行结合反应, 经超滤膜超滤去除小分子物质, 过层析柱纯化, 得甲型副伤寒菌体特异多 糖 O-SP- 载体蛋白结合物 ; 5) 制备成品 : 将伤寒菌体荚膜多糖 - 载体蛋白结合物原液与甲型副伤寒菌体特异多 糖 O-SP- 载体蛋白结合物原液混合后加入高压灭菌后的注射水及乳糖。
7、, 除菌过滤后冻干。 6. 根据权利要求 5 所述的伤寒甲型副伤寒结合疫苗的制备方法, 其特征在于 : 制备伤 寒 Vi多糖-载体蛋白结合物的步骤中, 载体蛋白衍化度为1.0-3.0%, 伤寒荚膜多糖蛋白终 浓度为 2-3mg/ml。 7. 根据权利要求 5 所述的伤寒甲型副伤寒结合疫苗的制备方法, 其特征在于 : 制备甲 型副伤寒菌体特异多糖O-SP-载体蛋白结合物的步骤中, 甲型副伤寒菌体特异多糖O-SP的 衍化度为 1.0 3.0。 8. 根据权利要求 5 所述的伤寒甲型副伤寒结合疫苗的制备方法, 其特征在于 : 制备甲 型副伤寒菌体特异多糖 O-SP- 载体蛋白结合物的步骤中, 所述结。
8、合反应的 pH 控制在 5.0 5.5, 反应 3 小时。 9. 根据权利要求 5 所述的伤寒甲型副伤寒结合疫苗的制备方法, 其特征在于 : 制备甲 型副伤寒菌体特意多糖 O-SP- 载体蛋白结合物的步骤中, 所述层析柱为琼脂糖 4FF 柱。 权 利 要 求 书 CN 102935226 A 2 1/8 页 3 伤寒甲型副伤寒结合疫苗及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及含有抗原的医药制品领域, 特别是涉及一种伤寒甲型副伤寒结合疫苗 及其制备方法。 背景技术 0002 伤寒是由对人有致病力的沙门氏伤寒杆菌引起的一种全身性、 急性、 发热性传染 病。主要表现为持续性高热, 腹痛、 不适、 。
9、头痛及小肠结肠炎症等症状。通过改善公共卫生 条件可以降低伤寒的发病率, 但是, 有效的控制该病流行的最佳方式仍是预防免疫。 0003 沙门氏菌具有复杂的抗原构造, 一般可分为 3 类抗原 : (1)Vi 抗原或表面抗原, 即 荚膜多糖 ; (2)0 抗原或细胞壁抗原, 是细胞壁的脂多糖, 即内毒素 ; (3)H 抗原或鞭毛抗原, 是一种蛋白质抗原。沙门氏菌的不同菌株都有荚膜多糖, 它具有抗吞噬作用和保护细菌避 免相应的抗体在补体参与下的溶菌作用。同时, 荚膜可以保护细菌在血液中得以生存。特 异性的抗荚膜多糖抗体与细菌结合后通过活化补体而杀死伤寒杆菌。 鉴于荚膜多糖这些与 细菌侵袭力和毒力有关的。
10、特性, Felix 和 Pitt 于 20 世纪 50 年代将沙门氏杆菌的荚膜多糖 命名为 Vi 抗原, 随后的研究发现, 用粗制的 Vi 荚膜多糖抗原免疫小鼠后, 小鼠可获得对伤 寒沙门氏菌感染的抵抗力, 可保护小鼠免受再次感染。 0004 伤寒疫苗有注射用灭活全菌体疫苗、 口服灭活全菌体疫苗、 口服减毒活疫苗、 Vi 多 糖疫苗等。20 世纪 60-70 年代, 灭活全菌体疫苗在许多国家进行了临床研究, 效果不理想, 已停止使用。链霉素依赖性伤寒突变株活疫苗在正常人体内繁殖能力较差, 免疫后效果难 尽人意, 且冻干型的该种疫苗又完全丧失保护力, 也停止了研究。伤寒 Ty21a 减毒活疫苗经。
