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1、(10)申请公布号 CN 104248761 A (43)申请公布日 2014.12.31 CN 104248761 A (21)申请号 201410289029.6 (22)申请日 2014.06.24 A61K 39/295(2006.01) A61K 39/09(2006.01) A61K 39/187(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A61P 31/14(2006.01) (71)申请人 普莱柯生物工程股份有限公司 地址 471000 河南省洛阳市高新区凌波路 5 号 (72)发明人 张许科 孙进忠 张海洋 田克恭 (74)专利代理机构 北京华夏正合知识产权代。
2、理 事务所 ( 普通合伙 ) 11017 代理人 韩登营 (54) 发明名称 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 (57) 摘要 本发明涉及兽用生物制品领域。 更具体地， 本 发明涉及猪瘟病毒、 猪链球菌的疫苗组合物及其 制备方法， 所述组合物包含猪瘟病毒、 猪链球菌抗 原。本发明还涉及将所述疫苗组合物用于制备预 防和 / 或治疗与猪瘟病毒、 猪链球菌相关的疾病 和由猪瘟病毒、 猪链球菌导致的感染的组合物的 应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 14 页 序列表 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书14页 序列表5页 (。
3、10)申请公布号 CN 104248761 A CN 104248761 A 1/1 页 2 1. 一种疫苗组合物， 其特征在于， 所述疫苗组合物包含免疫量的猪瘟病毒抗原、 免疫量 的猪链球菌抗原及兽医学上可接受的载剂。 2. 根据权利要求 1 所述的疫苗组合物， 其特征在于， 所述猪瘟病毒抗原为减毒的猪瘟 病毒全病毒、 灭活的猪瘟病毒全病毒或起免疫作用的猪瘟病毒亚单位蛋白片段 ； 优选地， 所 述猪瘟病毒抗原为减毒的猪瘟病毒全病毒或起免疫作用的猪瘟病毒亚单位蛋白片段 ； 更优 选地， 所述减毒的猪瘟病毒全病毒为猪瘟病毒兔化弱毒株全病毒， 所述起免疫作用的猪瘟 病毒亚单位蛋白片段为猪瘟病毒 E。
4、2 蛋白 ； 最优选的， 所述的猪瘟病毒 E2 蛋白是由 SEQ ID NO.5 编码的蛋白。 3. 根据权利要求 1 所述的疫苗组合物， 其特征在于， 所述的猪链球菌抗原为减毒的猪 链球菌全菌、 灭活的猪链球菌全菌或起免疫作用的猪链球菌亚单位蛋白片段 ； 优选地， 所述 猪链球菌抗原为灭活的猪链球菌全菌或起免疫作用的猪链球菌亚单位蛋白片段 ； 更优选 地， 所述灭活的猪链球菌全菌为灭活的猪链球菌 2 型全菌， 所述起免疫作用的猪链球菌亚 单位蛋白片段为猪链球菌 38KDA 蛋白和 SaoA 蛋白的一种或两种 ； 最优选地， 所述的猪链球 菌 38KDA 蛋白是由 SEQ ID NO.3 编码。
5、的蛋白， 所述的猪链球菌 SaoA 蛋白是由 SEQ ID NO.4 编 码的蛋白。 4. 一种疫苗组合物， 其特征在于， 所述的疫苗组合物由猪瘟病毒兔化弱毒株全病毒抗 原和灭活的猪链球菌 2 型 SC 株全菌抗原以及载剂组成。 5. 一种疫苗组合物， 其特征在于， 所述的疫苗组合物由猪瘟病毒兔化弱毒株全病毒抗 原和猪链球菌 38KDA 蛋白、 SaoA 蛋白以及载剂组成。 6. 一种疫苗组合物， 其特征在于， 所述的疫苗组合物由猪瘟病毒 E2 蛋白和灭活的猪链 球菌 2 型 SC 株全菌抗原以及载剂组成。 7. 一种疫苗组合物， 其特征在于， 所述的疫苗组合物由猪瘟病毒 E2 蛋白和猪链球菌。
6、 38KDA 蛋白、 SaoA 蛋白以及载剂组成。 8. 一种制备权利要求 1-7 所述疫苗组合物的方法， 其特征在于， 所述的制备方法包括 ： 1) 制备猪瘟病毒抗原、 猪链球菌抗原 ； 2) 将步骤 (1) 制备的猪瘟病毒抗原和猪链球菌抗原分别加入载剂各自制备疫苗或按 比例混合后加入载剂制备混合疫苗。 9.根据权利要求1-7所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗亚临床感染猪链球菌猪只 猪瘟疫苗免疫失败的药物中的应用。 10.根据权利要求1-7所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪瘟病毒、 猪链球菌相关 疾病或感染的药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104248761 A 2 1/14 页。
