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1、(10)申请公布号 CN 104255705 A (43)申请公布日 2015.01.07 CN 104255705 A (21)申请号 201410449109.3 (22)申请日 2014.09.04 A01N 3/00(2006.01) A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院作物科学研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12 号 (72)发明人 张金梅 陈晓玲 韩丽 卢新雄 辛霞 尹广鹍 何娟娟 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王文君 (54) 发明名称 一种克服菊芋茎尖超低温保存后再生苗玻璃 化的方。
2、法 (57) 摘要 本发明提供一种克服菊芋茎尖超低温保存后 再生苗玻璃化的方法， 在预培养阶段、 装载阶段、 PVS2 玻璃化保护阶段、 洗涤卸载阶段所使用的试 剂中， 均用果糖代替蔗糖， 进行超低温保存处理。 本发明的方法可有效地防止超低温保存后菊芋茎 尖再生后玻璃化现象的发生， 植株不经愈伤直接 再生率可达 40以上， 易于操作， 适用于菊芋茎 尖的超低温保存。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104255705 A CN 1。
3、04255705 A 1/1 页 2 1. 一种克服菊芋茎尖超低温保存后再生苗玻璃化的方法， 其特征在于， 包括以下步 骤 ： 1) 预培养 ： 切取菊芋组培苗茎尖， 在含有 0.3-0.4mol/L 果糖的 MS 液体培养基中， 25 暗培养 2-3 天 ； 2) 装载 ： 预培养后的茎尖在含有 2.0mol/L 甘油和 0.4mol/L 果糖的 MS 液体培养基中 25装载 30-40min ； 3)PVS2玻璃化保护剂处理 ： 装载后的茎尖转入改良的PVS2玻璃化保护剂中0脱水处 理 15-40min ； 4) 小滴玻璃化法超低温保存 ： 步骤 3) 处理后的茎尖置于铝箔条上， 向茎尖上。
4、滴加改 良的 PVS2 玻璃化保护剂， 使茎尖完全包裹于由保护剂形成的液滴中， 将铝箔条置于冻存管 中， 然后投入液氮中保存 ； 5)解冻和洗涤 ： 从液氮中取出冻存管， 将铝箔条上的茎尖浸入含有1.2mol/L果糖的MS 培养液中室温解冻和洗涤 ； 6) 步骤 5) 处理后茎尖转入恢复培养基中恢复培养 ； 其中， 步骤 3) 和 4) 中所述改良的 PVS2 玻璃化保护剂为含有 30甘油、 15二甲基亚 砜、 15乙二醇和 0.4mol/L 果糖的 MS 液体培养基。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 步骤 1) 具体为 ： 取 4-5 周苗龄的菊芋组 培苗， 逐层剥去外层。
5、叶片， 至剩余1-2片叶原基包围茎尖分生组织， 切取1.5-2mm的茎尖， 在 含有 0.4mol/L 果糖的 MS 液体培养基中， 60rpm， 25暗培养 2-3 天。 3. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 步骤 5) 中共洗涤 2 次， 每次 10min， 用含 有 1.2mol/L 果糖的 MS 培养液进行洗涤。 4. 根据权利要求 1-3 任一项所述的方法， 其特征在于， 步骤 6) 中所述恢复培养基为 MS+0.1mg/L GA3+15g/L 蔗糖， 培养条件为 ： 于 25培养箱中暗培养 3-5 天后， 转入正常光照 条件下进行培养。 权 利 要 求 书 CN 10。
6、4255705 A 2 1/5 页 3 一种克服菊芋茎尖超低温保存后再生苗玻璃化的方法 技术领域 0001 本发明涉及植物种质资源的小滴玻璃化法超低温保存技术， 具体地说， 涉及一种 克服菊芋茎尖超低温保存后再生苗玻璃化的方法。 背景技术 0002 菊芋(Helianthus tuberous L.)为菊科向日葵属多年生草本植物， 是一种生态经 济型植物， 具有很高的经济价值、 药用价值、 观赏价值和生态价值。 因其地上似菊， 地下似芋 而得名。 原产北美洲， 在美国、 加拿大、 墨西哥等国广泛分布。 17世纪经欧洲传入我国， 在我 国东北三省、 内蒙古、 河北、 河南等省均有分布。菊芋为无性。
