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1、(10)申请公布号 CN 104248762 A (43)申请公布日 2014.12.31 CN 104248762 A (21)申请号 201410290911.2 (22)申请日 2014.06.24 CCTCC NO ： V201341 2013.09.16 A61K 39/295(2006.01) A61K 39/215(2006.01) A61P 31/14(2006.01) A61P 1/12(2006.01) (71)申请人 普莱柯生物工程股份有限公司 地址 471000 河南省洛阳市高新区凌波路 5 号 (72)发明人 张许科 孙进忠 王莹 王延辉 田克恭 (74)专利代理机构。
2、 北京华夏正合知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 ) 11017 代理人 韩登营 (54) 发明名称 一种猪流行性腹泻疫苗组合物及其制备方法 和应用 (57) 摘要 本发明提供了一种猪流行性腹泻疫苗组合 物， 该疫苗组合物含有猪流行性腹泻病毒亚单位 抗原和载体 ； 本发明还提供了一种猪流行性腹泻 疫苗组合物， 该疫苗组合物包括猪流行性腹泻病 毒亚单位抗原、 猪流行性腹泻全病毒灭活抗原和 载体。本发明还公开了含该疫苗组合物的制备方 法以及其在制备预防和 / 或治疗猪流行性腹泻的 药物中的应用。 该疫苗组合物中的S1蛋白可通过 基因工程手段对疫苗组合物的组分进行大量重组 表达， 不仅耗时短， 还可。
3、便于大规模生产 ； 当该疫 苗组合物含 S1 蛋白及猪流行性腹泻全病毒灭活 抗原时， 比单独使用全病毒灭活抗原免疫时， 免疫 效果更优， 能够有效预防猪流行性腹泻病毒变异 株和普通株导致的疾病。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 14 页 序列表 27 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书14页 序列表27页 (10)申请公布号 CN 104248762 A CN 104248762 A 1/1 页 2 1. 一种猪流行性腹泻疫苗组合物， 其特征在于， 所述疫苗组合物包括猪流行性腹泻病 毒亚单位抗原和载体。
4、 ； 其中， 所述猪流行性腹泻病毒亚单位抗原包括猪流行性腹泻病毒 S 蛋白、 S1 蛋白、 M 蛋白、 N 蛋白。 2. 根据权利要求 1 所述的疫苗组合物， 其特征在于， 所述猪流行性腹泻病毒 S1 蛋白核 苷酸序列编码 SEQ ID No.2、 SEQ ID No.4、 SEQ ID No.6、 SEQ ID No.8 或 SEQ ID No.10 氨基酸 序列 ； 优选地， 所述猪流行性腹泻病毒 S1 蛋白核苷酸序列编码 SEQ ID No.2 氨基酸序列。 3. 根据权利要求 1 所述的疫苗组合物， 其特征在于， 所述猪流行性腹泻病毒 S1 蛋白的 含量为 0.5-20g/mL。 4.。
5、 一种猪流行性腹泻疫苗组合物， 其特征在于， 所述疫苗组合物包括权利要求 1-2 任 一项所述猪流行性腹泻病毒亚单位抗原、 猪流行性腹泻全病毒灭活抗原和载体。 5. 根据权利要求 4 所述的疫苗组合物， 其特征在于， 所述猪流行性腹泻病毒亚单位抗 原为猪流行性腹泻病毒S1蛋白， 其核苷酸序列编码SEQ ID No.2、 SEQ ID No.4、 SEQ ID No.6、 SEQ ID No.8或SEQ ID No.10氨基酸序列 ； 所述猪流行性腹泻全病毒灭活抗原为灭活的猪流 行性腹泻病毒 HN1301 株。 6. 根据权利要求 5 所述的疫苗组合物， 其特征在于， 所述猪流行性腹泻病毒 S1。
6、 蛋白的含量为 0.5-20g/mL ； 所述猪流行性腹泻全病毒灭活抗原的含量为灭活前 1104.0-1107.0TCID50/mL。 7. 根据权利要求 1-6 任一项所述的疫苗组合物， 其特征在于， 所述载体包括佐剂， 所 述佐剂包括铝胶佐剂、 皂苷、 油包水乳剂、 水包油乳剂、 水包油包水乳剂、 丙烯酸或甲基丙烯 酸的聚合物、 顺丁烯二酸酐和链烯基 (alkenyl) 衍生物的共聚物、 RIBI 佐剂系统、 Block co-polymer、 SAF-M、 单磷酰脂质A、 Avridine脂质-胺佐剂、 大肠杆菌不耐热肠毒素、 霍乱毒 素、 IMS1314、 胞壁酰二肽或 Gel 佐剂中。