7、 3 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及兽用生物制品领域， 特别是涉及一种疫苗组合物及其制备方法 和应用。更具体地， 本发明涉及猪瘟病毒 (classical swine fever virus)、 猪链球菌 (Streptococcus suis) 的疫苗组合物及其制备方法， 所述组合物包含猪瘟病毒、 猪链球菌 抗原。本发明还涉及将所述疫苗组合物用于制备预防和 / 或治疗与猪瘟病毒、 猪链球菌相 关的疾病和由猪瘟病毒、 猪链球菌导致的感染的组合物的应用。 背景技术 0002 猪链球菌是一种重要的猪病原体， 可导致许多病理疾病诸如关节炎、 心内膜炎、 脑 膜炎、 。
8、肺炎和败血病。其还是对于接触污染的猪或它们的副产物的人的重要的动物传染病 病原体， 导致脑膜炎和心内膜炎。 目前已知基于荚膜抗原的三十三种血清型(1-31型、 33和 1/2 型 )， 是引起猪链球菌病的重要的病原， 虽然还不完全了解涉及猪链球菌的发病机理和 致病力的机制， 但临床上猪链球菌作为一种常在菌， 常常定植于猪的呼吸道 ( 特别是扁桃 体和鼻腔 )、 生殖道和消化道， 以隐形感染的形式存在， 表现为亚临床感染。 0003 猪 瘟 (classical swine fever， CSF) 是 由 猪 瘟 病 毒 (classical swine fever virus， CSFV) 引。
9、起的一种急性、 发热、 接触性传染、 严重危害养猪业的毁灭性传染病， 具有高 度传染性和致死性。该病死亡率高达 80 -90， 世界动物卫生组织 (OIE) 将其列为 OIE 疾病名录， 我国也将其列为一类传染病。猪瘟的防治历来是全世界猪瘟存在国非常重视的 课题， 为此各国都投入了大量的人力、 物力， 并取得了很大的成绩。目前疫苗接种仍是控制 猪瘟的重要手段。 但由于免疫抑制的原因会造成猪瘟疫苗免疫失败， 造成严重的经济损失。 发明内容 0004 本发明人意外发现， 亚临床感染猪链球菌的猪只免疫猪瘟疫苗， 会引起免疫抑制， 不能有效的引起免疫应答， 是造成免疫失败的一个原因。 0005 本发明。
10、的目的在于克服现有技术缺陷， 提供一种预防和 / 或治疗亚临床感染猪链 球菌猪只猪瘟疫苗免疫失败的疫苗组合物， 包含免疫量的猪瘟病毒抗原、 猪链球菌抗原及 兽医学上可接受的载剂。 0006 优选地， 所述的猪瘟病毒抗原为减毒的猪瘟病毒全病毒、 灭活的猪瘟病毒全病毒 或起免疫作用的猪瘟病毒亚单位蛋白片段 ； 更优选地， 所述猪瘟病毒抗原为减毒的猪瘟病 毒全病毒或起免疫作用的猪瘟病毒亚单位蛋白片段 ； 进一步优选的， 所述减毒的猪瘟病毒 全病毒为猪瘟病毒兔化弱毒株， 所述起免疫作用的猪瘟病毒亚单位蛋白片段为猪瘟病毒 E2 蛋白 ； 最优选地， 所述猪瘟病毒 E2 蛋白氨基酸序列如 SEQ ID N。
11、O ： 5 所示。 。 0007 优选地， 所述的猪链球菌抗原为减毒的猪链球菌全菌、 灭活的猪链球菌全菌或起 免疫作用的猪链球菌亚单位蛋白片段 ； 更优选地， 所述的猪链球菌抗原为灭活的猪链球菌 全菌或起免疫作用的猪链球菌亚单位蛋白片段 ； 进一步优选地， 所述灭活的猪链球菌全 菌为灭活的猪链球菌 2 型全菌， 所述起免疫作用的猪链球菌亚单位蛋白片段为猪链球菌 说 明 书 CN 104248761 A 3 2/14 页 4 38KDA 蛋白、 SaoA 蛋白或 38KDA 蛋白和 SaoA 蛋白的组合 ； 最优选地， 所述灭活的猪链球菌 2 型全菌为灭活的猪链球菌 2 型 SC 株全菌， 所述。
12、猪链球 38KDA 蛋白氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 3 所示， 所述猪链球菌 SaoA 蛋白氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 4 所示。 0008 本发明的猪链球菌抗原优选的全菌抗原还包括广东永顺生物制药股份有限公司 生产猪链球菌 2 型灭活疫苗所含的灭活的猪链球菌 2 型 HA9801 株全菌、 山东华宏生物工程 有限公司生产的猪链球菌病蜂胶灭活疫苗所含的猪链球菌 2 型 BHZZ-L4 株全菌、 武汉科前 动物生物制品有限责任公司生产的猪链球菌病灭活疫苗所含的猪链球菌 2 型 LT 株全菌以 及猪链球菌 7 型 YZ 株全菌。 0009 术语 “猪链球菌全菌抗原” 指猪链球菌。