7、繁殖作物， 其繁殖能力很强， 地 下块茎以每年 20 倍以上的速度繁殖， 我国西北地区菊芋已形成规模化生产。菊芋生态适应 性很广， 有很强的抗逆性。耐寒、 耐旱、 耐盐碱、 防风治沙。菊芋块根中含有丰富的菊粉， 菊 粉在食品中广泛应用， 可作为甜味增味剂， 也是生产果糖的原料。 菊芋被联合国粮农组织称 为 “21 世纪人畜共用作物” 。利用菊芋块茎转化成乙醇和生物燃料等生物能源可应用在化 工、 生物制药、 航天等领域。 0003 植物种质资源的非原生境保存分为田间保存、 试管苗保存和超低温保存。菊芋种 质资源目前采用非原生境保存中的田间保存和试管苗保存。 由于菊芋地下块茎容易受到病 毒的侵害，。
8、 使病毒大量积累， 导致品种退化， 产量降低， 而城市土地开发、 环境恶化也严重威 胁菊芋种质资源的安全保存。试管苗保存虽然具有占地面积小、 不易受自然灾害和病原菌 影响以及人力、 财力投入少， 便于种质资源交换及运输等优点， 但需要经常继代更新， 且经 多次继代培养后面临发生退化现象或产生变异等威胁。现已证明， 植物组织材料经一系列 的超低温保存步骤后， 投入液氮保存 ( 气相液氮或液相液氮条件下 )， 经化冻后仍能在一定 培养条件下再生出新的植株， 并保持其遗传稳定性。它避免了田间保存易受自然灾害影响 而导致种质丢失或毁灭， 以及试管苗组织培养保存中因多次继代引起遗传性状变异或污染 的危险。
9、。 0004 茎尖超低温保存方法成功标准在于， 经一系列超低温保存处理后， 化冻后的茎尖 在适宜条件下再生恢复培养后， 需要直接成功再生成正常苗。然而经超低温保存后再生恢 复培养阶段， 容易出现玻璃化现象， 出现玻璃化现象的茎尖即使膨大也不易形成再生苗， 再 生苗也容易死亡。玻璃化现象是指再生的苗成半透明状， 叶片呈浅绿色或黄绿色、 叶片肥 厚， 易发生畸形、 卷曲或皱缩， 叶片脆弱易碎。从解剖学上看， 叶片无功能性气孔， 由于保卫 细胞的功能性失调不能关闭气孔， 玻璃化的叶片不具有栅栏组织， 只有海绵组织。 由于玻璃 化的植株呼吸和光合作用功能不健全， 玻璃化苗的分化能力低下， 难以继代培养。
10、繁殖， 更难 以移栽成活。 0005 超低温保存后玻璃化苗的产生与很多因素有关， 与组织培养中试管苗的玻璃化现 象相比， 影响因素更为复杂， 可能涉及超低温保存过程中的各个关键步骤， 也可能涉及再生 恢复培养过程中的培养基和培养环境条件， 如水分、 光照、 营养条件、 激素水平等。 超低温保 存过程涉及多个关键步骤， 如预培养、 装载、 PVS2 玻璃化保护、 化冻、 洗涤等， 茎尖等材料在 说 明 书 CN 104255705 A 3 2/5 页 4 超低温保存过程中可能受到不同程度的渗透、 脱水、 化学毒害等胁迫， 造成部分细胞失去活 力或者受到不同程度的伤害。 若经化冻、 洗涤和再生培养。
11、后， 一些关键细胞的伤害得到了修 复， 则有利于茎尖再生成苗。反之， 则有可能发生玻璃化或形成愈伤等现象， 不利于茎尖的 成功再生。 0006 菊芋茎尖按常规方法超低温保存后， 出现了严重的玻璃化现象。过去文献报道的 克服玻璃化现象的研究， 多集中于克服或消除组织培养过程中的试管苗的玻璃化现象， 对 克服超低温保存后的玻璃化现象研究较少。 克服超低温保存后的玻璃化现象是解决超低温 保存成功的关键环节之一。 发明内容 0007 本发明的目的是提供一种克服菊芋茎尖超低温保存后再生苗玻璃化的方法。 0008 为了实现本发明目的， 本发明的一种克服菊芋茎尖超低温保存后再生苗玻璃化的 方法， 所述方法包。
12、括以下步骤 ： 0009 1) 预培养 ： 切取菊芋组培苗茎尖， 在含有 0.3-0.4mol/L 果糖的 MS 液体培养基中， 25暗培养 2-3 天 ； 0010 2) 装载 ： 预培养后的茎尖在含有 2.0mol/L 甘油和 0.4mol/L 果糖的 MS 液体培养 基中 25装载 30-40min ； 0011 3)PVS2玻璃化保护剂处理 ： 装载后的茎尖转入改良的PVS2玻璃化保护剂中0脱 水处理 15-40min ； 0012 4) 小滴玻璃化法超低温保存 ： 步骤 3) 处理后的茎尖置于铝箔条上， 向茎尖上滴加 改良的 PVS2 玻璃化保护剂， 使茎尖完全包裹于由保护剂形成的液。
