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1、(10)申请公布号 CN 104255463 A (43)申请公布日 2015.01.07 CN 104255463 A (21)申请号 201410463061.1 (22)申请日 2014.09.12 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 南京通泽农业科技有限公司 地址 210046 江苏省南京市栖霞区尧化街道 甘家边 108 号 1 幢 701 室 (72)发明人 杨存 (54) 发明名称 一种柳兰悬浮细胞的快速繁殖方法 (57) 摘要 本发明研究了一种柳兰悬浮细胞培养的快速 繁殖方法， 包括从柳兰诱导愈伤组织、 继代培养愈 伤组织、 悬浮细胞培养、 细胞悬浮体系的优化等。
2、步 骤。本发明方法所制备的柳兰悬浮细胞工艺流程 简单， 生产周期短， 不受地域， 季节， 气候等自然环 境因素影响等优点， 有利于建立柳兰悬浮细胞的 大规模工厂化生产。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书2页 (10)申请公布号 CN 104255463 A CN 104255463 A 1/1 页 2 1. 一种柳兰悬浮细胞的快速繁殖方法， 其特征是 ： 柳兰的种子经消毒处理， 去掉外种 皮接种在 1/2WPM+NAA0.1-0.2mg/L+6-BA0.5-1mg/L 培养基中进行愈伤。
3、组织诱导， 30 天后， 将诱导出来的愈伤组织接入培养基 WPM+1-2mg/L6-BA+0.3-0.5mg/L2,4-D+150mg/L 番茄汁 培养基中进行继代培养， 继代培养40天后接入附加了150mg/L红色红曲酶中进行液体悬浮 细胞的培养， 7-8 天继代一次， 取样， 洗涤， 烘干。 2. 根据权利要求 1 所述的一种柳兰悬浮细胞的快速繁殖方法， 其特征是 ： 所述的消毒 处理为 ： 选用柳兰的种子， 在肥皂水中浸泡 30min， 自来水冲洗 1h， 在超净工作台上用 0.2 的升汞消毒 15min， 无菌水冲洗 5 遍至无残留溶液。 3. 根据权利要求 1 所述的一种柳兰悬浮细胞。
4、的快速繁殖方法， 其特征是 ： 诱导愈伤组 织的条件为暗光照， 光照 10h/d， 温度 21。 4. 根据权利要求 1 所述的一种柳兰悬浮细胞的快速繁殖方法， 其特征是 ： 柳兰愈伤组 织继代中添加了番茄汁， 可以促进细胞的分裂生长。 5. 根据权利要求 1 所述的一种柳兰悬浮细胞的快速繁殖方法， 其特征是 ： 悬浮细胞的 培养方法为愈伤组织经过继代培养之后， 挑选嫩绿松散的愈伤组织， 放入液体培养基中， 加 入已消毒灭菌后的玻璃珠震摇， 置于震荡培养箱中进行水平震荡培养， 振幅 2-4cm， 震动频 率 90r/min， 温度 23， 光照 2500lx， 光期 12h/d。 权 利 要 。
5、求 书 CN 104255463 A 2 1/2 页 3 一种柳兰悬浮细胞的快速繁殖方法 技术领域 0001 本发明涉及柳兰悬浮细胞的快繁方法， 属于植物技术领域。 背景技术 0002 柳兰，Epilobium angustifolium Linn.， 柳叶菜科， 多年生草本， 高约 1-1.3 米。 茎直立， 通常不分枝。叶互生， 披针形， 总状花序顶生， 伸长， 花序轴被短柔毛， 苞片线形， 长 1-2 厘米， 花大， 两性， 红紫色。根、 茎、 叶、 花、 果均含鞣质， 分布于我国西南、 西北、 华北至东 北 ； 北温带广布， 北美洲、 欧洲至日本， 自然生于海拔较高的林缘、 林间、 山。
6、坡草地、 河岸草丛 及火烧或采伐迹地。耐寒。喜凉爽、 湿润气候及湿润、 肥沃、 排水良好的土壤。稍耐阴。畏 炎热、 干旱的环境。柳兰全草 70% 丙酮提取物中分得 9 个鞣质类及其他酚性化合物， 分别 鉴定为 3- 氧 - 没食子酰基 -D- 葡萄糖、 1， 6- 二 - 氧 - 没食子酰基 -D- 吡喃型葡萄糖、 1- 氧 - 没食子酰基 -4， 6- 六羟基联苯甲酰基 -D- 吡喃型葡萄糖、 水杨梅丁素、 英国栎鞣 花酸、 特里马素、 虾子花素、 绿原酸、 没食子酸。根状茎或全草入药， 有小毒， 能调经活血、 消 肿止痛， 主治月经不调、 骨折、 关节扭伤。柳兰繁殖采用种子繁殖， 也可分株。