7、的一种或几种 ； 优选地， 所述佐剂为铝胶佐剂。 8. 根据权利要求 1-6 任一项所述疫苗组合物， 其特征在于， 所述疫苗组合物还包括其 他抗原， 所述其他抗原包括猪传染性胃肠炎病毒抗原、 猪轮状病毒抗原、 猪圆环病毒抗原、 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、 副猪嗜血杆菌抗原、 猪细小病毒抗原、 大叶性肺炎放线杆菌 抗原、 大肠杆菌抗原、 猪萎缩性鼻炎抗原、 猪伪狂犬病病毒抗原、 猪霍乱病原抗原、 猪流感病 毒抗原中的一种或多种 ； 优选地， 所述其他抗原为猪传染性胃肠炎病毒抗原。 9. 一种制备权利要求 1-3 所述疫苗组合物的方法， 其特征在于， 所述方法包括 ： (1) 克隆表达所述亚单位。
8、抗原 ； 以及 (2) 按比例混合所述表达的亚单位抗原和佐剂。 10. 一种制备权利要求 4-6 所述疫苗组合物的方法， 其特征在于， 所述方法包括 ： (1) 克隆表达所述亚单位抗原 ； (2) 增殖培养所述猪流行性腹泻病毒， 灭活 ； 以及 (3) 按比例混合所述表达的亚单位抗原和灭活的猪流行性腹泻全病毒抗原， 加入佐剂。 11. 权利要求 1-6 任一项所述的疫苗组合物在制备预防和 / 或治疗猪流行性腹泻的药 物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104248762 A 2 1/14 页 3 一种猪流行性腹泻疫苗组合物及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明属于兽用生物制品技术领。
9、域， 具体涉及一种猪流行性腹泻疫苗组合物及其 制备方法和应用。 背景技术 0002 猪流行性腹泻 (porcine epidemic diarrhoea,PED) 是由猪流行性腹泻病毒 (porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) 引起猪腹泻的一种重要急性、 接触性、 病毒性肠 道传染病， 以水样腹泻、 呕吐、 脱水和食欲下降为特征。该病最早于上世纪 70 年代发生在英 国和比利时， 1973年先后在我国上海、 辽宁、 吉林等地分离到PEDV。 PEDV可在猪群中持续存 在， 各种年龄段的猪均易感。 哺乳仔猪、 架子猪和育肥猪的发病率可达100， 尤以哺乳仔猪 。
10、严重， 病死率达 100。目前， 还没有特效药物可抵抗 PEDV， 由于该病发病急， 流行快， 猪群 一旦感染， 就会给养殖户带来巨大的经济损失。 0003 中国于 1980 年首次分离到 PEDV， 以后许多地区相继报道有本病发生， 并主要在 冬春季节散发， 造成的危害巨大。从 2010 年至今， 在我国华南、 华北部分省份暴发了严 重的猪流行性腹泻， 已超过 100 万只的猪死亡 (Sun RQ,Cai RJ,Chen YQ,et al.Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets,China.Emerging infe。
11、ctious diseases,2012,18(1):161-162)。猪流行性腹泻表现为呕吐、 腹泻、 脱水， 可发生于任何年 龄的猪， 年龄越小， 症状越重， 死亡率越高， 特别地， 7 日龄内新生仔猪发生腹泻后 3-4 天， 呈 现严重脱水而死亡， 死亡率高达 50， 最高的死亡率达 100。此外， 最新的研究表明还可 能通过乳汁进行垂直传播。 0004 目前， 对于该病的防控主要采取传统的灭活苗、 弱毒苗免疫接种。弱毒苗免疫 存在潜在的生物风险， 全病毒灭活疫苗病毒滴度低， 导致抗原含量不足， 有 PEDV 难以分 离培养， 即使营养液中加入胰酶促使其在 Vero 细胞中繁殖传代， 但。
12、病毒滴度只能维持在 1103.01TCID50/mL左右。 如采用细胞浓缩的方法使杂蛋白含量增加从而造成副反应。 因此， 如何解决疫苗免疫效果的问题是猪流行性腹泻本领域急需解决的技术问题。 发明内容 0005 为了解决现有技术的不足， 本发明提供了一种猪流行性腹泻疫苗组合物及其应 用。 该猪流行性腹泻疫苗组合物可有效预防和治疗猪流行性腹泻病毒变异株和猪流行性腹 泻病毒普通株导致的疾病。 0006 本发明的主要目的在于提供一种猪流行性腹泻疫苗组合物， 其特征在于， 所述疫 苗组合物包括猪流行性腹泻病毒亚单位抗原和载体， 所述猪流行性腹泻病毒亚单位抗原包 括猪流行性腹泻病毒 S 蛋白、 S1 蛋白。
