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1、(10)申请公布号 CN 104254335 A (43)申请公布日 2014.12.31 CN 104254335 A (21)申请号 201380021665.4 (22)申请日 2013.03.05 MI2012A000338 2012.03.06 IT A61K 33/00(2006.01) A61K 35/14(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61K 38/18(2006.01) (71)申请人 安德烈亚比尼奥蒂 地址 意大利布雷西亚 申请人 基娅拉蒂雷利 (72)发明人 安德烈亚比尼奥蒂 基娅拉蒂雷利 (74)专利代理机构 中国国际贸易促进委员会专 利商。
2、标事务所 11038 代理人 焦丽雅 (54) 发明名称 治疗制剂及制备所述治疗制剂的方法 (57) 摘要 一种治疗制剂(1)， 其包括臭氧化油和血小板 浓缩物 (2)， 根据基本上在 2 至 4 范围中的血小板 浓缩物(2)和臭氧化油(3)的体积混合比来混合。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2014.10.24 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/IB2013/051739 2013.03.05 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2013/132428 EN 2013.09.12 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 。
3、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104254335 A CN 104254335 A 1/1 页 2 1. 一种治疗制剂 (1)， 其特征在于包含包括臭氧的物质 (3) 和蛋白质性质的物质 (2)。 2. 如权利要求 1 中所要求的治疗制剂 (1)， 其中所述蛋白质性质的物质 (2) 是生长因 子的组合物。 3. 如权利要求 2 中所要求的治疗制剂 (1)， 其中所述蛋白质性质的物质 (2) 是血小板 浓缩物。 4. 如权利要求 2 中所要求的治疗制剂 (1)， 其中所述蛋白质性质的物质 (2) 是干细。
4、胞 条件培养基。 5. 如一项或多项前述权利要求中所要求的治疗制剂 (1)， 其中所述包括臭氧的物质 (3) 是在流体中的溶液中的臭氧。 6. 根据前述权利要求的治疗制剂 (1)， 其中所述臭氧在油中的溶液中。 7. 如一项或多项前述权利要求中所要求的治疗制剂 (1)， 其中所述包括臭氧的物质 (3) 是臭氧化油。 8. 如权利要求 7 和 3 中所要求的治疗制剂 (1)， 其中所述血小板浓缩物 (2) 的含量与 所述包括臭氧的流体 (3) 的含量的比例在 2 至 4 之间的范围中。 9. 根据前述权利要求的治疗制剂 (1)， 用于治疗牛乳腺炎。 10. 一种用于牛科动物治疗的治疗制剂 (1)。
5、 的制备方法， 其特征在于其包括混合步骤， 其中将包括臭氧的物质 (3) 和蛋白质性质的物质 (2) 混合。 11. 根据一项或多项前述权利要求的制备方法， 包括冷却步骤 (15)， 其中将所述治疗 制剂 (1) 带至基本上等于 -80的温度。 12. 根据一项或多项前述权利要求的制备方法， 包括冷却步骤 (15)， 其中用液氮冷冻 所述治疗制剂 (1)。 权 利 要 求 书 CN 104254335 A 2 1/6 页 3 治疗制剂及制备所述治疗制剂的方法 发明领域 0001 本发明涉及一种治疗制剂及其制备方法， 其类型如独立权利要求前序中所述。 0002 优选， 本发明涉及一种用于牛科动物。
