使用荧光染料检测双链核酸的同相方法 和其中使用的药盒本发明涉及检测靶双链核酸的同相检测法。该方法可用于各
种诊断、调查和研究程序中，特别是用于感染因子的检测。本发
明还涉及可用于该检测法的试验药盒。
近年来，已逐步将检测核酸作为一种早期检测基因组特征，
感染因子及以小量存在于人或动物试验标本中的各种生物的手段。
检测方法一般是基于两条DNA链借助互补核苷酸之间的氢键和其他
力而结合在一起的互补原理(称为核苷酸对)。
正常情况下，DNA分子是相当稳定的，但在某些条件下，如加
热，可使两条链分离或变性。变性的核苷酸链将只能与具有互补
核苷酸序列的另一条链重新结合。
为找到只检测少数DNA分子的方法，已进行了许多研究工作。
各种方法是已知的并使用了近十年，它们只是扩增或大大增加待
检样品中的核苷酸数目。这些扩增技术包括聚合酶链反应(PCR)、
连接酶链反应(LCR)和研究较少的其他一些方法。
PCR是最为人们所熟知的，包括在适当条件下，于DNA聚合剂
及三磷酸脱氧核糖核苷酸存在的条件下，使引物与靶核酸链杂交。
经过几个循环后的结果是：形成引物延伸产物并使原有的靶链数
目以指数扩增。有关PCR的进一步细节可参见US-A-4,683,195
(Mullis等人)，和US-A-4-,683,202(Mullis)和US-A-4,965,
188(Mullis等人)。
尽管象PCR这样的扩增方法为检测小量靶核酸提供了机会，但
同时也产生一个问题，即寡核苷酸从一个容器到另一容器时，会
产生人为的污染。由于污染物会随新样品的靶核酸同时被扩增而
得到假阳性结果。这样可能产生严重的后果，特别是在检查感染
因子时。认为工业上的物理封闭和化学“消毒”技术可降低这种
污染。物理封闭手段有其优点，但在反应容器的加工和设计上还
是相当复杂的。化学消毒技术在本领中论述过，但尚未得到成功
地证明。
有必要寻找一种方法以简化扩增方法，同时又不必担心物质
从一个容器到另一个容器的过程中受到污染。还需要一种实质上
可定量的扩增方法。所述方法可用于治疗疾病而不仅仅是对其的
检测。
EP-A-0487218(Tosoh 1992年5月27日公开的)中描述了被认为
实质上是定量的同相扩增方法，其中在扩增期间或扩增之后使用
特定的荧光染料与双链DNA结合。结合后，荧光信号的改变水平显
然是与标本中靶核苷酸的量相关联的。认为可用于Tosoh公开文本
中的几类荧光素染料是溴化乙锭。吖啶橙、二苯并咪唑(如
Hoechst 33258)，二氨基苯基吲哚，放线菌素，噻唑橙和色霉素。
“同相”是指该方法不需要将被检测的靶核酸同非靶材料分开。
相同类型的染料也可用于检测DNA聚合酶，如US-A-5,049,
490(Sutherland等人)中描述的。
尽管上述染料(如溴化乙锭和Hoescht染料)很容易与DNA结
合，但由于显著的敏感性，从而使使其显现的本底通常太高。
因此，需要找到既与DNA易结合，又有较高敏感性和较低本底的染
料。
已经由Mansfield等人(BioTechniques 15(2)，p274-279
(1993))描述了用于着染扩增的核酸的敏感染料—某些双—嵌入染
料。虽然上述染料可用于着染核酸并克服了上述的本底问题,但
它们与核酸的结合太紧以致抑制了扩增过程。因此，它们只能在
扩增终止时而不是在该过程中使用。
需要一种更敏感的同相检测法，它可用于封闭系统中扩增的
靶核酸的定量检测，由此避免污染问题。所述检测法应对于低水
平核酸是高度敏感的，并易于操作和使用。此外，还需用掺入的
检测工具来监测扩增进程，以便使之在扩增期间存在。
已用检测双链靶核酸的同相检测法克服了上述问题，该方法
包括下述步骤：
A)扩增双链靶核酸
B)使所得到的扩增的双链靶核酸与荧光染料接触，该染料与
双链靶核酸结合时，与染料同双链核酸靶核酸的单链结合所产生
的信号相比，或与游离形式的染料的信号相比，呈现出可检测信
号，以及
C)检测或监测作为确定双链靶核酸之存在或其数量标准的可
检测信号，
因而荧光染料是一种非对称的花青染料，与双股核酸的结合
常数(Kb)为从约1×104至5×105，并由结构式(I)代表：
![]()
其中X是-S-、-O-、-Se-、＝CH-或-NR1-，
Y是-CH＝CH-，
R是有1至6个碳原子的烷基，
R1是氢或有1至6个碳原子的烷基，
R2和R6分别是有1至10个碳原子的亚烷基，
R3、R4和R5分别是有1至6个碳原子的烷基，
Z1包括形成一个5或6元杂环所需的碳原子和杂原子，该杂环
可有多达3个融合于其上的芳族碳环或杂环，
Z2包括形成5或6元芳环所需的碳和杂原子，所述芳环可有多
达2个融合于其上的芳族碳环或杂环，
Q是酸阴离子，
n是0、1或2，
m、p和q分别是0或1，条件是p和q不相同，
r是1或2，且
t是0、1或2，
从而可在扩增的双链靶核酸不与俘获探针结合情况下进行检
测或监测。
本发明还提供一种监测双链靶核酸扩增的方法，包括以下步
骤：
A)在荧光染料存在的情况下扩增双链靶核酸，当荧光染料结