13、、 M 蛋白、 N 蛋白。 0007 术语 “猪流行性腹泻病毒亚单位抗原” 是指具有免疫原性的猪流行腹泻病毒蛋白 片段， 包括但不限于猪流行性腹泻病毒S蛋白、 猪流行性腹泻病毒S1蛋白、 猪流行性腹泻病 毒 M 蛋白、 猪流行性腹泻病毒 N 蛋白的一种或两种混合物 ； 所述 “猪流行性腹泻病毒亚单位 说 明 书 CN 104248762 A 3 2/14 页 4 抗原” 优选为猪流行性腹泻病毒 S1 蛋白。优选地， 所述猪流行性腹泻病毒为猪流行性腹泻 病毒变异株。 0008 术语 “猪流行性腹泻病毒 S 蛋白” 是猪流行性腹泻病毒中的四个结构蛋白之一， 为 纤突蛋白 (spike 蛋白 )， 。
14、位于病毒粒子表面的纤突糖蛋白， 在病毒粒子与细胞表面受体结 合后通过膜融合侵入宿主细胞和在感染宿主体内介导中和抗体产生的过程中发挥重要生 物学作用。该蛋白是由 1384 个氨基酸组成的多肽， 含有 27-29 个潜在的糖基化位点， 划分 为 2 个功能区即 S1( 第 1-789 位氨基酸 ) 和 S2( 第 790-1383 位氨基酸 )。 0009 术语 “猪流行性腹泻病毒S1蛋白” 位于猪流行性腹泻病毒S蛋白的功能区之一， 由 789 个氨基酸组成 ( 任晓峰， 贾文龙 . 猪流行性腹泻病毒 S1 蛋白截短表达及多抗制备 . 东 北农业大学学报 ,2013,44(9):46-50)。 0。
15、010 术语 “猪流行性腹泻病毒 M 蛋白” 是猪流行性腹泻病毒中的四个结构蛋白之一， 为 膜蛋白 (Membrane 蛋白 )， 是 PEDV 中含量最多的包膜蛋白， 由 226 个氨基酸编码而成， 有三 方面的生物学作用 ： 参与病毒粒子的组装和出芽、 刺激机体产生 - 干扰素 (-IFN)、 其产 生的抗体在不提存在时具有中和病毒的能力。 0011 术语 “猪流行性腹泻病毒 N 蛋白” 是猪流行性腹泻病毒中的四个结构蛋白之一， 为 核衣壳蛋白(Nucleocapsid蛋白)， 由1326个核苷酸组成， 编码441个氨基酸， 是PEDV在感 染细胞中产生最多的病毒蛋白， 结构十分保守。 0。
16、012 术语 “猪流行性腹泻病毒变异株” 是又称高致病性猪流行性腹泻病毒， 包括但不限 于其 S1 蛋白具有与 SEQ ID No.1 基本相同的核苷酸序列的 PEDV。优选地， 猪流行性腹泻病 毒变异株其 S1 蛋白具有与 SEQ ID No.1 基本相同的核苷酸序列的 PEDV。与 SEQ ID No.1 基 本相同是指， PEDV 的核苷酸序列优选包含与 SEQ ID No.1 有 85 -100相同的序列， 优选 在猪流行性腹泻病毒变异株并非本文所述 PEDV 的条件下， 例如与作为参考病毒分离物的 CH/YNKM/2012 相比， S1 的核苷酸同源性低于 91， 优选低于 92、 。
17、93、 94、 95、 96、 97、 98或 99。猪流行性腹泻病毒变异株核苷酸序列优选有超过 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88或 89， 与 SEQ ID No.1 相同， 同样优选在猪流行性腹 泻病毒变异株并非本文所述 PEDV 的条件下， 例如与作为参考病毒分离物的 CH/YNKM/2012 相比， S1 的核苷酸同源性低于 91， 优选低于 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98或 99。 0013 术语 “同源性” 是指两条氨基酸序列或两条核苷酸序列的相似程度。 氨基酸序列或 核苷酸序列的同源性可以通过本领域公知的任何适当的方法计算。
18、得到， 例如， 可以将目标 氨基酸 ( 或核苷酸 ) 序列与参比氨基酸 ( 或核苷酸 ) 序列进行序列比对， 必要时可以引入 空缺， 使得两条比对的序列间相同的氨基酸(或核苷酸)数目达到最优化， 并在此基础上计 算两条氨基酸 ( 或核苷酸 ) 序列之间相同氨基酸 ( 或核苷酸 ) 的百分比。氨基酸 ( 或核苷 酸 ) 序列的比对和同源性的计算可以通过本领域公知的软件实现， 例如， 但不限于， BLAST 软件(在美国国立生物技术信息中心NCBI的网址上可获得 ： http:/blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi， 或者见， 例如， Altschul S.F.et 。
19、al， J.Mol.Biol.， 215 ： 403-410(1990) ； Stephen F.et al， Nucleic Acids Res.， 25 ： 3389-3402(1997)， ClustalW2 软 件 ( 在 欧 洲生物信息研究所网址上可获得 ： http:/www.eji.ac.uk/Toolsa/clustalw2/， 另见， 例 如， Higgins D.G.et al， Methods in Enzymology， 266 ： 383-402(1996) ； Larkin M.A.et al， 说 明 书 CN 104248762 A 4 3/14 页 5 Bio。