13、病原的完整菌体。 0010 作为本发明的一种实施方式， 本发明的疫苗组合物由猪瘟病毒兔化弱毒株全病毒 抗原和灭活的猪链球菌 2 型 SC 株全菌抗原以及载剂组成。 0011 作为本发明的另外一种实施方式， 本发明的疫苗组合物由猪瘟病毒兔化弱毒株全 病毒抗原和猪链球菌 38KDA 蛋白、 SaoA 蛋白以及载剂组成。 0012 作为本发明的另外一种实施方式， 本发明的疫苗组合物由猪瘟病毒 E2 蛋白和灭 活的猪链球菌 2 型 SC 株全菌抗原以及载剂组成。 0013 作为本发明的另外一种实施方式， 本发明的疫苗组合物由猪瘟病毒 E2 蛋白和猪 链球菌 38KDA 蛋白、 SaoA 蛋白以及载剂组。
14、成。 0014 优选地， 所述猪链球 38KDA 蛋白氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 3 所示 ； 所述猪链球菌 SaoA 蛋白氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 4 所示 ； 所述猪瘟病毒 E2 蛋白氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 5 所示。 0015 优选地， 对于动物猪而言， 本发明疫苗组合物中猪瘟病毒兔化弱毒株全病毒含量 为 105.0 106.0TCID50/ 头份或猪瘟病毒亚单位抗原猪瘟病毒 E2 蛋白含量为 20-120g/ml ； 灭活的猪链球菌 2 型 SC 株全菌含量为 109 1010CFU/ml 或猪链球菌亚单位抗原猪链球菌 38KDA 蛋白含量为 10-。
15、100g/ml， 猪链球菌 SaoA 蛋白含量为 50-300g/ml。 0016 更优选地， 本发明疫苗组合物中猪瘟病毒兔化弱毒株全病毒含量为106.0TCID50/头 份或猪瘟病毒亚单位抗原猪瘟病毒 E2 蛋白含量为 50g/ml ； 灭活的猪链球菌 2 型 SC 株全 菌含量为 109CFU/mL 或猪链球菌亚单位抗原猪链球菌 38KDA 蛋白含量为 50g/ml， 猪链球 菌 SaoA 蛋白含量为 150g/ml。 0017 本发明的组合物的成分或组分的 “免疫量” 优选地是 “治疗有效量” 。所述 “治疗有 效量” 是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需。
16、量。 所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型， 待治疗的动物 的类型和年龄， 施用的方式， 以及组合物中的其它成分而变化。 0018 术语 “预防” 指通过其与猪瘟、 链球菌菌株相关的感染或疾病的症状被阻断或延 迟 ； 术语 “治疗” 指通过与猪瘟、 链球菌菌株相关的感染或疾病的症状被缓和或完全消除的 过程。 0019 术语 “亚临床感染猪链球菌” 又称 “猪链球菌亚临床感染” ， 指猪只体内携带有猪链 球菌病原， 与猪链球菌血清呈阳性反应， 但无典型临床症状， 表征健康 ； 主要定植部位为猪 的上呼吸道 ( 特别是扁桃体和鼻腔 )、 生殖道、 消化道， 无其他病原侵。
17、入自然状态下不会发 病。 说 明 书 CN 104248761 A 4 3/14 页 5 0020 术语 “兽医学上可接受的载剂” 包括任何及全部佐剂、 稳定剂及诸如此类。 0021 术语 “佐剂” 指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知 的佐剂包括， 但不限于 ： 油佐剂， 水溶性佐剂， 铝盐佐剂， 细胞因子佐剂。 0022 本发明所用术语 “油佐剂” 又称 “油性佐剂” 或 “油乳佐剂” ， 是由包括植物油、 动 物油、 矿物油中的一种或几种组成， 用于延缓免疫原在机体内的存留时间， 使之持续缓慢释 放， 增强巨噬细胞的吞噬与杀菌能力。 0023 本发明所用术语 “水溶。
18、性佐剂” 又称 “水基佐剂” 或 “水佐剂” ， 是一种聚合物水溶 性分散体， 用于提高水溶性疫苗的功效和安全性， 可以由高分子量聚丙烯酸类合成聚合物 组成。 0024 本发明所用术语 “铝盐佐剂” ， 又称 “铝胶佐剂” 或 “铝佐剂” ， 包括氢氧化铝佐剂和 磷酸铝佐剂， 其主要功能为缓释， 但同时具有对免疫细胞的激活作用。 将抗原和氢氧化铝或 磷酸铝混合注射， 能够使抗原保存在注射部位， 具有抗原缓释和非特异免疫刺激作用。 0025 本发明所用术语 “细胞因子佐剂” ， 包括 IL-1、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-10、 IL-12、 。