合于双链靶核酸上时，与染料同双链靶核酸的单链结合时所产生
的信号，或与其游离形式的信号相比，表现出可检测的信号，并
且
B)在扩增过程中，按双链靶核酸的存在情况和其数量检测或
监测可检测信号。
因而该荧光染料在前述方法中是如上所述的染料，
并从而不必使扩增的双链靶核酸与俘获探针结合就可进行检
测或监测。
更进一步，本发明提供一种进行同相扩增并检测双链靶核酸
的试验药盒，该药盒以相同或不同的包装包括：
1)荧光染料，与双链靶核酸结合时，同染料与双链靶核酸的
单链结合时所产生的信号，或其游离形式的信号相比，表现出可
检测的信号，
从而按上述本发明方法使用该荧光染料，并且
2)至少一种扩增试剂。
本发明提供了一种较简单、高度敏感的同相检测法，它用于
在扩增期间或其后检测靶核酸。因此，该方法可用于在扩增过程
中的任何给定点上定量监测扩增和核酸的量。也可以用于在扩增
终止时检测核酸的量。因为该方法是同相的，故其可在任何适当
的容器中进行，而不需要如异相方法中常见的分离和俘获步骤。
因为在扩增后不需要从反应容器中除去试剂，故可避免从一个容
器到另一个容器所造成的污染。更重要的是，因为本底信号较低，
所以该检测法比先前报导的使用常用荧光染料的检测法更为敏感。
这些优点是因使用特定类型的荧光染料而达到的，这些荧光
染料对被扩增的和在特定范围内检测的双链核酸有高度的亲和性。
这种结合亲和性比许多常用荧光染料更大，但又不致于大到抑制
靶核酸扩增的程度。染料至少是二价的，即每个分子至少有两个
阳电荷。对这些染料的更详细的限定详见下文。
附图是荧光强度对PCR循环的曲线图，对该图内容的解释详见
下文实施例1。
使用聚合链反应扩增和检测核酸的一般原理和条件是众所周
知的，其详细介绍可参见US-A-4,683,195、US-A-4,683,202
和US-A-4,965,188等大量参考文献，所有这些文献均列为本文
参考文献。因此，鉴于本领域中的技术教导和本文提供的特定教
导，本领域技术人员通过调整本文教导的方案扩增一个或多个核
酸以实践本发明应是没有困难的。
可用于实践本发明的其他扩增方法包括例如EP-A-0320308
(1987年12月公开的)和EP-A-0439182(1990年1月公开的)中描述的
连接酶链反应、例如Birkenmeyer等人(J.Virol.Meth.35，pp.
117-126(1991))所述的自身支持的序列复制(self-sustained
sequence replication)、“Gap-LCR”和其变化方法以及对于本
领域技术人员所显见的其他方法。虽然本公开的其余部分是针对
使用PCR实现本发明，但对于分子生物学领域的技术人员来说，如
何使本文的教导适用于其他扩增技术应是显而易见的。
本发明涉及扩增或检测存在于试验样本内的一个或多个靶核
酸中的一个或多个特定核酸序列。试验样品可包括含有可检测基
因组DNA或RNA的细胞或病毒材料、头发、体液或其他材料。虽然
检测的基本目的实质上是用于诊断的，但本发明也可用于改善克
隆DNA或信使RNA的效率，或从化学合成得到的核酸混合物中得到
大量的所需序列。
可从各种来源，包括质粒和任何来源(如细菌、酵母、病毒、
植物、高等动物或人)的天然DNA或RNR，得到待扩增的核酸。可使
用已知方法从包括血液、外周血单核细胞(PBMC)在内的各种组织、
其他组织材料或本领域已知的其他来源提取之。本发明特别适用
于扩增和检测见于基因组DNA、细菌DNA、真菌DNA、病毒DNA中的
核酸序列，或见于细菌或病毒感染之细胞中之DNA或RNA的核酸序
列。另外，可使用本发明的方法扩增和检测与肿瘤相关的核酸。
可被检测的细菌包括但不只限于见于人血液中的细菌。沙门
氏菌种、衣原体种、淋球菌种、志贺氏菌种和分枝杆菌种。可检
测的病毒包括但不只限于单纯疱疹病毒、E-B病毒、人细胞肥大病
毒、人乳头状瘤病毒、肝炎病毒和反转录病毒和HTLV-1、HTLV-II、
H1V-I和H1V-II。原生寄生虫、酵母和霉菌也可以检测。其他可
检测的品种对于本领域技术人员来说是显而易见的。
“PCR试剂”是指对于PCR不可缺少的任何试剂，即一组用于
各靶核酸之相对链的引物、DNA聚合酶、DNA聚合酶辅助因子、以
及两种或多种脱氧核糖核苷-5＇-三磷酸。
术语“引物”是指天然存在的或合成产生的寡核苷酸，当放
在合成与一条核酸链(即模板)互补的引物延伸产物的条件下时，
其能够起到合成起始点的作用。所说的条件包括存在其他PCR试剂，
以及适当的温度和pH。
为达到最大扩增效率，引物较好是单链的，但必要时也可以
是双链的。它必是足够长的以便在DNA聚合酶存在下引导合成延伸
产物。各引物的确切大小将取决于所期望的用途、靶序列的复杂
性、反应温度和引物的来源。一般说来，用于本发明的引物应有
10至60个核苷酸，且较好有18至45个核苷酸。
选择用于本发明的引物是“实质上互补”于待扩增之特定序
列的不同链。这就意味着它们必须是充分互补的，以便与它们的
各自链杂交形成所需的杂交产物，并且是进而可在DNA聚合酶作用