11、 过了大量临床实验, 已被证实是目前较安全有效的伤寒疫苗之一, 而且没有严重的副反应, 但长期以来一些学者对 Ty21a 突变株提出以下仍然具有争议的问题 : 该减毒株的遗传稳定 性不能确定, 并推测其有毒力返祖的可能 ; gale 基因的突变不能完全解释该疫苗的减毒机 制 ; 有其他不明部位的基因发生了突变 ; 冻干剂型疫苗的稳定性不规律以及口服接种次数 过多等。伤寒 Vi 多糖 (又名伤寒荚膜多糖) 疫苗与其他的多糖疫苗一样, 为 T 淋巴细胞非依 赖性抗原, 不能用于2岁以内儿童的免疫, 再次免疫接种时不会产生免疫记忆反应。 伤寒Vi 多糖疫苗免疫原性低且抗体水平不能保持在高水平, 原因。
12、在于其多糖是半抗原, 为非 T 细 胞依赖性抗原, 接种后不能激活 Th 细胞和 T 记忆细胞, 不产生回忆加强反应。 0005 多糖诱导抗体主要是通过刺激 B 细胞产生 IgM 和少量 IgG 抗体。由于它是非 T 细 胞依赖性抗原 (TI), 存在一定的缺点, 表现在 : 在婴幼儿体内产生的免疫反应很弱 ; 无 免疫记忆及增强效应 ; 普通佐剂对之不易起到作用。所以此疫苗虽然有效、 安全, 但仍需 改进。 美国NIH的国立儿童健康和人类发育研究所 (National Institute of Child Health and Human Development) 研制的伤寒 Vi 多糖和重。
13、组绿脓杆菌外毒素 A 偶联制备的结合疫 苗, 在越南已完成三期临床试验, 显示出良好的安全性和有效性。本发明参考了 NIH 的研究 结果, 结合冻干 A、 C 群脑膜炎球菌结合疫苗的研制和生产经验, 确定了多糖蛋白结合物 的制备和纯化工艺, 多糖检定, 活化蛋白所需 EDAC 的浓度及己二酰肼的浓度, 衍生物的纯 说 明 书 CN 102935226 A 3 2/8 页 4 化、 检定, Vi 多糖和蛋白浓度, 结合物的纯化、 检定, 结合物的抗原性, 免疫原性、 生化等质量 标准, 以及结合物的稳定性, 安全性等进行了多方面的研究, 并通过了各项实验室检定, 成 功制备出伤寒 Vi 多糖与破。
14、伤风类毒素 (TT) 的结合物原液伤寒 Vi TT。 0006 甲型副伤寒 (S. paratyphoid A 副甲 ) 是在东南亚、 南亚、 撒哈拉以南的非洲地 区流行的伤寒肠热症中仅次于伤寒居第二位的病原菌, 在我国广西、 贵州等地区也时有爆 发, 严重危害人民健康。在地方流行区, 学龄儿童的发病率最高。随着伤寒 Vi 多糖疫苗的 广泛运用, 原有的伤寒、 副甲、 副乙三联菌体苗 (TAB) 由于副反应大, 已不再使用, 形成伤寒 发病逐渐减少, 而副甲的疫情凸现的情况。市场迫切需要新的甲型副伤寒疫苗。 0007 美国 NIH 的国立儿童健康和人类发育研究所 (National Insti。
15、tute of Child Health and Human Development) 的 J. B. Robbins 等认为, 应急水平的抗菌体特异多糖 (Anti-O-SP) 血清抗体可赋予人体对副甲的保护性免疫。因此, 1996 年 NIH 的 Robbins 等 用 1- 氰基 -4- 二甲基氨基吡啶 四氟化硼 (CDAP) 活化多糖的方法制备副甲多糖结合疫苗 进行了动物试验, 用高分子量的菌体特异多糖 (O-SP) 和破伤风类毒素 (TT) 按两种方法制 备的结合物 (多糖蛋白直接偶联和通过 ADH 连接臂的偶联) 免疫了小鼠。注射一剂后, 两种 结合物均未诱导小鼠产生抗副甲酯多糖 。
