小附红细胞体MPG1基因、蛋白及应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104232662 A (43)申请公布日 2014.12.24 CN 104232662 A (21)申请号 201310226924.9 (22)申请日 2013.06.07 C12N 15/53(2006.01) C12N 9/02(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) G01N 33/569(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61K 39/02(2006.01) A61P 31/04(2006.01) 。

2、C12R 1/01(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院上海兽医研究所 地址 200241 上海市闵行区紫月路 518 号 (72)发明人 陈兆国 周鹏 曹薇 米荣升 黄燕 王向佩 (74)专利代理机构 上海序伦律师事务所 31276 代理人 周东萍 (54) 发明名称 小附红细胞体 MPG1 基因、 蛋白及应用 (57) 摘要 本发明公开了一种小附红细胞体基因， 该基 因为 MPG1 基因， 其编码的氨基酸序列与 SEQ ID NO.1所示序列具有98.2以上同源性。 本发明还 公开了上述基因编码的小附红细胞体 MPG1 蛋白。 本发明的小附。

3、红细胞体 MPG1 基因和蛋白， 在小附 红细胞体入侵宿主红细胞， 完成病原体的生活史 中具有重要作用， 对于开发防治猪的附红细胞体 病的新药或疫苗具有较高的应用价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 25 页 附图 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书25页 附图6页 (10)申请公布号 CN 104232662 A CN 104232662 A 1/1 页 2 1. 一种小附红细胞体基因， 其特征在于， 所述基因为小附红细胞体 MPG1 基因， 其编码 的氨基酸序列与 SEQ ID NO.1 所示序列具有 98.2以。

4、上同源性。 2. 根据权利要求 1 所述的小附红细胞体基因， 其特征在于， 所述 MPG1 基因编码的氨基 酸序列选自 SEQ ID NO.3 13 中的任一序列。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的小附红细胞体基因， 其特征在于， 所述 MPG1 基因的核苷 酸序列与 SEQ ID NO.2 所示序列具有 96.6以上同源性。 4. 根据权利要求 3 所述的小附红细胞体基因， 其特征在于， 所述 MPG1 基因的核苷酸序 列选自 SEQ ID NO.14 24 中的任一序列。 5. 一种小附红细胞体蛋白， 其特征在于， 所述蛋白为小附红细胞体 MPG1 蛋白， 其编码 的氨基酸序列与 S。

5、EQ ID NO.1 所示序列具有 98.2以上同源性。 6. 根据权利要求 5 所述的小附红细胞体蛋白， 其特征在于， 所述 MPG1 蛋白的氨基酸序 列选自 SEQ ID NO.3 13 中的任一序列。 7. 一种重组载体， 其特征在于， 包含编码 SEQ ID NO.3 13 中任一氨基酸序列的核苷 酸序列。 8. 一种宿主细胞， 其特征在于， 包含权利要求 7 所述的重组载体。 9. 权利要求 1 所述小附红细胞体基因在制备诊断猪的附红细胞体病的产品或制备预 防猪的附红细胞体病的疫苗中的应用。 10. 权利要求 5 所述小附红细胞体蛋白在制备诊断猪的附红细胞体病的产品或制备预 防猪的附。

6、红细胞体病的疫苗中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104232662 A 2 1/25 页 3 小附红细胞体 MPG1 基因、 蛋白及应用 技术领域 0001 本发明涉及生物工程技术领域， 尤其涉及一种小附红细胞体 MPG1 基因、 蛋白及应 用。 背景技术 0002 目前已经命名的附红细胞体主要有绵羊附红细胞体 (Mycoplasma ovis)、 温氏附 红细胞体 (M.wenyonii)、 猪附红细胞体 (M.suis)、 小附红细胞体 (M.parvum) 等。在诸多 的附红细胞体种类中， 仅有猪附红细胞体和小附红细胞体能够感染猪 (Watanabe et al.， 2011)。猪。

7、附红细胞体引起的临床症状有多种， 急性感染的早期， 通常母猪表现为贫血、 黄 疸及厌食， 新生仔猪及断奶仔猪表现为严重贫血 (Henry， 1979 ； Henderson et al.， 1997)。 慢性感染通常表现为母猪的生殖障碍， 育肥猪的体重下降等 (Zinn et al.， 1983)。猪附红 细胞体在一定程度上有宿主特异性， 但是国内已有人感染猪附红细胞体的相关报道 (Yuan et al.， 2009)， 表明猪附红细胞体病是一种人兽共患病。 有关小附红细胞体的致病性研究， 国内外鲜有报道， 但有研究发现它可以导致去脾猪的严重贫血， 并伴有发热症状 (Barnett， 1963。

8、)。国内尚未见猪感染小附红细胞体病的相关报道。 0003 猪 附 红 细 胞 体 3- 磷 酸 甘 油 醛 脱 氢 酶 样 蛋 白 1(M.suis glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase-like protein 1， MSG1) 存在于猪附红细 胞体表面， 具有 3- 磷酸甘油醛脱氢酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH) 活性， 参与感染机体内的糖酵解活动， 在附红细胞体粘附宿主红细胞的过程中起重 要作用。 用重组表达的MSG1蛋白免疫猪， 在体内产生了很强的免疫反应(Hoelzle 。

9、et al.， 2009)。目前， 尚未见小附红细胞体 3- 磷酸甘油醛脱氢酶样蛋白 1(M.parvum GAPDH-like protein 1， MPG1) 的报道， GenBank 中也尚无 MPG1 基因序列。 发明内容 0004 本发明要解决的技术问题是提供一种小附红细胞体 MPG1 基因和蛋白， 该 MPG1 基 因在小附红细胞体入侵宿主红细胞， 完成病原体的生活史中具有重要作用， 对于开发猪附 红细胞体病的疫苗具有较高的应用价值。 0005 此外， 还需要提供一种小附红细胞体 MPG1 基因和蛋白的应用。 0006 为了解决上述技术问题， 本发明通过如下技术方案实现 ： 000。