19、IL-15、 IL-18、 INF-、 GM-CSF、 TNF-、 TNF-、 TCA-3 等， 又称 “细胞因子” 或 “细胞素” ， 是活体宿主细胞分泌的通过扩散、 细胞间接触或血液循环到达宿主其他细胞， 在体液中以极低浓度发挥作用的一类非免疫球蛋白、 局部天然蛋白或糖蛋白， 也是一类由 机体活化的免疫细胞和某些非免疫细胞产生、 分泌， 能调节细胞生长、 分化， 与造血、 炎症反 应、 免疫应答反应和创伤愈合等密切相关的高活性多功能小分子蛋白的统称， 可以刺激或 抑制免疫功能， 在免疫应答中促进细胞发育分化、 调节细胞生理功能和细胞间信息传递， 在 免疫系统中起着非常重要的调控作用。 00。
20、26 适用于本发明的组合物的佐剂的量优选地是有效量。所述 “有效量” 是指佐剂在 同本发明抗原联合施用时在宿主中发挥它们的免疫学作用而言必须或足够的而不导致过 度副作用所必需量。 待施用的佐剂的精确的量将根据因素如所用的成分和治疗的疾病的类 型， 待治疗的动物的类型和年龄， 施用的方式， 以及组合物中的其它成分而变化。 0027 术语 “稳定剂” 指能增加溶液、 胶体、 固体、 混合物的稳定性能化学物， 它可以减慢 反应， 保持化学平衡， 降低表面张力， 防止光、 热分解或氧化分解等作用。 本发明所述的稳定 剂尤指耐热保护剂， 包括谷氨酸、 天冬氨酸、 苹果氨酸、 乳酸、 葡萄糖、 肌醇、 乳。
21、糖、 蔗糖、 棉籽 糖、 海藻糖、 山梨醇、 DL- 苏氨酸、 肌醇、 木糖醇、 精氨酸、 组氨酸、 白蛋白、 黏性蛋白、 明胶、 蛋 白胨、 可溶性淀粉、 糊精、 肉汁、 果胶、 阿拉伯胶、 羟甲基纤维素、 藻类、 脱脂牛奶、 血清等其中 的一种或几种。 0028 本发明的一目的在于提供一种疫苗组合物的制备方法， 其中， 所述方法包括 ： (1) 制备猪瘟病毒抗原、 猪链球菌抗原 ； (2) 将步骤 (1) 制备的猪瘟病毒抗原和猪链球菌抗原分 别加入载剂各自制备疫苗或按比例混合后加入载剂制备混合疫苗。 0029 优选地， 步骤 (2) 中将步骤 (1) 制备的猪瘟病毒抗原和猪链球菌抗原分别加。
22、入载 剂各自制备疫苗包括 ： 将猪瘟病毒抗原加入耐热保护剂制备冻干活疫苗， 以及灭活猪链球 菌抗原并加入佐剂制备灭活疫苗。 0030 优选地， 制备猪瘟病毒冻干活疫苗的猪瘟病毒抗原为减毒的猪瘟病毒全病毒， 制 备猪链球菌灭活疫苗的猪链球菌抗原为灭活的猪链球菌全菌 ； 更优选地， 减毒的猪瘟病毒 全病毒为猪瘟病毒乳化弱毒株， 灭活的猪链球菌全菌为灭活的猪链球菌 2 型全菌 ； 最优选 说 明 书 CN 104248761 A 5 4/14 页 6 地， 灭活的猪链球菌 2 型全菌为灭活的猪链球菌 2 型 SC 株全菌。 0031 优选地， 猪瘟病毒抗原加入的耐热保护剂为明胶与乳糖 ； 猪链球菌抗。
23、原加入的佐 剂为水溶性佐剂中的一种 gel 佐剂。 0032 优选地， 用所述猪链球菌灭活疫苗稀释猪瘟病毒活疫苗， 即得含有猪瘟病毒抗原、 猪链球菌抗原的二联疫苗组合物。 0033 优选地， 步骤 (2) 中将步骤 (1) 制备的猪瘟病毒抗原和猪链球菌抗原按比例混合 后加入载剂制备混合疫苗包括 ： 将猪瘟病毒抗原和猪链球菌抗原按比例混合， 加入耐热保 护剂制备冻干疫苗或加入佐剂制备灭活疫苗或亚单位疫苗。 0034 优选地， 制备冻干疫苗的猪瘟病毒抗原为减毒的猪瘟病毒全病毒， 猪链球菌抗原 为起免疫作用的猪链球菌亚单位蛋白片段 ； 更优选地， 减毒的猪瘟病毒全病毒为猪瘟病毒 乳化弱毒株， 起免疫。
24、作用的猪链球菌亚单位蛋白片段为猪链球菌 38KDA 蛋白、 SaoA 蛋白或 38KDA 蛋白和 SaoA 蛋白的组合 ； 最优选地， 猪链球 38KDA 蛋白氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 3 所 示， 猪链球菌 SaoA 蛋白氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 4 所示。 0035 优选地， 制备灭活疫苗的猪瘟病毒抗原为起免疫作用的猪瘟病毒亚单位蛋白片 段， 猪链球菌抗原为灭活的猪链球菌全菌 ； 更优选地， 起免疫作用的猪瘟病毒亚单位蛋白片 段为猪瘟病毒E2蛋白， 灭活的猪链球菌全菌为灭活的猪链球菌2型全菌 ； 最优选地， 猪瘟病 毒 E2 蛋白氨基酸序列如 SEQ ID NO ：。