16、(LPS) 的任何抗体 ; 第二和第三剂后, 均诱导小鼠 产生低水平的 IgM 抗体。同时, 第二剂即产生抗 LPS 的 IgG 抗体, 而且第三剂免疫后还有明 显的免疫回忆反应。两种结合物诱导的副甲抗体无明显差别。直接结合制备的结合物诱导 的 TT 抗体水平较高。而且只有含 O- 乙酰基的 O-SP 制备的结合物诱导的抗 LPS IgG 血清 抗体才有杀菌抗体活性。基于动物试验结果, 2000 年 NIH 的 Shousun C SZU 等在越南用法 国巴斯德公司用按上述两种方法制备的副甲结合疫苗 (SPA-TT1, 有 ADH 连接臂 ; SPA-TT2, 直 接结合) 进行了 I 期和 。
17、II 期临床试验。试验选取成人、 青少年和 2-4 岁儿童三组志愿者进 行了安全性和免疫原性的观察。 结果表明这两种副甲结合疫苗人体试验具有良好的免疫原 性和安全性。 0008 中国专利 ZL200610111684.8 公开了一种伤寒、 副伤寒外膜蛋白疫苗, 从伤寒杆 菌、 甲型副伤寒杆菌、 乙型副伤寒杆菌培养液中提取外膜蛋白制得, 经小鼠实验证明可抵御 致死剂量的活菌的攻击。 但该疫苗提取的是外膜蛋白, 而外膜蛋白是一组蛋白, 不同的蛋白 成分比较复杂, 多数形成的是一个结合体, 较难进行纯化, 纯化后也不易进行标准化检测, 容易混入较多的菌体蛋白等杂质。 发明内容 0009 为克服现有技。
18、术伤寒甲型副伤寒二价疫苗副反应大, 以及已公开的伤寒、 副伤寒 外膜蛋白疫苗质量控制方面的缺陷, 本发明提供了一种伤寒ViTT和甲型副伤寒O-SP-TT 结合物混合后制成的结合疫苗, 使用伤寒Vi多糖和甲型副伤寒O-特异多糖 (O-SP) , 两种多 糖均为单一多糖, 能很好的控制蛋白和核酸等杂质, 并有完善的质量标准。 0010 本发明的一方面提供了一种伤寒甲型副伤寒结合疫苗, 包括伤寒菌体荚膜多糖和 甲型副伤寒菌体特异多糖 O-SP。 0011 优选地, 上述伤寒菌体荚膜多糖和甲型副伤寒菌体特异多糖 O-SP 均与载体蛋白 形成结合物。 0012 优选地, 载体蛋白为破伤风类毒素。 说 明。
19、 书 CN 102935226 A 4 3/8 页 5 0013 优选地, 每人份伤寒甲型副伤寒结合疫苗含伤寒菌体荚膜多糖和甲型副伤寒菌体 特异多糖 O-SP 均不低于 10ug。 0014 本发明的另一方面提供了一种上述伤寒甲型副伤寒结合疫苗的制备方法, 包括以 下步骤, 0015 1) 精制伤寒 Vi 多糖 : 伤寒沙门氏菌种经甲醛杀菌后, 高速离心去除菌体, 上清液 中加入十六烷基三甲基溴化铵, 充分混匀形成沉淀, 离心收集沉淀物, 用 CaCl2溶液解离, 再 用乙醇沉淀制得粗制品 ; 将粗制品溶解于 10饱和醋酸钠溶液中, 然后用冷酚提取, 离心 收集上清液, 并用 0.1mol/L。
20、 氯化钙溶液透析 ; 再加乙醇至最终浓度为 75 80 (V V) ; 离心收集沉淀物, 洗涤后离心, 弃上清, 溶解沉淀的多糖, 得精制伤寒 Vi 多糖 ; 0016 2) 制备甲型副伤寒菌体特异多糖 O-SP: 甲型副伤寒沙门氏菌种经甲醛杀菌后, 高 速离心收集菌体, 热酚法粗制菌体中的副甲脂多糖 ; 再用低温乙醇沉淀法精制副甲脂多糖, 然后将副甲脂多糖以 10mg/ml 浓度溶解于 1醋酸溶液中, 沸水浴后冷却, 离心弃沉淀, 透 析上清, 再以低温乙醇沉淀法收集沉淀, 经分子筛层析法纯化 ; 0017 3) 制备伤寒 Vi 多糖 - 载体蛋白结合物 : 衍化载体蛋白 ; 将精制伤寒 V。
