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1、(10)申请公布号 CN 104255458 A (43)申请公布日 2015.01.07 CN 104255458 A (21)申请号 201410463009.6 (22)申请日 2014.09.12 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 南京通泽农业科技有限公司 地址 210046 江苏省南京市栖霞区尧化街道 甘家边 108 号 1 幢 701 室 (72)发明人 杨存 (54) 发明名称 一种重阳木愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖 方法 (57) 摘要 本发明研究了一种重阳木愈伤组织和悬浮细 胞的快速繁殖方法， 包括无菌叶片的获得、 愈伤组 织的诱导、 愈伤组织的增殖、 悬。
2、浮细胞的培养、 细 胞的调控等步骤。本发明方法可以快速获得大量 的重阳木悬浮细胞， 操作简单， 细胞增殖率高， 生 长周期短， 可以无限度的提供重阳木悬浮细胞制 药原料， 有利于资源的开发和利用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书2页 (10)申请公布号 CN 104255458 A CN 104255458 A 1/1 页 2 1. 一种重阳木愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法， 包括无菌叶片的获得、 愈伤组织 的诱导、 愈伤组织的增殖、 悬浮细胞的培养、 细胞的调控等， 主要步骤如下。
3、 ： （1） 取重阳木的幼嫩叶片， 按照常规的消毒方法对其进行消毒处理 ； （2）将步骤 （1）灭菌处理过的重阳木叶片接入培养基配方为改良 MS+KT0.5mg/L+2， 4-D2.0mg/L+PA500mg/L 诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养， 附加蔗糖 30g/L， 琼脂 6.5g/ L， PH5-6， 光照 2000lx， 温度 25 ； （3） 取步骤 （2） 诱导出来的愈伤组织放入改良 MS+KT0.1-0.2mg/L+2， 4-D0.2-0.5mg/L 培养基进行愈伤组织增殖， 附加蔗糖 20g/L， PH5.8， 光照 2500lx， 温度 25 ； （4） 取步骤 （3） 增。
4、殖后松散的愈伤组织接入改良 MS+NAA1.0 mg/L+KT0.5mg/L+5-8mg/L 硝酸银， 每 200ml 锥形瓶接种 60ml 液体， 采用水平震荡培养， 转速 90r/min， 振幅 3cm。 2. 按照权利要求 1 所述的一种重阳木愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法， 其特 征在于 ： 步骤 （1） 中所述重阳木无菌叶片的获得为 ： 取重阳木幼嫩的叶片， 漂白粉中浸泡 4min， 毛刷去除表面污渍， 流水冲洗 25min， 超净工作台上次氯酸钠处理 15min， 无菌水冲洗 5-7 遍。 3. 按照权利要求 1 所述的一种重阳木愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法， 其特征 在于 。
5、： 步骤 （2） 中所述愈伤组织的诱导， 在培养基中附加 PA500mg/L， 可以防止愈伤组织的 褐化。 4. 按照权利要求 1 所述的一种重阳木愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法， 其特征 在于 ： 步骤 （4） 中加入了硝酸银， 可以调节重阳木细胞的生长和次生代谢物质的合成。 权 利 要 求 书 CN 104255458 A 2 1/2 页 3 一种重阳木愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法 技术领域 0001 本发明涉及组培条件下重阳木悬浮细胞的培养， 属于植物技术领域。 背景技术 0002 重阳木， 大戟科， Bischofi a polycarpa， 别名 ： 乌杨、 茄冬树、 洪桐， 。
6、浙江金华林业基 地、 江苏大丰林业基地大量培育。 江苏南北各地通常作行道树和庭园观赏树栽培。 华北地区 有少量引进栽培。分布于广东、 广西、 福建、 湖南、 湖北、 江西、 浙江、 安徽、 江苏、 四川、 贵州、 陕西、 河南、 台湾等省 （自治区） 。生态适应性重阳木属树种喜光， 也略耐阴， 耐干旱瘠薄， 也 耐水湿。 重阳木表现出很强的抗寒能力， 如河南1993年冬季突降大雪， 气温降至17.9， 重阳木当年生枝条没有任何冻害现象发生， 雌株仍能正常开花结实。目前普遍采用的繁殖 方法为播种繁殖， 利用组培方法获得大量的愈伤组织悬浮细胞， 缩短培养周期获得大量的 制药原料。 发明内容 000。
7、3 本发明所要解决的技术问题是提供重阳木细胞悬浮培养的快速繁殖方法， 操作简 单， 细胞增殖率高， 生长周期短， 可以无限度的提供重阳木悬浮细胞制药原料， 有利于资源 的开发和利用。 0004 为解决上述技术问题， 本发明采用下列技术方案 ： 取重阳木幼嫩的叶片， 漂白粉中浸泡 4min， 毛刷去除表面污渍， 流水冲洗 25min， 超净 工作台上次氯酸钠处理 15min， 无菌水冲洗 5-7 遍， 灭菌处理过的重阳木叶片接入培养基配 方为改良MS+KT0.5mg/L+2， 4-D2.0 mg/L+PA500mg/L诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养， 附加蔗糖 30g/L， 琼脂 6.5g/L。