25、 5 所示， 灭活的猪链球菌 2 型全菌为灭活的猪链球菌 2 型 SC 株全菌。 0036 优选地， 制备亚单位疫苗的猪瘟病毒抗原为起免疫作用的猪瘟病毒亚单位蛋白片 段， 猪链球菌抗原为起免疫作用的猪链球菌亚单位蛋白片段 ； 更优选地， 起免疫作用的猪瘟 病毒亚单位蛋白片段为猪瘟病毒 E2 蛋白， 起免疫作用的猪链球菌亚单位蛋白片段为猪链 球菌 38KDA 蛋白、 SaoA 蛋白或 38KDA 蛋白和 SaoA 蛋白的组合 ； 最优选地， 猪瘟病毒 E2 蛋白 氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 5 所示， 猪链球 38KDA 蛋白氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 3 所示， 猪链 球菌。
26、 SaoA 蛋白氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 4 所示。 0037 起免疫作用的亚单位蛋白片段的制备可以通过本领域技术人员已知的多种方法 进行， 包括基因工程手段， 例如通过包含本发明多核苷酸的克隆或表达载体。 术语 “载体” 涉 及被设计用于转导/转染一种或多种细胞类型的多核苷酸构建体。 载体可以是， 例如 “克隆 载体” ， 其被设计用于分离、 增殖和复制插入的核苷酸 ；“表达载体” ， 其被设计用于在宿主细 胞中表达核苷酸序列 ； 或 “病毒载体” ， 其被设计用于生产重组病毒或病毒样颗粒 ； 或 “穿梭 载体” ， 其包含不只一种类型的载体的性质。适合制备本发明猪瘟病毒、 猪链。
27、球菌亚单位蛋 白片段的公众可获得的载体包括质粒、 腺病毒、 杆状病毒、 酵母杆状病毒、 植物病毒、 腺伴随 病毒、 反转录病毒、 单纯疱疹病毒、 病毒、 慢病毒等， 还可以获得构建这样的载体的方法。 本发明猪瘟病毒、 猪链球菌亚单位蛋白片段的制备还包括通过人工合成的方式来实现。 0038 优选地， 加入的耐热保护剂为明胶与乳糖。 0039 优选地， 加入的佐剂为水溶性佐剂中的一种 gel 佐剂。 0040 本发明的另一个目的是提供一种疫苗组合物在制备预防和 / 或治疗亚临床感染 猪链球菌猪只猪瘟疫苗免疫失败的药物中的应用以及在制备预防和 / 或治疗猪瘟病毒、 猪 链球菌相关疾病或感染的药物中的。
28、而应用。 0041 本发明具有以下突出优点 ： 说 明 书 CN 104248761 A 6 5/14 页 7 0042 (1) 本发明首次找到了一种猪瘟疫苗免疫失败的原因猪链球菌亚临床感染， 利用本发明疫苗组合物进行免疫， 可以解决猪瘟疫苗免疫失败的问题 ； 0043 (2)本发明疫苗组合物包含的猪链球菌38KDA蛋白和SaoA蛋白组合可诱导产生协 同作用的免疫效果 ； 0044 (3) 含有两种或两种以上抗原、 可以预防两种或两种以上疾病的联合疫苗以其方 便、 多效、 低成本成为新一代疫苗研究的特点 ； 与单一疫苗相比， 联合疫苗可以减少疫苗的 接种次数， 避免因漏种而不能得到全程免疫 ；。
29、 另外， 疫苗大多不耐热， 其生产、 运输、 储存乃 至全部使用过程均需在较低温度下进行， 即所谓的 “冷链” ， 这种环环相扣的冷链运作， 费用 极高， 使疫苗成本居高不下， 而使用联合疫苗， 则可以大大降低冷链运作的费用， 因此具有 显著的优越性 ； 0045 (4) 本发明的疫苗组合物意外地发现， 能增强猪瘟病毒抗原的免疫应答， 而且如本 发明后续实施例所证明的， 在猪链球菌亚临床感染的猪只免疫猪瘟疫苗失败的情况下， 本 发明疫苗组合物能产生很好的免疫反应， 而这出乎本领域普通技术人员预料的。 具体实施方式 0046 下面结合具体实施例来进一步描述本发明， 本发明的优点和特点将会随着描述。
30、更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的， 并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是， 在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换， 但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 0047 本发明实施例中所用 PBS 缓冲液如无特别说明， 均采用 pH7.4 的 PBS， 配制方法 ： NaCl8.0g， KCl0.2g， KH2PO40.24g， Na2HPO412H2O3.628g， 溶于 800ml 蒸馏水中， 用盐酸调 pH 值为 7.4， 蒸馏水定容至 1000ml， 121高压灭菌 20min， 室温保存。 0048 本发明所涉及的猪。