21、i 多糖溶液 加入碳二亚胺, 然后加入衍化的载体蛋白, 维持 pH 在 5.75 进行结合反应, 然后调 pH 至中性 终止反应, 反应物在生理盐水中透析过夜, 过层析柱纯化, 得伤寒 Vi 多糖 - 载体蛋白结合 物 ; 0018 4) 制备甲型副伤寒菌体特异多糖 O-SP- 载体蛋白结合物 : 用己二酰肼与甲型副 伤寒菌体特异多糖O-SP进行连接反应, 制得O-SP-AH衍生物, 将其与载体蛋白混合, 加入碳 二亚胺进行结合反应, 经超滤膜超滤去除小分子物质, 过层析柱纯化, 得甲型副伤寒菌体特 异多糖 O-SP- 载体蛋白结合物 ; 0019 5) 制备成品 : 将伤寒菌体荚膜多糖 - 。
22、载体蛋白结合物原液与甲型副伤寒菌体特 异多糖 O-SP- 载体蛋白结合物原液混合后加入高压灭菌后的注射水及乳糖, 除菌过滤后冻 干。 0020 优选地, 上述步骤 3) 中, 载体蛋白为破伤风类毒素。 0021 优选地, 上述步骤 3) 中, 载体蛋白衍化度为 1.0-3.0%, 精制伤寒 Vi 多糖蛋白终浓 度为 2-3mg/ml。 0022 优选地, 上述步骤 4) 中, O-SP 的衍化度为 1.0 40。 0023 优选地, 上述步骤 4) 中, 结合反应 pH 控制在 5.6 5.9, 反应 3 小时。 0024 优选地, 上述步骤 4) 中, 层析柱为琼脂糖 4FF 柱。 0025。
23、 本发明的有益效果是 : 本发明对伤寒及甲型副伤寒同时免疫, 且两种抗原间无干 扰, 均能产生和单独的结合物相同的免疫应答。 具体实施方式 0026 下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述, 以使本发明的优点和特征能更易于被 本领域技术人员理解, 从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。 0027 本发明系采用伤寒Vi多糖和甲型副伤寒O-SP特异多糖与精制破伤风类毒素化学 偶联后加入乳糖作为赋形剂冻干制成的结合疫苗, 供预防伤寒和甲型副伤寒。 0028 实施例 1 说 明 书 CN 102935226 A 5 4/8 页 6 0029 伤寒 Vi 多糖的制备方法 : 0030 1.菌种制备。
24、 : 将伤寒沙门氏菌种 (50098) 启种于葡萄糖肉汤培养基中, 3537, 培养 16 20 小时, 同样条件转种第二代、 第三代于普通琼脂斜面培养基上, 35 37培养 16 20 小时, 再将第三代菌种分别采种于装有一定量改良半综合液体培养基的菌种罐中, 35 37培养 4 8 小时。 0031 2. 大罐培养 : 将菌种罐中的菌种压入装有一定量改良半综合液体培养基的发酵 罐中, 进行扩大培养, 35 37深层通气培养 6 8 小时。 0032 3. 杀菌 : 培养物按 1 2 (V V) 甲醛溶液加入罐内杀菌, 搅拌半小时以上静置 过夜。 0033 4. 除菌体 : 用高速连续流离心。
25、机离心去菌体, 收集上清液。 0034 5. 粗制 : 在上清液中加入 10% 十六烷基三甲基溴化铵至终浓度为 0.1%, 充分混匀 形成沉淀, 离心收集沉淀物即为伤寒 Vi 复合多糖。用 2M CaCl2溶液解离复合多糖至 CaCl2 浓度为 1M, 解离时间为 2 小时。在解离液中加入 95% 酒精至终浓度为 25%-27%, 搅拌 10 分 钟, 静止 1-3 小时或过夜, 高速离心去核酸, 收上清。上清液中加入 95% 乙醇至酒精终浓度 为75-80%, 离心弃上清, 沉淀即为粗制品。 收集粗糖, 用无水乙醇和丙酮洗涤, 吹干、 称重、 备 用 ; 0035 6.精制 : 将粗制多糖溶。