下延伸的。在优选的和最实际的情况下，引物与靶核酸具有准确
的互补性。
本发明适用的引物可得自许多来源，或者可使用已知技术或
设备与其已知的使用方法(使用的方法如上文提到的US-A-
4,965,188中所述的)制得，所用设备使用包括ABI DNA合成仪(可
购自Applied Biosystems)或Biosearch 8600系列或8800系列合成
仪(可购自Milligen-Biosearch公司)。也可使用从生物学来源分
离的天然存在的引物(如限制性核酸内切酶消化产物)。本文所用
的术语“引物”还指引物的混合物。
DNA聚合酶是一种将脱氧核苷酸单磷酸分子加至引物和模板的
复合物中引物3＇羟基末端上的酶，但这种加入是以模板依赖性方
式进行的(即是说，依赖于模板中的特异核苷酸)。适用的DNA聚合
酶例如包括E.coli DNA聚合酶I、T4 DNA聚合酶、Klenow聚合酶、
反转录酶及本领域已知的其他聚合酶。
DNA聚合酶较好是“热稳定的”，即它一般是对热稳定的，且
较好是在较高温度下，特别是在DNA链变性所用的高温度下仍是有
活性的。更具体地说，热稳定性DNA聚合酶在PCR中所使用的高温
下是基本上不灭活的。所述温度将依据反应条件，包括pH，盐浓
度及其他本领域已知的条件而变化。
本领域已报导了许多热稳定性DNA聚合酶，包括US-A-
4,965,188(上文注明的)和US-A-4,889,818(Gelfand等人，
1989年12月26日公开)中详细提到的DNA聚合酶。特别适用的聚合
酶是得自各种栖热菌属的聚合酶。优选的热稳定性酶是从水生栖
热菌(Thermus aquaticus)、线形栖热菌(T.filiformis)、黄色
栖热菌(T.flavus)或嗜热栖热菌(T.thermophilus)中得到的DNA
聚合酶。其他有用的热稳定性聚合酶可得自各种其他微生物来源，
包括Termococcus literalis、Pyrococcus furiosus、
Thermotoga sp.及WO-A-89/06691(1989年7月27日公开)中描述的
微生物。某些有用的酶是可从商业途径购得的。从生物体内分离
天然存在的聚合酶的许多技术是已知的，使用重组技术制备聚合
酶的克隆技术和其他合成技术也可从上文列出的已有技术中了解
到。
DNA聚合酶辅因子是指酶发挥活性所依赖的非蛋白质化合物。
许多这样的物质是本领域已知的，包括在含水反应混合物中释放
二价锰或镁离子的锰和镁化合物。有用的辅因子包括但不只限于
锰和镁盐，如氯化物、硫酸盐、乙酸盐和脂肪酸盐。优选的是较
小的盐，如氯化物、硫酸盐和乙酸盐。特别优选的是氯化镁和硫
酸镁。
PCR还需要两种或多种脱氧核糖核苷-5＇-三磷酸，如两种或多
种dATP、dCTP、dGTP、dTTP和dUTP。也可使用类似物如dITP和7
-脱氮-dGTP。可取的是，PCR中一起使用四种常用的三磷酸酯
(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)。
提供本文所述的PCR试剂并以适当浓度用于PCR以适于扩增靶
核酸。
DNA聚合酶的最小用量一般为至少每100μl溶液约0.5单位，
较好每100μl约2至约25单位，更好每100μl约7至约20单位。对
于给定的扩增系统可使用其他适当用量。本文中每“单位”定义
为于74℃下；在30分钟内将10nmol总核苷酸(dNTP)掺入延伸核酸
链中所需的酶活性量。
各引物的浓度至少为约0.01μmol，较好约0.2至约1μmol。
在某些扩增系统中也可使用其他适当量。引物可以以相同或不同
的量存在。
在反应混合物中，DNA聚合酶辅因子一般以大约0.5至约
20毫摩尔浓度的量存在，且各dNTP一般以大约0.1至约2毫摩尔浓
度的量存在。某些扩增系统中也可使用其他量的辅因子和dNTP。
可以使用许多本领域已知的适当缓冲液，在pH约7至9的缓冲
溶液中，分别地、或以各种结合方式、或以全部一同加入方式提
供PCR试剂。用于扩增的反应混合物一般是相似缓冲的。但在某些
扩增系统中可以使用其他pH值。
可从上文提到的各种来源中的任何一种来源得到靶核酸。一
般说来，必须以某些方式提取之，以使之适于与引物和其他反应
材料接触。一般这通常意味着以适当方式从样品中除去不需要的
蛋白质和细胞物质。各种方法是本领域已知的，其中包括Laure等
人在Ihe Lancet，pp.538-540(sept.3，1988))、Maniatis等人
在Molecular Cloning；A Laboratory Manual，pp.280-281
(1982)、Gross-Belland等人在Eur.J.Biochem.，36,32(1973)
和US-A-4,965,188(见上文)中所描述的方法。
从全血或其成分中提取DNA的方法例如已有EP-A-0393744(
1990年10月24日公布)中，Bell等人的文章(Proc.Natl.Acad.