31、瘟病毒兔化弱毒株购自北京市海淀区中关村南大街 8 号， 由中 国兽医药品监察所保藏， 保藏号 AV1412 ； 猪链球菌 2 型 SC 株， 由普莱柯生物工程股份有限 公司分离， 保藏于中国典型培养物保藏中心保藏 (CCTCC)， 编号为 CCTCCM2011351， 地址为 湖北省武汉市武昌区珞珈山路 16 号武汉大学， 保藏日期为 2011 年 10 月 12 日 ； 猪链球菌 2 型 CVCC606 菌株购自中国北京中国兽医药品监察所 ； 猪瘟病毒强毒石门系毒株购自中国兽 医药品监察所。 0049 实施例 1 0050 猪瘟、 猪链球菌抗原的制备 0051 1 猪瘟抗原的制备 0052 。
32、1.1 将长成良好单层的对猪瘟病毒兔化弱毒株高敏感的 ST 细胞 ( 购自 ATCC) 用 含 0.125胰酶和 0.03 EDTA 的消化液 , 进行消化分散， 细胞计数后接种细胞培养瓶， 加 入 3犊牛血清的 MEM 细胞培养液， 同时按照 M.O.I. 0.1 接毒剂量加入种毒 , 置于 37 温箱中进行培养。 0053 培养三天后进行第一次收毒， 收毒后补加含 1.5犊牛血清的细胞维持液， 以后每 隔 2 天收毒一次， 可连续收毒 5 次。收毒后将抗原混合置于 -20储藏。 0054 1.2 猪瘟病毒含量测定 ： 各收次病毒培养液分别采用间接免疫荧光法进行 TCID50 测定。每 ml。
33、 病毒含量为 106.5TCID50。 说 明 书 CN 104248761 A 7 6/14 页 8 0055 2 猪链球菌抗原的制备 0056 2.1 一级种子的繁殖 0057 将猪链球菌 2 型 SC 株冻干菌种用缓冲马丁肉汤稀释， 分别划线接种于 Clumbia 羊血琼脂 ( 法国梅里亚公司 )， 37培养 24h， 选择有明显溶血环、 光滑、 稍大的菌落接种于 Clumbia 羊血琼脂 ( 法国梅里亚公司 ) 斜面， 37培养 18 24h 作为一级种子。 0058 2.2 二级种子的繁殖 0059 用少量缓冲马丁肉汤冲洗一级种子的血琼脂斜面培养物， 接种于含 1.5 (v/v) 犊。
34、牛血清的缓冲马丁肉汤， 同时加入 0.2葡萄糖 ( 制成 50溶液灭菌后按比例加入 )， 37静置培养 16 18h， 经检验纯粹后即为二级种子。 0060 缓冲马丁肉汤的配制 ： 将蛋白胨 20g， 氯化钠 2g 加入 1000ml 牛肉汤中， 加热至 80 90， 用氢氧化钠调整 pH 值为 7.2， 再缓缓加入磷酸氢二钠 1g， 碳酸氢钠 2g， 煮沸 90 分钟， 静置 2 8h， 吸取上清液， 116高压灭菌 40 分钟， 灭菌后 pH 值为 7.6 8.0。将葡 萄糖配成 50溶液， 116高压灭菌 30 分钟， 在接种时加入。 0061 2.3 制苗用菌液的制备 0062 将缓冲。
35、马丁肉汤预热至 37左右， 按 10 20接种二级种子液， 37静置培养 16 18h， 培养期间振摇 2 3 次， 收获菌液做纯粹检验后， 置 2 8保存备用。 0063 2.4 抗原制备 0064 将培养液用密理博 (Millipore 公司 ) 膜包 ( 分子截留量为 1000Kda 道尔顿 ) 进 行浓缩， 按 中华人民共和国兽药典 (2005 年版 ) 附录方法进行活菌计数， 并灭活。制备的 猪链球菌 2 型 SC 株抗原含量为灭活前 1011CFU/ml。 0065 3 猪链球菌亚单位抗原的制备 0066 3.1 材料 0067 本发明采用的 pMD18-T 载体购自宝生物工程 (。
36、 大连 ) 有限公司， 大肠杆菌 DH5 感受态购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司。 0068 大肠杆菌培养基 :LB 液体培养液及固体培养基 ( 每升含酵母提取物 5g， 胰蛋白胨 10g， NaCl10g， 用 10mol/LNaOH 调 pH 至 7.5， 121高压灭菌 20min， 4保存备用。在每 100 毫升LB液体培养基中加入1.5g琼脂即为固体LB培养基， 121高压灭菌20min， 4保存备 用 )。 0069 引物设计与合成 ： 0070 根 据 SEQ ID NO.1 所 示 的 38KDA 基 因 序 列，设 计 上 游 引 引 物 CGGGATCCCGATGGA。