26、解于10饱和醋酸钠溶液中, 多糖浓度在5-10mg/ml。 然后 按 1:2 体积比加入 70% 冷酚提取, 振摇 5-10 分钟使多糖苯酚充分扒壁后离心收集上清液。 如上清不清亮可重复加入苯酚抽提 2-3 次至上清清亮为止。用 0.1mol/L 氯化钙溶液透析 多糖液后加入 95% 乙醇至最终浓度为 75 80 (V V), 离心收集沉淀物, 洗涤后离心, 弃 上清, 溶解精制多糖除菌过滤后备用。 0036 实施例 2 0037 甲型副伤寒菌体 O-SP 多糖的制备方法 : 0038 1. 菌种制备 : 将甲型副伤寒沙门氏菌种 (50073)启种于葡萄糖肉汤培养基中, 3537培养1620小。
27、时, 同样条件转种第二代、 第三代于普通琼脂斜面培养基上, 35 37培养 16 20 小时, 再将第三代菌种分别采种于装有一定量改良半综合液体培养基的 菌种罐中, 35 37培养 4 8 小时。 0039 2. 大罐培养 : 将菌种罐中的菌种压入装有一定量改良半综合液体培养基的发酵 罐中, 进行扩大培养, 35 37深层通气培养 6 8 小时。 0040 3. 杀 菌 : 培养物按 1 2 (V V) 甲醛溶液加入罐内杀菌, 搅拌半小时以上。 0041 4. 收集菌体 : 用高速连续流离心机离心收集菌体, 弃上清液。 0042 5. 热酚法粗制 LPS : 菌体按 1 : 10 加入注射用水。
28、, 再加入 90热酚溶液, 68水浴 加热 1 小时, 流水降温, 冷库过夜后 10 10000 rpm 离心 1 小时, 收集上清液。纯化水透析 去酚, 加入酒精至终浓度 75沉淀 LPS, 收集沉淀物, 即为 LPS 粗制品。 0043 6. 低温乙醇沉淀法精制 LPS : 将粗制品按湿重 150 200mg/ml 溶解于注射用水 中, 再加乙醇至最终浓度为 30 (V V)。-20放置 48 72 小时, 10000rpm 离心收集上 清, 再补加乙醇至 45, -20放置 48 72 小时, 10000rpm 离心收集上清, 上清加入乙醇至 75, 冷库放置 4 8 小时, 4000r。
29、pm 离心收集沉淀即为精制 LPS。 0044 7.O-SP 酸水解 : LPS 以 10mg/ml 溶解于 1醋酸溶液中, 沸水浴 1 2 小时处理。 说 明 书 CN 102935226 A 6 5/8 页 7 水解液冷却后以 20000rpm, 离心 2 小时。弃沉淀, 收集上清再次 20000rpm, 离心 2 小时。弃 沉淀, 收上清。注射用水透析。加入乙醇使终浓度为 80%, 放置冰库 2-4 小时。 4000rpm 离 心 20 分钟, 收集沉淀吹干。 0045 其中, 醋酸溶液水解 1 小时, O-SP 产量稳定, 且适合于规模化生产。 0046 8.分子筛层析法纯化O-SP 。
30、: 沉淀按10mg/ml溶于注射水中, 滤去不溶物, Superdex 75 层析, 注射用水洗柱, 收集外水体积第一峰洗脱物冷冻干燥即为精制 O-SP。 0047 实施例 3 0048 伤寒 Vi 多糖 - 载体蛋白结合物的制备方法 : 0049 以破伤风类毒素 (TT) 作为伤寒 Vi 多糖的载体蛋白。 0050 1.TT 衍化 : 将 TT 按蛋白量稀释为 10mg/ml, 在室温 20 26每毫克蛋白加入 3.5 毫克 1,6- 己二酰肼 (ADH) , 混匀, 调 pH 值到 5.75, 加入碳二亚胺 (EDAC) 使 EDAC 与蛋白的比 值为 0.1-0.8, 维持 pH5.75。