8、， PH5-6， 光照 2000lx， 温度 25， 诱导出来的愈伤组织放入改 良 MS+KT0.2mg/L+2， 4-D0.3mg/L 培养基进行愈伤组织增殖， 附加蔗糖 20g/L， PH5.8， 光照 2500lx， 温度 25， 增殖后松散的愈伤组织接入改良 MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+7mg/L 硝 酸银， 每 200ml 锥形瓶接种 60ml 液体， 采用水平震荡培养， 转速 90r/min， 振幅 3cm。 0005 采用本发明制备的重阳木悬浮细胞， 增殖速度快， 操作简单， 能耗小， 。 0006 下面将结合具体实施方式对本发明作进一步阐述， 但本发明要求保。
9、护的范围并不 局限于下列实施方式。 具体实施方式 0007 实施例 1 取重阳木幼嫩的叶片， 漂白粉中浸泡 4min， 毛刷去除表面污渍， 流水冲洗 25min， 超净 工作台上次氯酸钠处理 15min， 无菌水冲洗 5-7 遍， 灭菌处理过的重阳木叶片接入培养基配 方为改良MS+KT0.5mg/L+2， 4-D2.0 mg/L+PA500mg/L诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养， 附加蔗糖 30g/L， 琼脂 6.5g/L， PH5-6， 光照 2000lx， 温度 25， 诱导出来的愈伤组织放入改 良 MS+KT0.1mg/L+2， 4-D0.2mg/L 培养基进行愈伤组织增殖， 附加蔗糖。
10、 20g/L， PH5.8， 光照 说 明 书 CN 104255458 A 3 2/2 页 4 2500lx， 温度 25， 增殖后松散的愈伤组织接入改良 MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+5mg/L 硝 酸银， 每 200ml 锥形瓶接种 60ml 液体， 采用水平震荡培养， 转速 90r/min， 振幅 3cm。 0008 实施例 2 取重阳木幼嫩的叶片， 漂白粉中浸泡 4min， 毛刷去除表面污渍， 流水冲洗 25min， 超净 工作台上次氯酸钠处理 15min， 无菌水冲洗 5-7 遍， 灭菌处理过的重阳木叶片接入培养基配 方为改良 MS+KT0.5mg/L+2， 4-。
11、D2.0mg/L+PA500mg/L 诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养， 附加蔗糖 30g/L， 琼脂 6.5g/L， PH5-6， 光照 2000lx， 温度 25， 诱导出来的愈伤组织放入改 良 MS+KT0.2mg/L+2， 4-D0.5mg/L 培养基进行愈伤组织增殖， 附加蔗糖 20g/L， PH5.8， 光照 2500lx， 温度 25， 增殖后松散的愈伤组织接入改良 MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+8mg/L 硝 酸银， 每 200ml 锥形瓶接种 60ml 液体， 采用水平震荡培养， 转速 90r/min， 振幅 3cm。 0009 实施例 3 取重阳木幼嫩的叶。
12、片， 漂白粉中浸泡 4min， 毛刷去除表面污渍， 流水冲洗 25min， 超净 工作台上次氯酸钠处理 15min， 无菌水冲洗 5-7 遍， 灭菌处理过的重阳木叶片接入培养基配 方为改良 MS+KT0.5mg/L+2， 4-D2.0mg/L+PA500mg/L 诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养， 附加蔗糖 30g/L， 琼脂 6.5g/L， PH5-6， 光照 2000lx， 温度 25， 诱导出来的愈伤组织放入改 良 MS+KT0.2mg/L+2， 4-D0.2mg/L 培养基进行愈伤组织增殖， 附加蔗糖 20g/L， PH5.8， 光照 2500lx， 温度 25， 增殖后松散的愈伤组织。
13、接入改良 MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+7mg/L 硝 酸银， 每 200ml 锥形瓶接种 60ml 液体， 采用水平震荡培养， 转速 90r/min， 振幅 3cm。 0010 实施例 4 取重阳木幼嫩的叶片， 漂白粉中浸泡 4min， 毛刷去除表面污渍， 流水冲洗 25min， 超净 工作台上次氯酸钠处理 15min， 无菌水冲洗 5-7 遍， 灭菌处理过的重阳木叶片接入培养基配 方为改良 MS+KT0.5mg/L+2， 4-D2.0mg/L+PA500mg/L 诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养， 附加蔗糖 30g/L， 琼脂 6.5g/L， PH5-6， 光照 2000lx， 温度 25， 诱导出来的愈伤组织放入改 良 MS+KT0.2mg/L+2， 4-D0.5mg/L 培养基进行愈伤组织增殖， 附加蔗糖 20g/L， PH5.8， 光照 2500lx， 温度 25， 增殖后松散的愈伤组织接入改良 MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+7mg/L 硝 酸银， 每 200ml 锥形瓶接种 60ml 液体， 采用水平震荡培养， 转速 90r/min， 振幅 3cm。 说 明 书 CN 104255458 A 4 。