6、治疗的治疗制剂， 所述牛科动物如牛 (Bos taurus) 或绵羊 (Ovis aries)， 并且更具体地， 用于治疗牛的乳腺疾病， 优选乳腺炎。 0003 发明背景 0004 众所周知， 乳腺炎由微生物引起的乳房炎症组成， 所述微生物通过乳头在乳腺内 部渗透， 引起所述乳腺内部的免疫系统的应答， 并且因此引起乳汁的物理、 化学和细菌学变 化。 0005 例如， 乳腺炎的发作导致乳汁生产减少， 其可能完全停止。 0006 首先， 随着炎症水平逐渐提高， 由于膜渗透性的改变， 其促进了血液成分从血液循 环系统过滤至乳房中， 乳汁的化学组成越来越像血液的， 以及分泌组织的合成活性降低。 000。
7、7 结果， 在一些情况中， 由于上述改变， 迫使饲养者用抗生素治疗动物一段时间， 并 且丢弃动物在该时间段中生产的乳汁。 0008 最后， 重要的问题是后来才诊断为乳腺炎并且因此一定数量的坏乳汁意外地与正 常乳汁混合并且销售， 导致人的肠性质问题或其他疾病的事实。 0009 为了解决上述问题并且因此治愈乳腺炎病例， 目前饲养者使用抗生素。 0010 上述现有技术具有几个明显的缺陷。 0011 实际上， 抗生素或激素的使用导致这样的物质残留在乳汁中并且因此在消费者中 形成健康问题。 0012 特别地， 乳汁中抗生素残留物的存在意味着这些可以进入人食物链中， 由于过敏， 或在任何情况中， 这样的物。
8、质可能具有的有害影响， 因此增加了消费者的健康风险。 0013 此外， 所述从食物转移至人的抗生素的残留物可能引起食用受污染食物的个体中 抗性细菌的选择。实际上， 在近些年中， 抗生素抗性现象的扩散已经变得普遍， 对公众健康 具有可能的风险。 0014 因此， 另一个问题是用抗生素治疗牛时产生的乳汁必须丢弃， 导致饲养者的经济 损失的事实。 0015 再一个问题是在尿液或其他分泌物中也发现了抗生素残留物的事实， 尿液或其他 分泌物分散在环境中， 是污染源。 0016 仍然重要的另一个缺陷是抗生素成本高并且不是特别有效的事实。 发明内容 0017 在这种情况下， 本发明的技术目的是研发一种基本上。
9、克服了上述麻烦的用于治疗 牛科动物的治疗制剂及其制备方法。 0018 在所述技术目的范围内， 本发明的一个重要目的是获得用于治疗牛科动物的治疗 制剂， 其没有发现乳汁中存在对人有害的残余物。 0019 本发明的另一个重要目的是因此制备用于治疗牛科动物的治疗制剂， 其不需要丢 说 明 书 CN 104254335 A 3 2/6 页 4 弃在治疗期间产生的乳汁。 0020 本发明的再一个目的是发明用于治疗牛科动物的治疗制剂， 其特别有效并且特征 在于降低的环境影响。 0021 仍然重要的目的是获得这样的治疗制剂的制备方法， 其是容易进行且经济的。 0022 可以通过如所附权利要求中要求的用于治疗。
10、牛科动物的治疗制剂及其制备方法 实现技术目的和特定的目标。 0023 优选的实施方案描述于从属权利要求中。 0024 参照附图 1， 从以下优选实施方案的详述将清楚地显示出本发明的特征和优点， 所 述附图 1 显示了根据本发明的用于治疗牛科动物的治疗制剂的制备方法的图。 0025 关于所述附图， 参照数字 1 全部表示根据本发明的治疗制剂。 0026 其适用于治疗和治愈人和动物， 并且优选是牛， 其是术语牛科的动物的外部和内 部的炎症状况。特别地， 治疗制剂 1 适用于牛中， 用于治疗乳腺疾病、 伴随或未伴随细菌或 感染并发症的关节炎， 以及用于组织的再生， 以防止受伤、 变老后的组织损伤。 。
11、更特别地， 治 疗制剂 1 适用于牛 (Bos taurus) 乳腺炎的治疗。 0027 制剂1主要包含蛋白质性质的物质2和包括臭氧的物质3， 优选是在流体中的溶液 中。所述流体优选是液体， 并且更优选是油， 使得制备臭氧化的油 3。 0028 蛋白质性质的物质2是由氨基酸组成的物质， 并且因此由单体(即， 氨基酸)、 二聚 体或蛋白质聚合物组成。 0029 优选， 蛋白质性质的物质 2 是生长因子的组合物。术语生长因子， 用于医学领域 中， 用来表示适于刺激和调节细胞增殖的蛋白质性质的物质。 0030 作为非穷举性的实例， 生长因子的主要功能是通过使细胞静止 (G0 期 ) 停止并进 入 G。