31、 搅拌 1 小时, 用 30k 超滤膜超滤去 ADH 和 EDAC 等小分子杂质。 测定蛋白含量和 ADH 残基 ( AH) 含量, 计算其衍化率。 0051 衍化蛋白时 EDAC/TT 定在 0.1 0.15 之间, 能有较合适的衍化度。 0052 2. 伤寒 Vi 多糖与衍化载体蛋白结合 : 将伤寒 Vi 多糖用 0.1mol/l HCl 调 pH 值到 5.75, 按加入蛋白后的体积加入 5 10mmol/l 的 EDAC, 调 pH 至 5.75, 反应 2 分钟, 加入等 体积的衍化蛋白 TT-AH, 维持 pH 在 5.75, 反应 3 小时或 pH 不再变化时, 调 pH 至中性。
32、终止反 应。反应物在生理盐水中透析过夜, 过 Sepharose 4FF 柱纯化, 收集第一峰, 去掉游离蛋白 和其它小分子物质。 0053 多糖和蛋白偶联时, 高浓度和高衍化度结合物容易成胶, 而在低浓度和低衍化度 时不易结合, 只有在合适的浓度时才有较好的偶联和合适的多糖蛋白比。蛋白衍化度在 1.0-3.0%、 多糖蛋白终浓度在 2-3mg/ml 时能避免成胶, 又有较好的多糖蛋白比。 0054 实施例 4 0055 O-SP- 载体蛋白结合物的制备方法 : 0056 以 TT 作为甲型副伤寒 O-SP 多糖的载体蛋白。 0057 1.O-SP-AH 衍生物的制备 : 按 5mg/ml 将。
33、甲型副伤寒精制 O-SP 溶解在注射用水中。 每毫克 O-SP 多糖加入 0.5mg 溴化氰, pH 控制在 10.80.2, 反应温度 233, 活化 40 分 钟, 然后按每毫克多糖加入 3.5mg 己二酰肼 (ADH) 连接, 用生理盐水超滤 (10kd 膜) , 能得到 适宜数量的活化位点。 0058 其中, 控制衍化度在 1.0 3.0利于下一步结合反应。 0059 2.O-SP-TT 结合物的制备 : O-SP AH 衍生物与 TT 蛋白定量混合, 用 HCl 调 pH 至 5.0 5.5, 然后加入碳二亚胺 (EDAC) , 2 8反应 1 3 小时, 调 pH 至 6.7 7.。
34、1 中止反 应。反应物经 100Kd 超滤膜超滤去除小分子物质。 0060 其中, 反应 pH 控制在 5.0 5.5, 反应 3 小时可较好结合。 0061 3.O-SP-TT 结合物的纯化 : 用琼脂糖 4FF 层析, 收集甲型副伤寒 O-SP-TT 结合物的 第一峰。 0062 但琼脂糖 CL-4B 柱流速过慢, 上样体积太小, 不适宜于规模生产。一种替代方式 是, 选用和琼脂糖 CL-4B 分离范围一致, 耐压, 高流速的琼脂糖 4FF 柱用于结合物的分离纯 化。在波长 206nm 下监测吸收峰, 收集第一峰。经琼脂糖 4FF 柱 (2.690cm) 层析, 只有一 说 明 书 CN 。
35、102935226 A 7 6/8 页 8 个多糖蛋白结合峰, 后面有一个单独的蛋白峰, 结合物和游离的蛋白能较好的分离。 0063 实施例 5 0064 伤寒甲型副伤寒结合疫苗成品的制备 0065 将伤寒 Vi-TT 结合物原液、 甲型副伤寒 O-SP-TT 结合物原液混合后加入无菌无热 原注射用水稀释 , 加入适量乳糖作为赋形剂, 除菌过滤后冻干。每人份含伤寒 Vi 多糖、 甲 型副伤寒 O-SP 多糖均不低于 10ug。 0066 实施例 6。 0067 1. 毒性逆转实验 0068 结合物原液用pH7.07.4的PBS稀释至710Lf/ml, 37放置42天, 注射250 350g 体。