Sci.USA，78(9)，pp.5759-5763(1981)和Saiki等人的文章(
Bio/Technology，3，pp.1008-1012(1985))，以及US-A-5,
213,015(Cummins et al.)作了描述。
因为待扩增和检测的靶核酸一般是双链形式的，所以在可发
生引发之前必须将两条链分离开(即使之变性)。这可在提取过程
中完成，或者可在其后加入一个分离的步骤。优选的变性方法
是将核酸加热到适当温度(本文指定为“第一温度”)。一般说来，
该第一温度是在大约85至100℃范围内，加热几分钟，但通常是约
1至约40秒钟。
然后将反应混合物冷却到一般在大约55至75℃范围内的第二
温度，用一组适当的引物引发变性的核酸链。冷却可进行长达几
分钟的任何适当时间，但一般是在60钞钟之内，更好是大约5至约
25秒钟。
一旦变性的核酸链被冷却，即在第三温度下将含有PCR试剂的
反应混合物保温几分钟。更常用的保温时间为1至约80秒钟，较好
是1至大约40秒钟，借以形成引物延伸产物。一般说来，第三温度
在大约55至约75C范围内，更好是在大约62至约68C范围内。
在一最优选的实施方案中，第二和第三温度是相同的，并在
大约62至约68℃的范围内。因此，引发和引物延伸可在同一温度
进行长达几分钟的适当时间，较好是大约5至约120秒钟，最好是
大约10至约90秒钟。
形成引物延伸产物之后，将反应混合物加热长达几分钟的适
当时间以使引物延伸产物变性。一般说来，要将反应产混合物加
热约5至约20秒，并在此温度保持约1至约80秒以使产物变性。如
此完成一个扩增循环。
PCR一般进行至少20次循环，较好是20至50次循环。每次循环
一般约20至约360秒，较好约30至约120秒，最好约30至约90秒。
某些扩增系统可用更长的循环时间。
虽然某些扩增系统和方法可以不连续方式完成，即有不同的
循环时间或间插加入试剂或取出样品，但本发明的方法优选地以
连续的、自动的方式进行，从而使反应混合物在所需次数内处于
以控制的方式进行循环的温度。为此目的，已研制了许多作为本
领域普通技术人应知道的装置。
US-A-4,965,188和EP-A-0236069中较详细地描述了一种用
于这一目的的装置。这种装置一般包括许多装有含反应混合物之
反应试管的热传导容器、加热、冷却和温度维持装置、和用以产
生信号的计算装置以控制扩增序列、改变温度和定时。
EP-A-0402994详述了可使用US-A-5,089,233(见上文)中描
述的装置加工处理的化学试验盒。其中还描述了适于本发明方法
的重复性间隔期(即整个循环)加热和冷却试验盒的装置。可从本
领域中相当多的文献中了解到有关适用的PCR处理装置更详细的内
容，这些是本领域技术人员可以很容易地查明的。
除上述化学试验盒外，该方法可在其他容器，例如US-A-
4,902,624(Columbus et al.)、US-A-4,683,195(见上文)中
详述的容器，以及其他一些本领域技术人员很容易了解的适当容
器中进行。本发明的主要优点是，在封闭的容器中进行扩增和检
测，从而排除了污染问题。因此，已设计的用于该目的的封闭容
器适合于实践本发明的同相方法。因为检测是通过测定荧光染料
的发射光而进行的，所以容器必须适应于进行这种检测。因此，
可用玻璃和本领域技术人员显然很容易识别的透光聚合物制成。
如上文提到的，可在扩增期间或其后的任何时间使用本文所
述的荧光染料，以检测靶核酸。最好在实施本方法的开始阶段即
加入染料，从而能够监测整个扩增过程的进展。特定的荧光染料，
当结合到双链靶核酸上时，与当染料结合于单链靶核酸上所产生
的信号相比较，显示出可检测信号。另外，结合于双链靶核酸上
的染料发出的信号可与处于游离形式的染料(即未与单链或双链核
酸结合的)所提供的信号相比较。本丈所用的术语“可检测信号”
是指任何可检测的信号的改变，如发光强度的增强或降低、最大
发光波长移动(在两个方向)至少5nm但激发波长没有移动、最大激
发波长移动(在每个方向)但发光波长没有移动、最大激发和发光
波长均有移动、或任何这样效应的组合。可检测信号最好是根据
发光强度的增强来证实的。
对于给定荧光染料的给定发光和激发波长，可使用任何一种
适当的荧光分光光度仪监测或检测可检测信号。可在扩增过程中
的任何时间，即任何一次扩增循环后监测可检测信号，或者亦可
在最后一次扩增循环后进行监测。在第一种情况下，至少在某些
循环中，在荧光染料的存在下真正地完成扩增。
本文所说的荧光染料一般限定在具有约1×104至5×105(摩尔浓度-1)
范围内之结合常数(Kb)的非对称花青染料。为限定Kb所说的“大
约”是指10％的变化。染料也是水溶性的或水可分散的，所以它们
可与含水反应混合物中的核酸结合。根据所用的阴离子，染料可
在水混溶性溶剂中溶解。
此外，用于本发明中的染料可进一步由参数“KC”限定，该
参数是使用下列公式计算的：
KC＝Kp×染料浓度(C)×2。
Kp是分配系数。本发明使用的荧光染料具有大约为20或更小的“
KC”值，其中“大约”是指10％的变化。下文实施例3中提供了几
种有用染料，以及几种本发明范围外的染料的KC值。
更具体地说，有用的染料是由下列结构式(I)限定的：
![]()
其中X是-S-、-O-、-Se-、＝CH-或-NR1-。X更好是-S-或-O-。
另外，结构式(I)中，Y是-CH＝CH-。
R是有1至6个碳原子的被取代的或未被取代的烷基(如甲基、
乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基和己基)。R较好是有1
至3个碳原子的被取代或未被取代的烷基，且R更好是甲基或乙基。
最优选的R是甲基。
R1可以是氢或如上文限定的R一样，为有1至6个碳原子的被取
代或未被取代的烷基。优选的是，R1为氢或如上文限定的有1至3