12、1 期细胞 ( 生长 )， 对细胞周期的外部控制。生长因子进一步调控有丝分裂、 细胞存活、 移动和细胞分化的激活。以及随着增殖， 它们通常同时促进分化和成熟。 0031 再次作为非穷举性的实例， 以下给出了一些生长因子的列表 ： 0032 -TGF-( 转化生长因子 )， 0033 -BMP( 骨形成蛋白 )， 0034 - 神经营养因子 (NGF、 BDNF 和 NT3)， 0035 -FGF( 成纤维细胞生长因子 )， 0036 - 巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF) 或 CSF-1， 0037 - 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 或 CSF-2， 0038 - 粒细胞集落。
13、刺激因子 (G-CSF) 或 CSF-3， 0039 - 神经生长因子 (NGF)， 0040 - 神经营养因子， 0041 - 血小板衍生生长因子 (PDGF) ； 位于血小板中并且在各种刺激下通过其 - 颗粒 释放。还可以通过巨噬细胞产生。还干预新形成的血管的稳定， 补充平滑肌。 0042 - 胰岛素样生长因子， 0043 - 促红细胞生成素 (EPO)， 0044 - 血栓形成素 (TPO)， 0045 - 筒箭毒素 (GDF-8)， 说 明 书 CN 104254335 A 4 3/6 页 5 0046 - 生长分化因子 -9(GDF9)， 0047 - 碱性成纤维细胞生长因子 (bF。
14、GF 或 FGF2)， 0048 - 表皮生长因子 (EGF)， 也称为上皮生长因子， 诱导有丝分裂并且可以在各种生物 流体 ( 唾液、 尿液、 汗液 ) 中找到。其结合通常称为 ERB-B1 的 EGFR 受体。 0049 - 干细胞生长因子 (HGF)， 0050 - 血管内皮生长因子 (VEGF) ： 其涉及如炎症、 血管生成、 缺血性细胞这样的过程。 存在不同的类型， 如 ： VEGF A、 B、 C、 D、 E， 其结合如 VEGFR1、 2、 3 这样的受体， 这些受体具有不 同的位置并且结合不同的 VEGF。VEGF 诱导毛细血管渗透性的提高， 导致水肿的形成， 0051 -TG。
15、F- ： 涉及几乎全部肿瘤的转化生长因子 -。其结合与 EGF 相同的受体并且 具有相同的作用， 0052 -TGF- ： 由血小板、 巨噬细胞、 淋巴细胞产生的转化生长因子 -。其以两种形 式合成， 一种潜伏的和一种活性的。活性形式首先结合受体 2， 形成主要的稳定复合物， 其 结合受体 1， 形成次要的稳定复合物， 其承担 SMAD2 和 3 中的 SMAD 转录因子的磷酸化， 其随 后结合 SMAD4 转录因子。形成了杂二聚体， 其能够进入核内部， 并且促进或抑制基因激活。 TGF- 决定了抑制 CDK 的因子的浓度增加， 引起细胞周期的阻断。其还干涉新形成的血管 的稳定， 补充基质细胞。
16、蛋白质。 0053 优选， 生长因子的组合物是血小板浓缩物。 0054 其基本上由血液成分组成， 其是血液提取物， 其的血小板浓度优选至少为 108血小 板 /ml 并且合适地， 基本上等于 109血小板 /ml。 0055 其优选是同种类型的， 换句话说， 获自源自相同物种的血样， 特别是牛科动物， 或 获自相同的品种， 包括使用制剂 1 的动物。 0056 在另一个优选的解决方法中， 生长因子的组合物是包含在干细胞条件培养基中的 类型。 0057 使用任何方法来生产包括臭氧的物质 3， 其可以是纯臭氧或与氧混合或没有混合 的臭氧。 优选， 臭氧在流体中的溶液中， 或替换地， 在固体中， 并。
17、且更优选是臭氧化的油3， 其 基本上是用油或相似物质乳化的臭氧并且优选用葵花籽油乳化， 并且如果按照特定应用的 需求， 还可以含有其他另外的成分。其由气体液体溶液组成， 优选其中臭氧是饱和的。 0058 在其中蛋白质性质的物质2是血小板浓缩物并且包括臭氧的物质3是臭氧化油的 情况中， 蛋白质性质的物质 2 与包括臭氧的物质 3 之间的体积混合比优选基本上在 2 至 4 之间的范围中。优选， 所述混合比基本上在 2.5 至 3.5 之间的范围中， 并且更优选， 接近于 3， 即三份蛋白质性质的物质 2 和一份臭氧。 0059 本发明进一步涉及用于制备上述用于治疗牛科动物的治疗制剂的方法。 具体实。