7、和扦插繁殖， 悬 浮细胞培养还无人研究， 悬浮细胞具有操作简单可控， 生产成本低， 繁殖率高等优点。 发明内容 0003 本发明所要解决的技术问题是提供柳兰悬浮细胞培养的快速繁殖方法， 操作简单 可控， 生产成本低， 繁殖率高等优点。 0004 为解决上述技术问题， 本发明采用下列技术方案 ： 选用柳兰的种子， 在肥皂水中浸泡 30min， 自来水冲洗 1h， 在超净工作台上用 0.2 的升汞消毒 15min， 无菌水冲洗 5 遍至无残留溶液， 经消毒处理后的外植体， 去掉外种皮接 种在 1/2WPM+NAA0.1-0.2mg/L+6-BA0.5-1mg/L 培养基中进行愈伤组织诱导， 诱导愈。
8、伤组 织的条件为暗光照， 光照 10h/d， 温度 21， 30 天后， 将诱导出来的愈伤组织接入培养基 WPM+1-2mg/L6-BA+0.3-0.5mg/L2,4-D+150mg/L 番茄汁培养基中进行继代培养， 继代培养 40 天后， 挑选嫩绿松散的愈伤组织， 放入附加了 150mg/L 红色红曲酶的培养液体培养基中， 加入已消毒灭菌后的玻璃珠震摇， 置于震荡培养箱中进行水平震荡培养， 振幅 2-4cm， 震动 频率 90r/min， 温度 23， 光照 2500lx， 光期 12h/d， 7-8 天继代一次， 取样， 洗涤， 烘干。 0005 采用本发明制备的柳兰悬浮细胞， 工艺流程简。
9、单， 生产周期短， 不受地域， 季节， 气 候等自然环境因素影响等优点， 有利于建立柳兰悬浮细胞的大规模工厂化生产。 0006 下面将结合具体实施方式对本发明作进一步阐述， 但本发明要求保护的范围并不 局限于下列实施方式。 具体实施方式 0007 实施例 1 选用柳兰的种子， 在肥皂水中浸泡 30min， 自来水冲洗 1h， 在超净工作台上用 0.2的 说 明 书 CN 104255463 A 3 2/2 页 4 升汞消毒 15min， 无菌水冲洗 5 遍至无残留溶液， 经消毒处理后的外植体， 去掉外种皮接种 在 1/2WPM+NAA0.1mg/L+6-BA0.5mg/L 培养基中进行愈伤组织。
10、诱导， 诱导愈伤组织的条件 为暗光照， 光照 10h/d， 温度 21， 30 天后， 将诱导出来的愈伤组织接入培养基 WPM+1mg/ L6-BA+0.3mg/L2,4-D+150mg/L 番茄汁培养基中进行继代培养， 继代培养 40 天后， 挑选嫩绿 松散的愈伤组织， 放入附加了 150mg/L 红色红曲酶的培养液体培养基中， 加入已消毒灭菌 后的玻璃珠震摇， 置于震荡培养箱中进行水平震荡培养， 振幅 2-4cm， 震动频率 90r/min， 温 度 23， 光照 2500lx， 光期 12h/d， 7-8 天继代一次， 取样， 洗涤， 烘干， 成活率为 90%。 0008 实施例 2 选。
11、用柳兰的种子， 在肥皂水中浸泡 30min， 自来水冲洗 1h， 在超净工作台上用 0.2 的升汞消毒 15min， 无菌水冲洗 5 遍至无残留溶液， 经消毒处理后的外植体， 去掉外种皮接 种在 1/2WPM+NAA0.2mg/L+6-BA1mg/L 培养基中进行愈伤组织诱导， 诱导愈伤组织的条件 为暗光照， 光照 10h/d， 温度 21， 30 天后， 将诱导出来的愈伤组织接入培养基 WPM+2mg/ L6-BA+0.5mg/L2,4-D+150mg/L 番茄汁培养基中进行继代培养， 继代培养 40 天后， 挑选嫩绿 松散的愈伤组织， 放入附加了 150mg/L 红色红曲酶的培养液体培养基。
12、中， 加入已消毒灭菌 后的玻璃珠震摇， 置于震荡培养箱中进行水平震荡培养， 振幅 2-4cm， 震动频率 90r/min， 温 度 23， 光照 2500lx， 光期 12h/d， 7-8 天继代一次， 取样， 洗涤， 烘干， 成活率为 91%。 0009 实施例 3 选用柳兰的种子， 在肥皂水中浸泡 30min， 自来水冲洗 1h， 在超净工作台上用 0.2 的升汞消毒 15min， 无菌水冲洗 5 遍至无残留溶液， 经消毒处理后的外植体， 去掉外种皮接 种在 1/2WPM+NAA0.2mg/L+6-BA1mg/L 培养基中进行愈伤组织诱导， 诱导愈伤组织的条件 为暗光照， 光照 10h/d， 温度 21， 30 天后， 将诱导出来的愈伤组织接入培养基 WPM+2mg/ L6-BA+0.3mg/L2,4-D+150mg/L 番茄汁培养基中进行继代培养， 继代培养 40 天后， 挑选嫩绿 松散的愈伤组织， 放入附加了 150mg/L 红色红曲酶的培养液体培养基中， 加入已消毒灭菌 后的玻璃珠震摇， 置于震荡培养箱中进行水平震荡培养， 振幅 2-4cm， 震动频率 90r/min， 温 度 23， 光照 2500lx， 光期 12h/d， 7-8 天继代一次， 取样， 洗涤， 烘干， 成活率为 92%。 说 明 书 CN 104255463 A 4 。