个碳原子的被取代或未被取代的烷基，且最好R1是氢。
R2和R6各自是有1至10个碳原子的被取代或未被取代的亚烷基
(如亚甲基、1，2-亚乙基、三亚甲基、异丙烯、正己烯、正戊烯、
正辛烯和正癸烯)。优选的是，R2和R6分别是有1至4个碳原子的被
取代或未被取代的亚烷基，且最好是三亚甲基。
R3、R4和R5分别是有1至6个碳原子的被取代或未被取代的烷
基(如上文R和R1的定义)。这些基团较好分别是有1至3个碳原子的
被取代或未被取代的烷基，且最好分别是甲基。
Z1包括构成5或6元杂环所需的碳和杂原子，如苯并噁唑鎓、
苯并噻唑鎓、苯并咪唑鎓、喹啉并[2，3-d]噻唑鎓、萘并[2，3-d]
噻唑鎓、萘并[1，2-d]噻唑鎓、苯并硒唑啉鎓、吡啶鎓和喹啉鎓。
与Z1形成的杂环可有多达三个连接与其上的附加的5元或6元芳族
稠合环(碳环或杂环)。其他环结构对于应是本领域技术人员显而
易见的。较好是苯并噁唑鎓、苯并噻唑鎓和苯并咪唑鎓环，且最
好是前两种环。这样的环可在各不同位置上被低级烷基(1至3个碳
原子)或本领域技术人员熟悉的其他取代基所取代，只要这些取代
基不会对本发明所依赖的荧光染料和核酸结合性质造成不利影响，
或不期望地减慢化合物在含水体系中的扩散能力即可。
在结构式(I)中，Z2包括形成一个5元或6元芳族环所需的碳
和杂原子，所说的芳族环连接到举例说明的杂环上，从而提供一
稠环体系。Z2可以有多达两个连接于其上的附加芳族稠合环(碳环
或杂环)。所构成的环较好是苯并或萘并环，并最优选的是苯并环，
从而得到喹啉环。
另外，结构式(I)中的n是0、1或2，且更好是0或1。
再者，m，p和q分别是0或1，条件是p和q是不相同的。优选的
是，p和q中至少有一个是1，且最好是p是0而q是1。还有，t是0、
1或2，且较好是0。
Q是带有适当的电荷的适当的酸阴离子。这样的阴离子包括但
不只限于氯化物、溴化物、对位甲苯磺酸根、硫酸单甲酯根、硫酸根、
硝酸根和本领域技术人员易于了解的其他阴离子。该结构式中，r是
1或2。
特别有用的荧光染料可购自Molecular Probes，Inc.，其商
品名和Kp值列于下面的表I中。然而，本发明不只限于使用本文
所列出的Molecular Probes Inc，的特定染料，这些只是优选的染
料。这些优选染料的阳离了也借助化学结构式确认如下。这些化
合物可包括任何适用的二价阴离子，或两个一价阴离子。其中优
选的是碘化物。
化合物A：
![]()
化合物B：
![]()
化合物C：
![]()
化合物D：
![]()
化合物E：
![]()
化合物F：
![]()
化合物G：
![]()
化合物H：
![]()
表1
化合物
商品名
Kb*
A
PO-PRO-1
3.6×104
B
PO-PRO-3
NA**
C
BO-PRO-1
5.8×104
D
BO-PRO-3
8.7×104
E
YO-PRO-1
1.5×105
F
YO-PRO-3
6×104
G
TO-PRO-1
3.6×105
H
TO-PRO-3
1.1×105
**NA＝未给出
表中的Kb值是将Molecular Probes，Inc.产品目录第224页
报告的分配系数(Kp)除去水的摩尔浓度55而计算出来的。
用于本发明实践中的荧光染料的量将根据特定染料而异，因
为各染料的结合常数和发光强度，以及估计存在的靶核酸的量均
有所不同。但一般说来，该量至少约为10-9摩尔浓度，更好是大约
10-8至10-5摩尔浓度。实际的上限为约10-5摩尔浓度，但本发明并不
限于此。本段所用的，“约”是指10％的变化。可将染料用在含少量水
可溶的有机溶剂，如二甲亚砜的水溶液中提供。
可以在任何适宜的温度，但优选的是在室温完成荧光染料和
扩增靶核酸的接触。染料和核酸之间的反应可以花几分钟甚至数
小时来完成，但特定的检测中，较长或较短的时间都可以用。
下列实施例用以说明本发明的实践，但不意味着以任何方式
进行限制。所有百分比均是重量的，除非另有说明。
实施例的材料和方法：
用于实施例1和2的引物具有下列与HIV-I DNA gag区互补的
序列：
SEQ ID NO：1：5＇-X-ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT-3＇
SEQ ID NO：2：5＇-X-TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC-3＇
用于实施例3的引物具有下列与HIV-1 DNAgag区互补的序列：
SEQ ID NO：3：5＇-X-AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAA-3＇
SEQ ID NO：4：5＇-X-CCTGCTATGT CACTTCCCCT TGGTTCTCTC-3＇
在上述引物中，X代表使用US-A-4,962,029(Levenson et
al)中描述的技术通过2个氨基四甘醇间隔基连接到寡核苷酸上的
生物素基(biotinyl)部分。
用于实施例1和2以及实施例3的试验中的捕获探子分别具有下
列序列：
SEQ ID NO：5：5＇-ATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG
TATAGCCCTA C-3＇
SEQ ID NO：6：5＇-GAGACCATCA ATGAGGAAGC TGCAGAAT-3＇
这些探子共价连接到聚合物颗粒(平均直径1μm)上，该颗粒
用常用的乳化聚合技术，从聚[苯乙烯-共(co)-3-(P-乙烯基苄硫
基)丙酸](重量百分数95∶5，平均直径1μm)制备。所述粒子在水
中的悬液用2-(N-吗啉代)乙基磺酸缓冲液(0.1M pH6)洗涤，并悬
浮至含约10％的固体。一个洗涤过的颗粒样品(3.3ml)用缓冲溶液