18、施方式 0060 这样的制备方法 10 包括取样步骤 11， 其中血样 11a 取自牛 ； 分离步骤 12， 其中从 血样中提取血小板浓缩物 2 ； 乳化步骤 13， 其中通过将臭氧吹入油中获得臭氧化油 3 ； 混合 步骤14， 其中将包括臭氧的物质3和血小板浓缩物2混合 ； 和冷却步骤15， 其中将治疗制剂 1 深冻。 0061 在取样步骤中， 操作者选择一头或两头牛科动物并且提取血样 11a。特别地， 从健 说 明 书 CN 104254335 A 5 4/6 页 6 康的牛提取血样 11a， 即， 特征在于实际上完美的健康状况并且因此没有治疗制剂 1 解决的 疾病。 0062 特别地， 。
19、在取样步骤 11 的过程中， 例如使用 16 规格针， 基本上对应于 16.83mm， 用 注射器 11b 通过外部颈静脉穿刺或从皮下乳静脉提取样品 11a， 并且随后收集在血袋中。 0063 然后将血样 11a 收集在由 PVC 制得的并且含有抗凝剂和防腐剂 ( 如， 例如， CPDA-1)的血袋中。 更特别地， 将血样11a收集在血袋中， 其对于每100ml血液， 基本上含有 0.327g 柠檬酸一水合物， 2.63g 柠檬酸钠二水合物， 0.251g 磷酸二氢钠二水合物， 2.90g 无 水葡萄糖和 0.0275g 腺嘌呤。 0064 一旦已经获取样品， 将袋子放入特定的冰箱中以将它们保。
20、持在基本上等于 4的 温度下， 来完成步骤 11。 0065 在取样的二十四小时内， 该方法提供了分离步骤 12， 其中从牛的血样 11a 中提取 蛋白质性质的物质 2。详细地， 以获得蛋白质性质的物质 2 的方式来处理血液， 蛋白质性质 的物质 2 的特征在于基本上等于 109血小板 /ml 的血小板含量。 0066 特别地， 在步骤 12 中， 将血样 11a 接受两个分离循环， 一个在低速下， 一个在高速 下， 使得有利于不同密度的各种元素存在于血样 11a 中。 0067 更特别地， 步骤 12 可以涉及低转速的第一个离心循环 (100 转速 /min， 持续 30 分 钟 )， 使得。
21、将富含血小板的血浆 12b 与红细胞或其他丢弃物 12c 分离， 高转速的第二个离心 循环 (1500 转速 /min， 持续 10 分钟 )， 其中从富含血小板的血浆中提取出蛋白质性质的物 质 2 和由贫血小板血浆 (ppp) 组成的丢弃材料 12c。 0068 最后， 由此获得的蛋白质性质的物质 2 应当不具有所需的血小板浓度， 分离步骤 12 提供了使用贫血小板血浆 (ppp)12c 来稀释， 使得获得所需的浓度 (109血小板 /ml)。 0069 在乳化步骤 13 中， 通过将氧 - 臭氧混合物 13a 吹入油 13b 中， 并且优选吹入葵花 籽油， 优选冷榨葵花籽油中， 来制备臭氧。
22、化油。 0070 详细地， 在这样的步骤 13 中， 将无菌容器 13c 部分地装满油 13b， 然后将 30g/ml 浓度的氧 - 臭氧混合物吹入其中， 持续 15 分钟， 使得引起油的乳化， 并且随后将臭氧 13b 和 油 13a 适当混合， 以获得包括臭氧的物质 3。 0071 一旦完成了乳化步骤 13， 存在混合步骤 14， 其中将包括臭氧的物质 3 和血小板浓 缩物 2 混合在一起。 0072 详细地， 在这样的步骤 14 中， 蛋白质性质的物质 2 的含量和包括臭氧的物质 3( 优 选包括臭氧的物质 3) 的含量之间的体积混合比基本上在 1 至 5 之间的范围中。优选， 所述 浓缩。
23、物 2 和臭氧化油 3 之间的体积混合比基本上在 2 至 4 之间的范围中， 更优选在 2.5 至 3.5 之间的范围中， 并且甚至更优选， 基本上等于 3。 0073 这点后接着是冷却步骤 15， 其中将治疗制剂 1 深冻， 并且特别地， 带至基本上等 于 -80的温度， 持续至少 12 小时， 或用液氮处理较短的时间段。 0074 例如， 通过使用一定剂量的血小板浓缩物的注射器仅仅收集样品和随后收集流体 中的臭氧样品来获得这一步骤。已知臭氧较低的比重， 其上升至表面并且部分保留在其已 经通过的血小板浓缩物的溶液中。 0075 在冷却步骤 15 中， 在所述 12 小时结束时， 在 +20至。