20、informatics(Oxford， England)， 23(21) ： 2947-8(2007) ； 和 TCoffee 软件等 ( 在瑞典 生物信息学研究所的网站上可以获得 ： http:/tcoffee.vital-it.ch/cgi-bin/Tcoffee/ tcoffee_cgi/index.cgi，另 见，例 如， Poirot O.et al， Nucleic Acids Res.， 31(13) ： 3503-6(2003) ； Notredame C.et al， J.Mol.Boil.， 302(1) ： 205-17(2000)。使用软件进行 序列比对时， 可以使用软。
21、件提供的默认参数， 或者也可以根据实际情况对软件提供的参数 进行调整， 这些都在本领域技术人员的知识范围内。 0014 优选地， 所述猪流行性腹泻病毒 S1 蛋白核苷酸序列编码 SEQ ID No.2、 SEQ ID No.4、 SEQ ID No.6、 SEQ ID No.8 或 SEQ ID No.10 氨基酸序列 ； 进一步优选地， 所述猪流行性 腹泻病毒 S1 蛋白核苷酸序列编码 SEQ ID No.2 氨基酸序列。 0015 作为本发明的一种实施方式， 所述猪流行性腹泻病毒 S1 蛋白为 SEQ ID No.2、 SEQ ID No.4、 SEQ ID No.6、 SEQ ID No。
22、.8 或 SEQ ID No.10 编码的至少一种蛋白 ； 优选地， 所述猪流 行性腹泻病毒 S1 蛋白为 SEQ ID No.2 编码的蛋白。 0016 作为本发明的一种实施方式， 优选地， 所述猪流行性腹泻病毒 S1 蛋白的核苷酸序 列为SEQ ID No.1、 SEQ ID No.3、 SEQ ID No.5、 SEQ ID No.7或SEQ ID No.9， 优选为SEQ ID No.1。 0017 优选地， 所述猪流行性腹泻病毒 S1 蛋白的含量为 0.5-20g/mL。 0018 作为本发明的一种优选实施方式， 所述疫苗组合物由猪流行性腹泻病毒 S1 蛋白 和兽医学上可接受的佐剂组。
23、成。 0019 本发明的另一目的在于提供一种猪流行性腹泻疫苗组合物， 其特征在于， 所述疫 苗组合物包括所述猪流行性腹泻病毒亚单位抗原、 猪流行性腹泻全病毒灭活抗原和载体。 0020 优选地， 所述猪流行性腹泻病毒亚单位抗原为猪流行性腹泻病毒 S1 蛋白， 其核苷 酸序列编码 SEQ ID No.2、 SEQ ID No.4、 SEQ ID No.6、 SEQ ID No.8 或 SEQ ID No.10 氨基酸序 列 ； 所述猪流行性腹泻全病毒灭活抗原为灭活的猪流行性腹泻病毒 HN1301 株。 0021 猪 流 行 性 腹 泻 病 毒 HN1301 株 (Porcine epidemic 。
24、diarrhea virus,strain HN1301) 的保藏号为 CCTCC NO.V201341， 保藏单位为中国典型培养物保藏中心， 保藏地址为 中国武汉市武汉大学， 保藏日期为 2013 年 9 月 16 日。 0022 优选地， 所述猪流行性腹泻病毒 S1 蛋白的含量为 0.5-20g/mL ； 所述猪流行性腹 泻全病毒灭活抗原的含量为灭活前 1104.0-1107.0TCID50/mL。 0023 优选地， 所述载体包括佐剂， 所述佐剂包括铝胶佐剂、 皂苷、 油包水乳剂、 水包油乳 剂、 水包油包水乳剂、 丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、 顺丁烯二酸酐和链烯基 (alkenyl) 。
25、衍 生物的共聚物、 RIBI佐剂系统、 Block co-polymer、 SAF-M、 单磷酰脂质A、 Avridine脂质-胺 佐剂、 大肠杆菌不耐热肠毒素、 霍乱毒素、 IMS1314、 胞壁酰二肽或 Gel 佐剂中的一种或几 种 ； 优选地， 所述佐剂为铝胶佐剂。 0024 优选地， 所述疫苗组合物还包括其他抗原， 所述其他抗原包括猪传染性胃肠炎病 毒抗原、 猪轮状病毒抗原、 猪圆环病毒抗原、 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、 副猪嗜血杆菌 抗原、 猪细小病毒抗原、 大叶性肺炎放线杆菌抗原、 大肠杆菌抗原、 猪萎缩性鼻炎抗原、 猪伪 狂犬病病毒抗原、 猪霍乱病原抗原、 猪流感病毒抗原中的一。