(0.1M)，与1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸化物
(2.1ml，84mg/ml水)和探子(983μl，44.44oD/ml nanopure水
混合)稀释成含3.33％的固体。所形成的悬液在间歇搅拌下在50℃
水溶中加热2小时，离心。然后，颗粒用含有乙二胺四乙酸二钠盐
(0.0001M)的三(羟甲基)氨基烷缓冲液(0.01M，pH8)洗涤三次，并
再悬浮其中成4％固体。探子在颗粒上的最终浓度是约75％。
在稀释成含2％的固体后，捕获剂在缓冲剂中与聚合物粘结剂
(0.2％)混合，置于实施例2中描述的袋状物中，所述粘结剂由聚[
甲基丙烯酸酯-共-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸钠-共-2-乙酰基乙
酰氧乙基异丁烯酸酯](重量百分数90∶4∶6)在缓冲液中形成的。
采用常规方法获得来源于水生栖热菌的重组DNA聚合酶。
从Molecular Probes Inc.获得在10％二甲亚砜中的YO-PRO-1、
YOYO-1、BO-RPO-1、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1和TOTO-3荧光
染料。
从Sigma Chemial获得甘油和三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液。
HIV-I靶DNA是从HUT78/HIV AAV细胞(从Bernie Poiesz of
Syracuse university获得)中获得的，每个细胞含有约1个HIV
-1拷贝。
用于实施例2中的白染料分散剂含有琼脂糖(0.5％)、4.5-二
(4-二甲氨基苯基)-2-(4-羟基-3-甲氧苯基)咪唑白染料250μM、
二亚乙基三胺五乙酸(100μM)、4＇-羟基N-乙酰苯胺(5mM)、聚乙
烯吡咯烷酮(112mM)、一元一水合磷酸钠(10mM)。
用于实施例2中的共轭物溶液含有从商业上获得的(Zymed
Laboratories Inc.，酶对抗生蛋白链菌素比率2∶1)抗生蛋白链菌
素和辣根过氧化物酶的共轭物(126μl/l、总蛋白1.259)、酪蛋白
(0.5％)和硫柳汞(0.5％)，所述轭合物在3-(4-吗啉代)丙烷磺酸缓
冲液(0.1M)中。
用于实施例2中的洗液含有氯化钠(373mM)、乙二胺四乙酸二
钠盐(2.5mM)、癸基硫酸钠(38mM)和乙基汞基硫代水杨酸钠(25μ
M)，它们在一元一水合物磷酸钠缓冲液(25mM pH7.4)中。
剩下的试剂和材料用商业途径获得或用常规方法在Eastman
Kodak公司制备的。
实施例1检测扩增的HIV-I DNA
本实施例说明检测由PCR扩增的HIV-I DNA
最终PCR反应混合物含有引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2(各
0.4μM)、氯化镁(10mM)、各种dATP、dCTP、dGTP和dTTP(各1.5mM)、
三(羟甲基)氨甲烷缓冲剂(10mM pH8)、乙二胺四乙酸(0.1mM)、氯
化钾(50mM)、DNA聚合酶(160单位/ml)和Kodak Ultrapure人
DNA(0.22μg/μl)、甘油(7.5％)。
上面指明的YO-RPO-1染料(10μM)、化合物E用三(羟甲基)氨
基甲烷盐酸化物(10mM)和乙二胺四乙酸(1mM)缓冲液稀释的方法从
在二甲亚砜(1mM)中的贮存溶液制备。缓冲过的溶液加入到反应混
合物中以提供1μM的染料浓度。
靶HIV-1 DNA(10个拷贝/μl)样品(200μl)的PCR扩增用
Ericomp热循环器(thermal)和下列PCR方案在微管(microfuge
tubes)(0.5ml)中进行。
1.在95℃下预热15秒以变性，
2.每个循环为：在63.5℃下引发和延伸40秒钟，在95℃下变
性15秒钟，
3.在95℃下最终变性60秒钟。
除了DNA聚合酶外，所有试剂均与上述提到的缓冲溶液混合。
形成的混和物等分到两个微管(1672μl/管)。将缓冲溶液(220μl)
加入到一支不含荧光染料的管(样品A)中。将YO-PRO-l染料贮存溶
液(220μl)加入到第二支管(样品B)中，然后将DNA聚合酶(88μl)
和靶核苷酸(220μl)加到每个样品中。每个样品中的内含物分成
各200μl的10个等分样，放入不同的微管，然后按以上描述的PCR。
分别在0、5、10、15、20、25、30、40和45个循环后，打开一个
管，然后在稀释后(100μl)反应混合物与3900μl染料溶液混和，
浓度为1μM，给出在荧光计比色池中的4ml的最终液体体积)。在
商业上购得的Perkin-Elmer LS-5B荧光分光光度计(激发波长
491nm，发射波长509nm)上测定那一管内含物的荧光。
这些测定结果显示在附图中，该附图是描绘荧光强度对PCR循
环数的曲线图。曲线1代表样品A的结果，在样品A中，开始时不存
在染料，但当在特定数量的PCR周期后除去样品时向其中加入了染
料。曲线2代表样品B的结果，其中，全部扩增过程中都存在染料。
可以看出，即使存在于扩增过程全过程中，YO-PRO-1染料的
存在对PCR并没有不利影响。本底荧光几乎持恒定在7至9个荧光单
位直到第30个PCR循环。在这一点，荧光开始增加直到45个PCR循
环后达到约20个荧光单位。这明显区别于开始的本底信号。
实施例2 比较实施例
将本发明的方法与本发明范围之外的扩增和检测方法进行比
较，使用YOYO-1(1μM最终浓度)，一个四价荧光染料，在以上所
述的缓冲溶液中进行。该染料具有以下结构式：
![]()
扩增使用例如在美国专利5,229,2 97(Schnipelsky et al)