36、重的健康豚鼠 4 只, 每只皮下注射 5ml, 于注射后第 7 天、 14 天、 21 天进行观察, 动物 不得有破伤风症状, 到期每只动物体重比注射前增加者判为合格。伤寒 Vi-TT 结合物毒性 逆转试验结果见表 1, 甲型副伤寒 O-SP-TT 结合物毒性逆转试验结果见表 2。 0069 表 1 伤寒 Vi-TT 结合物毒性逆转试验结果 0070 0071 表 2 甲型副伤寒 O-SP-TT 结合物毒性逆转试验结果 说 明 书 CN 102935226 A 8 7/8 页 9 0072 0073 结果 : 三批伤寒 Vi-TT 结合物和甲型副伤寒 O-SP-TT 结合物原液注射后 7 天、。
37、 14 天、 21 天观察, 动物均无破伤风症状, 注射后 21 天体重均有增加。符合 中国药典 三部 (2005 年版) 吸附破伤风疫苗 的要求。 0074 2. 效力实验 0075 将成品疫苗稀释为 10ug/ml(含伤寒 Vi 多糖和甲型副伤寒 O-SP 多糖分别为 5ug/ ml) , 接种18-20g小鼠, 每组10只, 间隔一周免疫一针,共免疫三次,每次注射0.5ml, 第三 针后一周采血 , 分离血清 ; 用 ELISA 法测定血清抗伤寒 Vi 和抗甲型副伤寒 O-SP 多糖 IgG 抗体滴度, 三针免后 , 多糖结合疫苗组抗体阳转率应不低于 80%, 抗体几何平均滴度 (GMT。
38、) 应高于等剂量多糖对照组 4 倍以上。结果见表 3。 0076 表 3 : 伤寒甲型副伤寒结合疫苗免疫原性测定结果 0077 说 明 书 CN 102935226 A 9 8/8 页 10 0078 从上表的结果可以看出, 试制的三批成品鼠免疫原性试验结果都显示小鼠在注 射两针后阳转率即达到了 100%, 注射三针后结合物成品 GMT 与单糖 GMT 有显著差异 (P 0.001) 。 因此伤寒Vi多糖、 甲型副伤寒O-SP多糖分别和破伤风类毒素结合后, 能诱导小 鼠产生较高的抗体应答, 且加强免疫后有记忆抗体产生。 0079 3. 异常毒性实验 0080 3.1 豚鼠毒性试验 0081 用。
39、两只体重 250 350g 的健康豚鼠 , 每只腹腔注射 10 人份 (5ml) 疫苗 , 观察 7 天 , 应全部健存 , 无异常反应 , 豚鼠体重增加。结果见表 4. 0082 3.2 小白鼠毒性试验 0083 用 5 只体重 18 22g 的健康小白鼠 , 每只腹腔注射 1 人份 (0.5ml) 疫苗 , 观察 7 天 , 应全部健存 , 无异常反应 , 小白鼠体重增加。结果见表 4。 0084 表 4 : 异常毒性试验结果 0085 0086 结果可见三批样品全部符合规程要求。 0087 通过以上的研究可以看出,本发明的结合疫苗,在动物中能诱导出高水平的抗伤 寒Vi, 抗甲型副伤寒O-SP抗体, 且具有免疫记忆反应,并无急性毒性反应,说明制备方法 是可行的、 制备工艺是稳定的。 0088 以上所述仅为本发明的实施例, 并非因此限制本发明的专利范围, 凡是利用本发 明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换, 或直接或间接运用在其他相关的技术领 域, 均同理包括在本发明的专利保护范围内。 说 明 书 CN 102935226 A 10 。