13、滴中， 将铝箔条置于冻存 管中， 然后投入液氮中保存 ； 0013 5) 解冻和洗涤 ： 从液氮中取出冻存管， 将铝箔条上的茎尖浸入含有 1.2mol/L 果糖 的 MS 培养液中室温解冻和洗涤 ； 0014 6) 步骤 5) 处理后茎尖转入恢复培养基中恢复培养。 0015 其中， 步骤 3) 和 4) 中所述改良的 PVS2 玻璃化保护剂为含有 30甘油、 15二甲 基亚砜、 15乙二醇和 0.4mol/L 果糖的 MS 液体培养基。 0016 前述的方法， 步骤 1) 具体为 ： 取 4-5 周苗龄的菊芋组培苗， 逐层剥去外层叶片， 至 剩余 1-2 片叶原基包围茎尖分生组织， 切取 1.。
14、5-2mm 的茎尖， 在含有 0.4mol/L 果糖的 MS 液 体培养基中， 60rpm， 25暗培养 2-3 天。 0017 前述的方法， 步骤 5) 中共洗涤 2 次， 每次 10min， 用含有 1.2mol/L 果糖的 MS 培养 液进行洗涤。 0018 前述的方法， 步骤 6) 中所述恢复培养基为 MS+0.1mg/LGA3+15g/L 蔗糖， 培养条件 为 ： 于 25培养箱中暗培养 3-5 天后， 转入正常光照条件下进行培养。 0019 采用本发明提供的方法进行菊芋茎尖保存和再培养， 有效避免了玻璃化现象的发 生， 植株不经愈伤直接再生率可达 40以上。本发明提供的方法成本低廉。
15、、 操作简便， 是克 服菊芋茎尖超低温保存后再生苗玻璃化的一条有效途径。 附图说明 说 明 书 CN 104255705 A 4 3/5 页 5 0020 图 1 为本发明实施例 1 中菊芋试管苗照片。 0021 图 2 为本发明实施例 1 中菊芋茎尖照片。 0022 图 3 为本发明实施例 1 中超低温保存后发生玻璃化现象的照片。 0023 图 4 为本发明实施例 2 中超低温保存后不经愈伤直接再生成苗的照片。 具体实施方式 0024 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 若未特别指明， 实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段， 所用原料均为市售商品。 0。
16、025 MS 液体培养基 ： 蔗糖 30 克， MS 培养基粉 4.43 克 ( 购于北京西美杰科技有限公司， 型号 M519)， pH5.8， 定容至 1L。 0026 含 0.4mol/L 果糖的 MS 液体培养基 ： 果糖 13.25 克， MS 培养基粉 4.43 克 ( 购于北 京西美杰科技有限公司， 型号 M519)， pH5.8， 定容至 1L。 0027 MS固体培养基 ： MS培养基粉4.43克(购于北京西美杰科技有限公司， 型号M519)， 添加蔗糖 30 克， 添加琼脂 8.00g( 购于黑龙江省哈尔滨市南岗区雨林科技用品商行 )， pH5.8， 定容至 1L。 0028。
17、 菊芋组培苗 ： 经中国农业科学院作物科学研究所沿海地区考察收集， 在浙江省杭 州市萧山区围垦 20 工段采集的菊芋块茎， 经种植后、 消毒灭菌， 利用其茎尖培养发育成的 试管苗， 入国家种质库试管苗库保存， 种质编号为 2009331028。 0029 实施例 1 菊芋茎尖超低温保存玻璃化现象发生 0030 一、 相关试剂的配方 0031 预培养液 ： 含 0.4mol/L 蔗糖的 MS 液体培养基。 0032 装载液 ： 含 2.0mol/L 甘油和 0.4mol/L 蔗糖的 MS 液体培养基。 0033 PVS2 玻璃化保护剂的制备方法 ： 将 3.26mol 甘油、 2.42mol 乙。
18、二醇、 1.9mol 二甲基 亚砜和 0.4mol 蔗糖与 MS 液体培养基充分混匀至 1L。 0034 卸载液 ： 含 1.20mol/L 蔗糖的 MS 液体培养基。 0035 二、 菊芋茎尖的超低温保存 0036 取4-5周苗龄的菊芋组培苗(图1)， 逐层剥去外层叶片， 至剩余1-2片叶原基包围 茎尖分生组织， 切取 1.5-2mm 的茎尖 ( 图 2)， 先浸泡在预培养液中 25暗培养 3 天 ( 转速 为 60rpm)， 然后在装载液中 25浸泡 30min( 正常光照 )， 最后在 PVS2 玻璃化保护剂 0脱 水处理 15min( 正常光照 )。将经 PVS2 脱水处理后的茎尖置于。