中描述的那些自含化学袋状物中进行。那些袋状物含有捕获探子
SEQID NO：5，该探子连接到固定在检测通道中的颗粒上，在检测
通道处可发生反应。
袋状物装有如下试剂：
将实施例1的PCR反应混和物(除DNA聚合酶外)制成5472μl体
积。将所形成的混和物等分到管A、B和C(各1824μl)中，分别代
表样品A、B和C。
管A中的样品用缓冲液(220μl)稀释，在无任何荧光染料的情
况下进行扩增。在扩增的终止时加入染料以便对所形成产物的做
数量检测。
除了PCR试剂外，在管B中的样品还含有在扩增前就已加入的
(220μl 10μM溶液)YOYO-1荧光染料(0.1μM)。
管C中的样品也含有在扩增前就已加入的(220μl 10μM溶液)
YO-PRO-l荧光染料(0.1μM)。
然后，将DNA聚合酶(88μl)和靶HIV-1 DNA靶5核苷酸(220μl)
加到每一管中，三管中每一个的内含物用于填充八个袋状物的PCR
试剂间。
采用与实施例1相同的方法进行扩增。PCR方案采用热循环器
按以下类似地进行40个循环：
1)在95℃预热变性60秒钟，
2)进行下列每一循环：在63.5℃下引发和延伸40秒钟，在
95℃下变性10秒钟。
3)在95℃下最终变性60秒钟。
用三种方法检测扩增的结果：(1)以0分(无信号)到10分(最高
信号强度)肉眼估价的颜色染料得分，(2)溴化乙锭染色的电泳凝
胶。和(3)在商业上购得的Perkin Elmer荧光计上测得的荧光。
上面提到的颜色得分是使用在袋状物中的固定的捕获探子获
得的，用该探子在42℃保温5分钟期间扩增的靶子杂交。固定化的
靶子在30℃与共轭物溶液(上面阐明的)接触1分钟。接着在55℃下
接触洗液1分钟。在30℃下加入白染料溶液，在30℃保温2分钟后
观察形成的颜色信号。
使用商业上可购得的NuSieve 1.5％/Seakem Agarose 1％凝胶
(改成2.5％琼脂)进行电泳和溴化乙锭染色。样品在常规的TBE
缓冲剂(4μl/100μl)中用于凝胶上。
使用每种检测方法对每一样品进行三次重复试验。每一检测
方法的平均结果如下：
从白染料的颜色得分
样品 平均颜色得分
A 5.3
B 0
C 6
这些结果表明，扩增没有因样品C中存在的YO-PRO-1染料而受
到不利影响。然而样品B中YOYO-1染料的存在抑制扩增。样品A用
作阳性对照。
电泳结果
样品 日性/阴性 胶带
A 4个带中4个阳性
B 5个带中5个阴性
C 5个带在5个阳性
这些结果与上面提到的颜色得分相一致，样品A再次用作阳性
对照。用于样品B中的YOYO-1染料阻止圹增，而样品C中的YO-PRO
-1染料允许扩增进行。
使用Perkin-Elmer LS-5B荧光计产生荧光信号，对两种染料
都采用下列波长：
激发 491nm
发光 509nm
将每一种扩增产物的混合物稀释100倍，成为每一染料溶液
(1μM终浓度)。本底信号从扩增试剂混和物和每一种染料的混和
物获得。结果显示如下：
荧光结果
样品 荧光单位
本底(YOYO-1) 0.09
本底(YO-PRO-1) 0.03
样品A* 3.6，3.7，3.4，3.0
样品A** 7.1，6.6，6.0，6.0
样品B 1.5，1.5，1.5，1.4，1.4
样品C 3.7，3.5，3.6，3.2，2.8
* 扩增后加入YO-PRO-1
**扩增后加入YOYO-1
这些结果表明，尽管YOYO-1提供高的核苷酸染色，但它在扩
增中不能使用，因为它显著地抑制扩增过程。YO-PRO-1给出较低
的全面的信号，但它在扩增中可以包括在试剂混和物中。
进行了其它扩增和检测实验，但以上描述的扩增方案进行了
下列修改：(a)采用60个循环，(b)在每一循环中增加变性时间至
20秒钟，或(C)增加引发/延伸步骤至60秒钟。在这些方案的变化
中，仅(a)显示出在YOYO-1存在下产生任何的可检测的差异。所述
差异很小，可由荧光检测出，但不能被凝胶电泳或颜色信号检出。
实施例3荧光染料的进一步比较
也进行了类似实施例2中的那些扩增试验，以估价几种其它常
用荧光染料染色剂的用处。
在这些实验中，使用了上述描述的引物如SEQ ID NO：3和SEQ
ID NO：4，以及所描述的探子如SEQ ID NO：6。给出颜色得分以证
实在给出的实验中发生或不发生扩增。除了所有扩增样品与YOYO
-1溶液(0.1μM)混合，以给出普通最低阈值信号外，按实
施例2描述的方法检测荧光。
发现在本发明的实际中有用的荧光染料是YO-PRO-1(化合物
E)、BO-PRO-1(化合物C)、TO-PRO-1(化合物G)和TO-PRO-3(化合物
H)。由于从抑制PCR而无用的染料是YOYO-1(如上阐述)和如下所述
的那些：
TOTO-1
![]()
TOTO-3
![]()
下列表II列出了这一实施例中进行染料试验的荧光信号和“
KC”值。它显示出那些具有20或小于20的“KC”值的染料所给出
可接受的荧光信号。
表II
染料 荧光信号 “KC”值
BO-PRO-1 19.6 3.2
TO-PRO-3 15.5 6.2
YO-PRO-1 16 8.2
TO-PRO-1 8.32 20
TOTO-3 8.45* 25
YOYO-1 2.18 60
TOTO-1 2.70 110
*TOTO-3在一个实验中给出高的荧光信号，但它们难获得可重
复的结果，而从其它染料得到的结果是可重复的，因此，相信
TOTO-3的所提到的值是低的。
在特别地参考了其优选的实施例的情况下本发明得到了详细
描述。但须明白，变化或修改可能落在本发明的精神和范围内。
序列表
(1)一般资料
(i)申请人JOHN W.H.SUTHERLAND
DAVID R.PATTERSON
(ii)使用荧光染料和试剂盒试验检测双链核苷酸的同相方法
(iii)序列数6
(iv)通讯地址