24、 25范围的温度下， 融化治 疗制剂 112 小时， 然后在 -80下再次深冻 12 小时。这样的步骤具有破裂血小板细胞的作 说 明 书 CN 104254335 A 6 5/6 页 7 用， 这因此使得必需的因子出现。或者， 所述步骤可以被添加钙离子 (Ca+或 Ca+) 替代或结 合添加的钙离子 (Ca+或 Ca+)， 钙离子使得所述必需因子从血小板细胞中显露出来。 0076 完成冷却步骤 15 后， 所述方法涉及最后的保存步骤 16， 其中在大约 -20下保存 治疗制剂直至使用时。 0077 本发明获得了一些重要的优势。 0078 第一个基础优势是由包括臭氧的物质3和蛋白质性质的物质2的。
25、创造性组合物给 予的。 0079 其实现了用于治疗动物或人并且作为抗生素、 抗炎产品、 抗菌剂、 组织重建和再生 产品的重要优势， 包括防止组织损伤和 / 或器官和 / 或组织和 / 或受伤后和 / 或疾病和 / 或老化的功能恢复的作用。 0080 特别地， 其作为抗生素是特别有利的。 0081 详细地， 其使得可以获得非常有效的产品， 用于治疗乳腺炎或乳腺的其他炎症。 0082 这一方面还通过冷却步骤15得到了保证， 其通过将制剂带至-80， 有利于制剂1 的特征性血小板因子的释放。 0083 此外， 上述组合物使得制剂 1 作为抗生素、 抗炎产品、 抗菌剂、 组织重建产品在牛 或其他动物或。
26、甚至人的治疗中格外有效， 用于治疗外部和内部炎症、 关节炎、 细菌和 / 或感 染并发症， 具有极大的组织再生能力和受伤或老化后组织损伤的预防性功能。 0084 一个重要优势在于以下事实 ： 由于治疗制剂1的特定组成， 用治疗制剂1治疗过程 中产生的乳汁不含抗生素残余物， 并且因此消费者可以使用， 而没有任何健康风险。 0085 因此， 另一个优势是以下事实 ： 治疗制剂 1 的使用不需要将治疗过程中产生的乳 汁丢弃。 0086 此外， 由于臭氧化油和血小板浓缩物的组合， 治疗制剂 1 不涉及乳汁生产减少的 事实增强了这一优势。 0087 再一个优势是以下事实 ： 浓缩物2是同种类型的， 制剂。
27、1能更好地耐受并且几乎没 有副作用或不良反应。 0088 同样重要的另一个优势是与目前已知的那些相比， 治疗制剂1及其制备方法10两 者降低的成本。 0089 再一个重要优势是治疗制剂 1 的使用非常多面性， 其实际上可以通过注射器来注 射、 以霜剂的形式外部施用 ( 例如， 用于膝盖或肌肉 ) 或内部 ( 例如， 在子宫或口腔内 ) 施 用， 或包裹在丸剂中被牛吞咽等。 0090 因此， 例如， 以肌内、 乳房小管内、 子宫内、 经皮、 皮下、 关节内给药来容易地使用， 也可以通过肠途径， 包括口服、 颊或舌下、 直肠， 其中包括子宫内和乳房小管途径， 通过非肠 道途径， 其中包括静脉内、 。
28、肌内、 皮下、 吸入、 动脉内、 鞘内、 腹膜内、 关节内和皮内， 局限地或 局部地， 包括皮肤、 经皮、 鼻、 眼或耳途径。 0091 牛科动物的实验研究已经证实了存在于多种样品中的体细胞的数目， 所述样品包 括单独给药制剂 1 前后从所述牛科动物获取的乳汁。 0092 用 6ml 血小板浓缩物 2 和 2ml 臭氧化油 3 的日剂量治疗所述牛科动物， 连续四天。 0093 如所知的， 乳汁中存在的体细胞的数目与相关乳房的感染程度成正相关。 0094 结果如下 ： 在给药那天， 乳汁样品中存在的体细胞的平均数目大约为 9,658,182 说 明 书 CN 104254335 A 7 6/6 页 8 个 ； 七天后， 它们降低 84， 降至样品大约 1,548,364 个的平均总数 ； 两周后， 体细胞降低 97， 降至样品中大约 276,455 个的平均总数 ； 三十天后， 体细胞降低 99， 降至样品中大 约 125,364 个的平均总数。 0095 另一个优势是方法 1 和制剂 1 几乎不含污染物。 说 明 书 CN 104254335 A 8 1/1 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 104254335 A 9 。