19、铝箔条 (5mm20mm) 上， 向 茎尖上滴加 PVS2 溶液， 使茎尖完全包裹于 PVS2 溶液小滴中 ( 每条铝箔条上滴加 4 滴 PVS2 玻璃化保护剂， 每滴 16 微升， 容纳 5 个茎尖 )， 最后将铝箔条转移至充满液氮的冻存管中， 投入液氮保存。从液氮中取出冻存管， 将铝箔条放入 1.20mol/L 蔗糖的 MS 卸载液中室温 化冻 20min， 每 10min 换一次新的洗涤液， 然后将茎尖转移到装有恢复培养基 (MS+0.1mg/L GA3+15g/L 蔗糖 ) 的培养皿中， 置于 25培养箱中暗培养 3-5 天后再转入正常光照条件下 进行培养。 0037 三、 存活率、 。
20、再生率统计 0038 恢复培养一周后统计存活率 ( 存活植株数量 茎尖数量 100 )， 两周后统计 再生率 ( 再生植株数量 茎尖数量 100 )。 说 明 书 CN 104255705 A 5 4/5 页 6 0039 三次重复实验存活率分别为 92.31、 92.86、 92.86， 平均存活率为 92.67 ； 三次重复实验再生率分别为 69.23、 92.86、 85.71， 平均再生率为 82.60。虽然存活 率和再生率较高， 但超低温保存后再生苗发生严重的玻璃化现象 ( 图 3)。 0040 实施例 2 菊芋茎尖超低温保存玻璃化现象的克服 0041 一、 相关试剂的配方 0042。
21、 含果糖的预培养液 ： 含 0.4mol/L 果糖的 MS 液体培养基 ( 用果糖替代蔗糖 )。 0043 含甘露醇的预培养液 ： 含 0.4mol/L 甘露醇的 MS 液体培养基 ( 用甘露醇替代蔗 糖 )。 0044 含果糖的装载液 ： 含 2.0mol/L 甘油和 0.4mol/L 果糖的 MS 液体培养基 ( 用果糖替 代蔗糖 )。 0045 含甘露醇的装载液 ： 含 2.0mol/L 甘油和 0.4mol/L 甘露醇的 MS 液体培养基 ( 用甘 露醇替代蔗糖 )。 0046 含果糖的玻璃化保护剂的制备方法 ： 将 3.26mol 甘油、 2.42mol 乙二醇、 1.9mol 二 。
22、甲基亚砜和 0.4mol 果糖与 MS 液体培养基充分混匀至 1L( 用果糖替代蔗糖 )。 0047 含甘露醇的玻璃化保护剂的制备方法 ： 将 3.26mol 甘油、 2.42mol 乙二醇、 1.9mol 二甲基亚砜和 0.4mol 甘露醇与 MS 液体培养基充分混匀至 1L( 用甘露醇替代蔗糖 )。 0048 含果糖的卸载液 ： 含 1.2mol/L 果糖的 MS 液体培养基 ( 用果糖替代蔗糖 )。 0049 含甘露醇的卸载液 ： 含 1.2mol/L 甘露醇的 MS 液体培养基 ( 用甘露醇替代蔗糖 )。 0050 二、 菊芋茎尖的超低温保存 0051 方案 1 ： 超低温保存流程与实。
23、施例 1 相同， 所有技术步骤用含果糖的试剂替代蔗糖 的试剂。 0052 方案 2 ： 超低温保存流程与实施例 1 相同， 预培养液用含果糖的试剂替代， 其他技 术步骤所用试剂仍为含有蔗糖的试剂。 0053 方案 3 ： 超低温保存流程与实施例 1 相同， 所有技术步骤用含甘露醇的试剂替代蔗 糖的试剂。 0054 方案 4 ： 超低温保存流程与实施例 1 相同， 预培养液用含甘露醇的试剂替代， 其他 技术步骤所用试剂仍为含有蔗糖的试剂。 0055 三、 存活率、 再生率统计 0056 存活率、 再生率的统计方法与实施例 1 相同， 结果见表 1。 0057 表 1 存活率、 再生率统计结果 0。
24、058 说 明 书 CN 104255705 A 6 5/5 页 7 0059 从以上统计结果可以看出， 方案 3 的菊芋茎尖超低温保存技术流程中的所有步骤 用含甘露醇的试剂替代含蔗糖的试剂后， 虽然再生率可保持 45， 但再生苗中仍有 2/3 出 现玻璃化现象。方案 1 所有步骤用含果糖的试剂替代含蔗糖的试剂后， 尽管再生率有所降 低 (40 )， 但再生苗全部为健康再生苗， 并无玻璃化现象产生， 再生苗玻璃化现象被克服 ( 图 4)。 0060 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 104255705 A 7 1/1 页 8 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 104255705 A 8 。