37、TATTAGACAGGTTAGA 与 下 游 引 物 GCTGCAGCTTAGTTCTTAAAGCTATGA 扩 增 38KDA 基因。引物由上海生工生物工程有限公司合成。 0071 根据 SEQ ID NO.2 所示的 SaoA 基因序列， 设计上游引物 AAAGGATCCGCAACCTGATGGGGGAC 与下游引物 GGGCTGCAGTCATTACATTGCTTCCTTA 扩增 SaoA 基 因。引物由上海生工生物工程有限公司合成。 0072 3.2 抗原蛋白制备 0073 将猪链球菌2型菌种CVCC606株接种于含有10灭活新生牛血清的TSA固体培养 基 ( 购自 Sigma 公司 )。
38、 上， 挑取单个菌落接种于 TSB 液体培养基 ( 购自 Sigma 公司 ) 中， 置 于摇床中 (150r/min)， 37震荡培养过夜。 说 明 书 CN 104248761 A 8 7/14 页 9 0074 遵照 TIANGEN 细菌基因组提取试剂盒 ( 购自武汉大风生物技术有限公司 ) 说明书 提供的操作方法提取基因组 DNA。 0075 PCR 反应体系见表 1。 0076 表 1 PCR 反应体系 0077 基因组模板3l 10XPCR Buffer(Mg2+plus)5l 上、 下游引物 (50pmol/l)2X0.5l Taq 酶2l 灭菌去离子水35l 2.5mmol/L。
39、 dNTP Mixture4l 0078 反应程序为 :94预变性 5min ； 94 1min ； 52、 30sec,72、 1min， 30 个循环 ； 延 伸 72 10min。 0079 PCR 产物回收 : 采用上海生工生物工程技术有限公司的 UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收 试剂盒回收 DNA 片段， 按照 UNIQ-10 柱式离心式 DNA 凝胶回收试剂盒的说明书的步骤进行。 0080 抗原基因的 TA 克隆 ： 分别将目的基因 38KDA 蛋白、 SaoA 蛋白的 PCR 回收产物和载 体pMD18-T于16水浴过夜进行连接反应， 转化DH5感受态细胞， 37在含有氨苄青。
40、霉素 (AMP， 50g/mL) 的 LB 固体培养基上培养， 从中随机挑选多个单菌落， 分别放入含有氨苄青 霉素(AMP， 50g/mL)的LB液体培养基中37培养12小时后从中提取质粒， 经酶切鉴定后 筛选得到阳性重组质粒， 将其分别命名为 pMD-38KDA 和 pMD-SaoA。 0081 重组质粒的双酶切鉴定 : 利用 BamHI 和 PstI 分别酶切 pMD-38KDA 和 pMD-SaoA 表 达质粒， 酶切后出现预期大小的目的片段和载体片断即为正确的重组质粒。 0082 重组表达菌株的构建 : 分别回收上述步骤酶切产物 38KDA 和 SaoA， 并分别与 pQE30(Bam。
41、HI 和 PstI 酶切线性化 ) 于 16水浴连接过夜。连接产物转化 JM109 感受态 细胞， 于 37在 LB 固体培养基上培养， 从中随机挑选多个单菌落， 分别放入 LB 液体培养 基中 37培养 12h 后从中提取质粒， 经酶切鉴定后筛选得到阳性重组质粒， 并分别命名为 pQE30-38KDA 和 pQE30-SaoA。 0083 目的基因的诱导表达 : 将含重组质粒 pQE30-38KDA 和 pQE30-SaoA 的表达菌株 接种于含有 25g/ml Kna 的 3ml LB 液体培养基， 于 37摇床培养。从培养好的菌液中取 100l 接种于 10mL 含有 25g/ml Kn。
42、a 的新鲜 LB 液体培养基中， 于 37振荡培养约 3h， 至 OD600达到 0.6-1.0 时， 加 IPTG 至终浓度为 0.8mmol/l， 继续培养 3h 后收集菌体。 0084 将诱导后的重组大肠杆菌于 8000r/min 离心 15min。沉淀用 1/10 体积的 50mMTris-Cl(pH5.0)重悬， 并加入溶菌酶至终浓度lmg/ml， 冰浴30min。 冰浴条件下进行超 声碎破， 直至菌液不再粘稠， 10000r/min， 离心 30min。收集蛋白。用 Bradford 蛋白测定法 测量蛋白浓度， 并分别将用 PH 为 7.4 的 PBS 溶液调整为 1mg/ml。 。