(A)收件人：Eastman Kodak Company
Patent LegaL Staff
(B)街： 343 State street
(C)城市： Rochester
(D)州： New york
(E)国家： U.S.A.
(F)ZIP： 14650-2201
(v)计算机可读形式：
(A)媒介类型：Diskette，3.5英寸，
1.44MB storage(IBM)
(B)计算机： IBM PS/2
(C)操作系统：MS-DOS Version 3.3
(D)软件： PC-8(Word for Windows 2.0)
(vi)目前的申请资料：
(A)申请号：待指定
(B)申请日：待指定
(C)分类号：待指定
(vii)在先申请资料：无
(viii)代理人/代理机构信息：
(A)姓名：Tucker，J.Lanny
(B)登记号：27,678
(C)参考/摘要号：69807
(ix)电讯信息：
(A)电话：(716)722-9332
(B)传真：(716)477-4646
(2)SEQ ID NO：1的资料：
(i)序列特点
(A)长度：28个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链数：单
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：用于HIV-1 DNA的引物，
(iii)假拟的：无
(iv)反义：无
(vi)有机体来源：合成法制备
(vii)立即来源：相同
(x)出版信息：US-A-5,147,777
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1
5＇-ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT-3＇
(3)SEQ ID NO：2的资料：
(i)序列特点：
(A)长度：28个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链数：单
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：HIV-1 DNA的引物
(iii)假拟的：无
(iv)反义：无
(vi)有机体来源：合成法制备
(vii)立即来源：相同
(x)出版信息：US-A-5,147,777
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2
5＇-TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC-3＇
(4)SEQ ID NO：3的资料：
(i)序列特点：
(A)长度：28个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链数：单
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：HIV-1 DNA引物
(iii)假拟的：无
(iv)反义：无
(Vi)有机体来源：合成法制备
(Vii)立即来源：相同
(x)出版信息：未知
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3
5＇AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAA-3＇
(5)SEQ ID NO：4的资料：
(i)序列特点：
(A)长度：30个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链数：单
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：HIV-1 DNA引物
(iii)假拟的：无
(iv)反义：无
(vi)有机体来源：合成法制备
(vii)立即来源：相同
(x)出版信息：未知
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4
5＇-CCTGCTATGT CACT7CCCCT TGGTTCTCTC-3＇
(6)SEQ ID NO：5的资料：
(i)序列特点：
(A)长度：41个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)股数：单
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：HIV-I DNA探子
(iii)假拟的：无
(iv)反义：无
(Vi)有机体来源：合成法制备
(vii)立即来源：相同
(x)出版信息：US-A-5,147,777
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5
5＇-ATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG TATAGCCCTA C-3＇
(7)SEQ ID NO：6的资料：
(i)序列特点：
(A)长度：28个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链数：单
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类别：HIV-1 DNA探子
(iii)假拟的：无
(iv)反义：无
(Vi)有机体来源：合成法制备
(vii)立即来源：相同
(x)出版信息：未知
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6
5＇GAGACCATCA ATGAGGAAGC TGCAGAAT-3＇