26、种或多种 ； 优选地， 所述其他抗 原为猪传染性胃肠炎病毒抗原。 0025 术语 “猪流行性腹泻全病毒灭活抗原” 是指在动物细胞上培养猪流行性腹泻病毒， 然后经过灭活剂灭活所制备的抗原。优选地， 所述动物细胞是 Vero 细胞。 说 明 书 CN 104248762 A 5 4/14 页 6 0026 优选地， 所述 “猪流行性腹泻全病毒灭活抗原” 为猪流行性腹泻病毒变异株的灭活 抗原。 0027 作为本发明的一种优选实施方式， 所述疫苗组合物由猪流行性腹泻病毒 S1 蛋白、 猪流行性腹泻全病毒灭活抗原和兽医学上可接受的佐剂组成。 0028 术语 “佐剂”可包括铝胶佐剂 ； 皂苷 (sapon。
27、in)， 如 Quil A、 QS-21(Cambridge Biotech Incorporation,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals Incorporation， Birmingham AL) ； 油包水乳剂 ； 水包油乳剂 ； 水包油包水乳剂 ； 丙烯酸或甲 基丙烯酸的聚合物 ； 顺丁烯二酸酐和链烯基 (alkenyl) 衍生物的共聚物选出的化合物。 0029 术语 “乳剂” 可尤其基于轻液体石蜡油 (European Pharmacopea 类型 ) ； 因烯烃寡 聚产生的类异戊二烯油 (isoprenoid oil)， 。
28、如角鲨烷 (squalane) 或角鲨烯油 (squalene oil)， 尤其异丁烯或葵烯 ； 酸或醇的含线性烷基的酯， 更尤其植物油、 油酸乙酯、 丙二醇 二 -( 辛酸酯 / 葵酸酯 )、 甘油三 -( 辛酸酯 / 葵酸酯 ) 或丙二醇二油酸酯 ； 支链脂肪酸或 醇的酯， 尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面 活性剂， 尤其山梨聚糖的酯、 二缩甘露醇 (mannide) 的酯 ( 如无水甘露醇油酸酯 )、 脂肪族 二元醇 (glycol) 的酯、 聚甘油 (polyglycerol) 的酯、 丙二醇的酯以及油酸的酯、 异硬脂 酸的酯、 蓖麻油酸的酯或羟基硬。
29、脂酸的酯， 它们任选乙氧基化， 还有聚氧丙烯 - 聚氧乙烯 嵌段共聚物， 尤其 Pluronic 产品， 特别是 L121。参见 Hunter 等编写的 The theory and practical application of adjuvants (Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,New York,1995:51-94) 和 Todd 等编写的 Vaccine (1997,15:564-570)。例如， 可使用 Powell M 和 Newman M 编 写 的 Vaccine design,the Subunit and adiuv。
30、ant approach (Plenum Press,1995) 第 147 页描述的 SPT 乳剂及第 183 页描述的 MF59 乳剂。 0030 术语 “丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物” 优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物， 尤其是与糖 (sugar) 的聚链烯基醚或聚醇交联， 这些化合物已知被称为卡波姆 (Carbomer， 商 品 名 Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2)。 本 领 域 技 术 人 员 还 可 参 见 美 国 专 利 US2909462， 其描述了这类丙烯酸聚合物， 其与聚羟基化的化合物交联， 所述化合物具有至 少 3 个羟基， 优选不超过 8 。
31、个， 其中至少 3 个羟基的氢原子被具有至少 2 个碳原子的不饱和 脂烃基(aliphatic radical)取代。 优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团， 例如乙烯 基、 烯丙基和其它烯属不饱和基团 (ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团 自身可包含其它取代基， 如甲基。这些产品以卡波普的名义出售， (BF Goodrich,Ohio,USA) 特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇 (allyl pentaerythritol) 交联。这其 中可提及卡波普 974P、 934P 和 971P， 最优选使用卡波普 971P。 0031 。