43、说 明 书 CN 104248761 A 9 8/14 页 10 0085 实施例 2 0086 猪瘟、 猪链球菌疫苗组合物的制备 0087 1 灭活疫苗稀释活疫苗联合使用形式 0088 1.1 取实施例 1 制备的猪瘟全病毒抗原， 加入耐热保护剂 (2wt明胶水溶液与 15wt乳糖水溶液以 1:1(v/v) 比例配制 ) 以 1:1(v/v) 比例混合后充分混匀， 定量分装， 迅 速进行冷冻真空干燥， 即为猪瘟活疫苗。 0089 1.2取实施例1制备的猪链球菌全菌抗原， 缓缓加入到水溶性佐剂gel佐剂(法国 赛比克公司 ) 中， 加的过程中不断用转速为 800rpm 乳化机搅拌 12min，。
44、 混匀， 4保存， 即为 猪链球菌灭活疫苗。 0090 1.3 使用时， 用猪链球菌灭活疫苗稀释猪瘟活疫苗， 疫苗具体配比如表 2。 0091 表 2 猪瘟、 猪链球菌疫苗组合物的成分配比 0092 0093 0094 2 猪链球菌亚单位抗原与猪瘟抗原联合制备冻干疫苗 0095 取实施例 1 制备的猪瘟全病毒抗原同猪链球菌 38KDA 蛋白及 SaoA 蛋白抗原按比 例混合， 加入耐热保护剂 (2wt明胶水溶液与 15wt乳糖水溶液以 1:1(v/v) 比例配制 ) 以 1:1(v/v) 比例混合后充分混匀， 定量分装， 迅速进行冷冻真空干燥， 即为猪瘟、 猪链球菌 二联冻干疫苗组合物。具体配。
45、比见表 3。 0096 表 3 猪瘟、 猪链球菌冻干疫苗组合物的成分配比 0097 0098 实施例 3 0099 猪瘟、 猪链球菌疫苗组合物的免疫原性试验 0100 1 仔猪的免疫程序 0101 将 25-30 日龄猪瘟、 猪链球菌抗原抗体阴性的仔猪 170 头， 试验分 17 组， 第 1-2 组 为疫苗 1 免疫组， 第 3-4 组为疫苗 2 免疫组， 第 5-6 组为疫苗 3 免疫组， 第 7-8 组为疫苗 4 免疫组， 第 9-10 组为疫苗 5 免疫组， 第 11-12 组为疫苗 6 免疫组， 第 13-14 组为疫苗 7 免疫 组， 第 15-17 组为 PBS 对照组。PBS 。
46、对照组每头猪注射 1ml 配比 10 (V/V)gel 佐剂的 PBS， 疫苗免疫组每只猪颈部肌肉注射疫苗 1ml， 单次免疫。 0102 2 免疫仔猪攻毒保护试验 0103 免疫后 21 天， 对第 1 组、 第 3 组、 第 5 组、 第 7 组、 第 9 组、 第 11 组、 第 13 组、 第 15 说 明 书 CN 104248761 A 10 9/14 页 11 组分别用猪瘟病毒强毒石门系毒株肌肉注射 1ml(105MLD)， 观察 14 天， 免疫组全部保护， 第 15 组全部发病。对第 2 组、 第 4 组、 第 6 组、 第 8 组、 第 10 组、 第 12 组、 第 14。
47、 组、 第 16 组分 别使用猪链球菌2型强毒株SC株进行腹腔注射攻毒， 攻毒剂量为5108CFU， 攻毒后观察10 天， 每天固定时间观察临床状况。 每天的临床评分为每只动物的姿势和运动性评分的总和， 其基于神经、 肌骨骼或呼吸系统疾病的指标如下 ： 0104 姿势 ： 0105 0 正常的姿势和对刺激反应 0106 1 不活跃并且反应缓慢 ； 眼鼻有分泌物 0107 2 仅对重复的刺激有反应， 情感淡漠 0108 3 不活动， 无反应， 对环境没有意识 0109 4 死亡 0110 运动性 ： 0111 0 正常步态和体位 0112 1 轻微失调， 跛， 和 / 或关节肿胀， 但是没有辅助。
48、可以站起 0113 2 明显不协调或跛， 但是没有辅助可以站起 0114 3 严重的跛、 失调， 不能保持站立 0115 4 死亡 0116 结果在该攻毒剂量下第 16 组仔猪攻毒后 24 小时后开始出现临床症状， 表现为体 温骤然持续升高， 跛行、 趴卧、 发颤、 不进食、 四肢划水并于攻毒后 5 天内全部死亡 ； 免疫组 2 和免疫组 4 全部保护 ； 免疫组 6 死亡 1 头， 9 头保护并无明显临床症状 ； 免疫组 8 和免疫组 10 各死亡 1 头， 其余保护并无明显临床症状 ； 免疫组 12 死亡 3 头， 其余存活， 其中 2 头出现 短暂临床体征并在 36 小时后逐渐恢复正常 ； 免疫组 14 死亡 2 头， 其余存活， 其中 2 头出现 短暂临床体征并在36小时后逐渐恢复正常。 第17组PBS对照组存活， 无异常现象发生。 具 体结果见表 4。 0117 表 4 免疫仔猪攻毒保护结果 0118 0119 说 明 书 CN 104248761 A 11 10/14 页 12 0120 对于动物进行判断， 评估疾病的临床体征是在不清楚所有个体免疫情况下进行 得， 临床评分结果见表 5。临床评分通过对疾病指标的测定并结合死亡率和发病率， 使用 Mann-Whitney 。