32、术语 “顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物” 也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯 的共聚物 EMA(Monsanto)， 这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液， 经中和， 优选中和至生理 pH， 以便产生佐剂溶液， 能向其中掺入免疫原性、 致免疫性或疫苗性组合物本身。 0032 术 语 “佐 剂”还 包 括，但 不 限 于， RIBI 佐 剂 系 统 (Ribi Incorporation)、 Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、 SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单 磷 酰 脂 质 A(monophosphoryl lipid A)、 Avridi。
33、ne 脂质 - 胺佐剂、 大肠杆菌不耐热肠毒素 ( 重组或其 它 )、 霍乱毒素、 IMS1314、 胞壁酰二肽、 Gel 佐剂等。 0033 优选地， 所述佐剂为铝胶佐剂、 皂苷、 油包水乳剂、 水包油乳剂、 水包油包水乳剂、 说 明 书 CN 104248762 A 6 5/14 页 7 丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、 顺丁烯二酸酐和链烯基 (alkenyl) 衍生物的共聚物、 RIBI 佐剂系统、 Block co-polymer、 SAF-M、 单磷酰脂质 A、 Avridine 脂质 - 胺佐剂、 大肠杆菌不耐 热肠毒素、 霍乱毒素、 IMS1314、 胞壁酰二肽或 Gel 佐剂中的一。
34、种或几种 ； 优选地， 所述佐剂 为铝胶佐剂。 0034 优选地， 所述佐剂在所述疫苗组合物中的体积比为 5 -30， 优选为 20。 0035 本发明所用术语 “猪流行性腹泻” 与 “PED” 、“猪流行性腹泻病毒” 与 “PEDV” 在本 发明中可互换使用。 0036 本发明所用缩略语为 ： AA， 氨基酸 ； bp， 碱基对。 0037 本发明的再一目的在于提供一种制备所述疫苗组合物的方法， 其特征在于， 所述 方法包括 ： (1)克隆表达所述亚单位抗原 ； 以及(2)按比例混合所述表达的所述亚单位抗原 和佐剂。 0038 优选地， 克隆表达所述亚单位抗原为所述 S1 蛋白， 其包括其核。
35、苷酸序列为编码 SEQ ID No.2、 SEQ ID No.4、 SEQ ID No.6、 SEQ ID No.8 或 SEQ ID No.10 氨基酸序列的序列。 0039 本发明的又一目的在于提供一种制备所述疫苗组合物的方法， 其特征在于， 所述 方法包括 ： (1)克隆表达所述亚单位抗原 ； (2)增殖培养所述猪流行性腹泻病毒， 灭活 ； 以及 (3) 按比例混合所述表达的所述亚单位抗原和灭活的猪流行性腹泻全病毒抗原， 加入佐剂。 0040 优选地， 克隆表达所述亚单位抗原为所述 S1 蛋白， 其包括其核苷酸序列为编码 SEQ ID No.2、 SEQ ID No.4、 SEQ ID 。
36、No.6、 SEQ ID No.8 或 SEQ ID No.10 氨基酸序列的序列 ； 所 述猪流行性腹泻全病毒灭活抗原为灭活的猪流行性腹泻病毒 HN1301 株。 0041 优选地， 所述的克隆表达方法为采用杆状病毒表达系统表达。 0042 本发明的还一目的在于提供所述的疫苗组合物在制备预防和 / 或治疗猪流行性 腹泻的药物中的应用。 0043 术语 “预防和 / 或治疗” 在涉及猪流行性腹泻病毒感染时是指抑制猪流行性腹泻 病毒的复制、 抑制猪流行性腹泻病毒的传播或防止猪流行性腹泻病毒在其宿主体内定居， 以及减轻猪流行性腹泻病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、 病症减轻和 / 或摄。
37、食量和 / 或生长增加， 那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。 0044 优选地， 所述猪流行性腹泻包括由猪流行性腹泻病毒变异株和猪流行性腹泻病毒 普通株导致的猪流行性腹泻。 0045 本发明所用术语 “猪” 是指任何属于猪科 (Suidae) 成员的动物， 如猪。 0046 本发明具有以下突出的优点 ： 0047 (1) 所述疫苗组合物可通过基因工程手段对疫苗组合物的组分进行大量重组表 达， 不仅耗时短， 还可便于大规模生产 ； 0048 (2) 所述疫苗组合物含有免疫原性蛋白及猪流行性腹泻全病毒灭活抗原时， 比单 独使用全病毒灭活抗原免疫时， 效果更好。 0049 (3) 疫苗保护范围广。
38、， 可以预防和治疗由猪流行性腹泻病毒变异株和猪流行性腹 泻病毒普通株导致的猪流行性腹泻。 0050 序列表中 ： 0051 序列 1 为猪流行性腹泻病毒 S1a 蛋白的核苷酸人工序列 ； 0052 序列 2 为猪流行性腹泻病毒 S1a 蛋白的氨基酸人工序列 ； 说 明 书 CN 104248762 A 7 6/14 页 8 0053 序列 3 为猪流行性腹泻病毒 CH/YNKM/2012 株 S1 蛋白的核苷酸序列 ； 0054 序列 4 为猪流行性腹泻病毒 CH/YNKM/2012 株 S1 蛋白的氨基酸序列 ； 0055 序列 5 为猪流行性腹泻病毒 SD-M 株 S1 蛋白的核苷酸序列 。
39、； 0056 序列 6 为猪流行性腹泻病毒 SD-M 株 S1 蛋白的氨基酸序列 ； 0057 序列 7 为猪流行性腹泻病毒 GDS03 株 S1 蛋白的核苷酸序列 ； 0058 序列 8 为猪流行性腹泻病毒 GDS03 株 S1 蛋白的氨基酸序列 ； 0059 序列 9 为猪流行性腹泻病毒 CH4 株 S1 蛋白的核苷酸序列 ； 0060 序列 10 为猪流行性腹泻病毒 CH4 株 S1 蛋白的氨基酸序列。 具体实施方式 0061 下面结合具体实施例来进一步描述本发明， 本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的， 并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该。
40、理解的是， 在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换， 但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 0062 本发明实施例中所采用猪流行性腹泻全病毒毒株为HN1301株(Porcine epidemic diarrhea virus,strain HN1301)， 该毒株的保藏号为 CCTCC NO.V201341， 保藏单位为中国 典型培养物保藏中心， 保藏地址为中国武汉市武汉大学， 保藏日期为 2013 年 9 月 16 日。 0063 本发明实施例中所采用猪流行性腹泻攻毒毒株为 HN1301 株或沪毒株， 其中， 沪毒 株已在中国专利CN1011176。
41、27A中公开， 农业部公告270号文件中将该毒株作为猪流行性腹 泻普通株 CV777 株的效检用强毒株。 0064 本发明实施例中所用的 pH7.2PBS 液配方为 ： 1000mL 蒸馏水中加入 NaCl9g、 Na2HPO412H2O6g、 NaH2PO42H2O0.4g， 本发明中所用到的化学试剂均为分析纯， 购自国药集 团。 0065 本发明实施例以体积比为 20的铝胶佐剂制备猪流行性腹泻疫苗组合物为例进 行阐述， 但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。 0066 本 发 明 实 施 例 中 所 用 的 猪 流 行 性 腹 泻 全 病 毒 灭 活 抗 原 含 量 以 灭 。
42、活 前 1105.0TCID50/mL 为例进行阐述， 但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限 定。 0067 本实施例中猪流行性腹泻发病的判定标准为 ： 厌食、 通常黄色或浅黄色水样腹泻， 部分仔猪伴有呕吐、 寒颤、 脱水等症状， 在临床观察的 5-6 日之内可能有部分仔猪脱水后死 亡。发病程度可能轻重不同， 但判定发病最基本的、 也是不可少的条件是腹泻。 0068 为使本发明更加容易理解， 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 本发明所述 的实验方法， 若无特殊说明， 均为常规方法 ； 所述的生物材料， 若无特殊说明， 均可从商业途 径获得。 0069 实施例 1 猪流行性腹。
43、泻病毒 S1 蛋白的制备、 鉴定及含量测定 0070 1.1 猪流行性腹泻病毒 S1a 蛋白的制备、 鉴定及含量测定 0071 1.1.1 重组载体 Bacmid-S1a 的构建 0072 根据猪流行性腹泻病毒 S1 蛋白核苷酸序列 ( 见序列表 SEQ ID No.1)， 采用人工合 成的方法， 由上海生物工程有限公司合成， 所合成的基因片段全长为2367bp。 在此人工合成 说 明 书 CN 104248762 A 8 7/14 页 9 S1 基因片段的基础上制备 S1 蛋白的模板。 0073 以前一步骤所合成的 S1 全长基因片段用做 PCR 反应的模板， 设计一对特异性引 物， 并分别。
44、在上下游添加 XhoI、 PstI 酶切位点， 引物序列如下 ： 0074 S1a-P1 ： 5GCTCTCGAGATGACGCCTTTAATTTACTTCTGGT3， 0075 S1a-P2 ： 5GGGCTGCAGTCTAATACTCATACTAAAGTTGGTG3。 0076 运用 PCR 扩增 S1 片段， 将扩增后的片段命名为 S1a。PCR 扩增条件为 ： 94预变性 5min， 94变性 30s， 55退火 30s， 72延伸 60s， 35 个循环， 72延伸 5min。 0077 将扩增产物使用 1琼脂糖凝胶进行电泳， 电泳产物使用 DNA 凝胶回收试剂盒回 收后， 将目的基。
45、因片段连接至 pGEM-T 载体， 并转化 DH5 感受态细胞， 酶切鉴定后， 将阳性 质粒测序， 测序正确的质粒命名为pGEM-T-S1a。 S1a的测序结果如序列表SEQ ID No.1所示。 0078 重组 pFastbac I-S1a 的构建 ： 将 pGEM-T-S1a、 pFastbac I 同时进行双酶切， 酶切 产物进行电泳， 使用 DNA 凝胶回收试剂盒回收相应的 S1a、 pFastbac I 片段。将回收的 S1a、 pFastbac I片段使用T4DNA Ligase进行连接， 连接产物转化入DH5感受态细胞。 将含有充 足质粒的 DH5 感受态细胞进行培养， 使用质粒。
46、提取试剂盒提取质粒， 并进行双酶切鉴定， 同时将酶切鉴定正确的质粒进行测序， 测序正确的重组质粒命名为pFastbac I-S1a。 S1a的 测序结果如序列表 SEQ ID No.1 所示。 0079 重组穿梭载体 Bacmid-S1a 的构建 ： 将上述构建的 pFastbac I-S1a 质粒转化 DH10Bac感受态细胞， 转化细胞接种于含有三抗的LB固体培养基， 同时进行蓝白斑筛选。 挑 取白斑接种于含三抗的 LB 液体培养基进行培养。收获菌液， 使用质粒提取试剂盒提取质 粒， 并进行 PCR 鉴定， 将鉴定正确的质粒命名为 Bacmid-S1a。 0080 1.1.2Bacmid-。
47、S1a 质粒的转染、 表达及鉴定 0081 Bacmid-S1a质粒转染Sf9昆虫细胞 ： 在6孔细胞板培养Sf9细胞， 转染Bacmid-S1a 质粒， 观察转染细胞生长状态， 并换液， 至细胞出现病变时， 收集上清， 4避光保存。 并按照 0.1M.O.I 进行 F2 代、 F3 代的扩增。 0082 S1a 蛋白的表达 ： 将收获的 F3 代按 2-5M.O.I 的体积比接种 Sf9 细胞进行悬浮 培养， 分别置于液氮、 37水浴中反复冻融 2-3 次， 离心， 去除细胞碎片， 将所获上清进行 SDS-PAGE电泳， 同时添加0.1甲醛于所获上清并置37灭活6h， 电泳结果表明 ： 相对。
48、于对 照， 在相应位置出现目的蛋白。并进行 Western blot 鉴定， 结果标明 ： 所获得的 S1a 蛋白能 与猪抗 PEDV 阳性血清反应。 0083 1.1.3S1a 蛋白含量的测定 0084 将上述获得的上清， 使用硫酸铵法沉淀， 离心后， 沉淀使用 PBS 重悬， 并测定蛋白 浓度。将 S1a 蛋白使用 SDS-PAGE 进行电泳， 分别取梯度稀释后浓度为 500、 375、 187.5、 93.75、 46.875g/mL 的牛血清白蛋白 (BSA) 标准品同步进行电泳。SDS-PAGE 电泳后， 使用 考马斯亮蓝染色， 脱色后使用扫描仪扫描。 使用Alph-ImagerTM。
49、3400软件对电泳图像进行定 量分析， 以 BSA 标准品建立回归曲线， 计算重组 S1a 蛋白的浓度， 将测定的重组 S1a 蛋白稀 释至 100g/mL。 0085 1.2 猪流行性腹泻病毒 S1b 蛋白的表达、 鉴定及含量测定 0086 1.2.1 重组载体 Bacmid-S1b 的构建 0087 S1基因的克隆及pMD18-T-S1载体的构建 ： 根据NCBI(http:/www.ncbi.nlm.nih. 说 明 书 CN 104248762 A 9 8/14 页 10 gov)中报道的PEDV CH/YNKM/2012株(登录号为JX018180.1)中S1蛋白的基因序列(见序 列表 SEQ ID No.3) 设计一对特异性引物， 并分别在上下游添加 XhoI、。