10、7 在本发明的一个方面， 提供了一种小附红细胞体基因， 该基因为 MPG1 基因， 其编 码的氨基酸序列与 SEQ ID NO.1 所示序列具有 98.2以上同源性。 0008 优选的， 所述 MPG1 基因编码的氨基酸序列选自 SEQ ID NO.3 13 中的任一序列。 0009 优选的， 所述MPG1基因的核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示序列具有96.6以上同 源性。 0010 更优选的， 所述 MPG1 基因的核苷酸序列选自 SEQ ID NO.14 24 中的任一序列。 0011 在本发明的另一方面， 提供了一种小附红细胞体蛋白， 该蛋白为 MPG1 蛋白， 其编 说 明 书 。

11、CN 104232662 A 3 2/25 页 4 码的氨基酸序列与 SEQ ID NO.1 所示序列具有 98.2以上同源性。 0012 优选的， 所述 MPG1 蛋白的氨基酸序列选自 SEQ ID NO.3 13 中的任一序列。 0013 在本发明的另一方面， 还提供了一种重组载体， 包含编码 SEQ ID NO.3 13 中任 一氨基酸序列的核苷酸序列。 0014 在本发明的另一方面， 还提供了一种宿主细胞， 包含上述重组载体。 0015 在本发明的另一方面， 还提供了一种上述小附红细胞体基因在制备诊断猪的附红 细胞体病的产品或制备预防猪的附红细胞体病的疫苗中的应用。 0016 在本发明。

12、的另一方面， 还提供了一种上述小附红细胞体蛋白在制备诊断猪的附红 细胞体病的产品或制备预防猪的附红细胞体病的疫苗中的应用。 0017 本发明的小附红细胞体MPG1蛋白可用来制备ELISA诊断试剂， 以及用于制备预防 猪的附红细胞体病的疫苗。 0018 本发明小附红细胞体 MPG1 基因高度保守， 可建立基于该 G1 基因的 TaqMan 实时 荧光定量 PCR 检测方法， 用于特异性地检出感染猪的猪源附红细胞体 ； 其表达的重组蛋白， 可作为抗原用于制备诊断猪的附红细胞体病的免疫学方法检测产品。而且， 本发明的小附 红细胞体 MPG1 基因， 在小附红细胞体入侵宿主红细胞， 完成病原体的生活史。

13、中具有重要作 用， 对于开发防治猪附红细胞体病的新药或疫苗具有较高的应用价值。 附图说明 0019 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。 0020 图 1 是本发明实施例 1 的小附红细胞体 MPG1 基因的 PCR 扩增结果图 ； 0021 图 2 是本发明实施例 3 小附红细胞体 MPG1 基因在线 Blastn 比对图 ； 0022 图 3 是本发明实施例 3 不同株小附红细胞体 MPG1 基因与 MSG1 基因的核苷酸序列 比对图 ； 0023 图 4 是本发明实施例 3 不同株小附红细胞体 MPG1 基因与 MSG1 基因的氨基酸序列 比对图 ； 0024 图 5 。

14、是本发明实施例 3 小附红细胞体 MPG1 及 MSG1 基因序列系统进化树图 ； 0025 图 6 是本发明实施例 4 敏感性试验扩增曲线图 ； 0026 图 7 是本发明实施例 4 实时荧光定量 PCR 标准曲线图。 0027 图 8 是本发明实施例 4 小附红细胞体阳性田间样品 TaqMan 实时荧光定量 PCR 扩 增荧光曲线图。 具体实施方式 0028 下列实施例中， 未注明具体条件的实验方法， 通常按常规条件， 如 分子克隆实验 指南 (J. 萨姆布鲁克， D.W. 拉塞尔著， 黄培堂， 汪嘉玺， 朱厚础， 等译 . 第 3 版， 北京 ： 科学 出版社， 2002) 中所述的方法。

15、进行。 0029 为了获得小附红细胞体 MPG1 基因序列数据， 分析田间自然感染的小附红细胞体 MPG1 基因的遗传变异特点， 本发明从上海地区 3 个屠宰场采集自然感染小附红细胞体的猪 血液， 提取基因组DNA， 利用常规PCR及实时定量荧光PCR技术检测附红细胞体感染阳性后， 采用Rnase P RNA基因序列分析、 16S rRNA基因序列分析及限制性内切酶酶切(PCR-RFLP) 说 明 书 CN 104232662 A 4 3/25 页 5 分析， 对感染的附红细胞体种类进行鉴定， 首次在国内鉴定出了 11 株小附红细胞体。在此 基础上， 进行 MPG1 基因的扩增， 将扩增产物连。

16、接到 pMD18-T 载体上， 进行序列测定和分析， 为进一步了解小附红细胞体 MPG1 基因结构和功能提供重要依据。 0030 实施例 1 小附红细胞体 MPG1 基因的 PCR 扩增 0031 1. 引物设计与合成 0032 鉴于GenBank未登录有MPG1基因的序列， 且MSG1基因(SEQ ID NO.1)在猪附红细 胞体中高度保守， 本实验使用扩增 MSG1 基因的引物， 对小附红细胞体基因组 DNA 进行 MPG1 基因的扩增。引物序列如下 ： 0033 0034 引物由上海英骏生物技术有限公司合成， 用 ddH2O 稀释成 100pmol/L 的浓度， 预 计扩增片段长度为 1。

17、 011bp。 0035 2. 猪全血 DNA 提取 0036 2.1 血液处理 0037 小附红细胞体感染猪血液样品分别采自上海市长宁区、 松江区和嘉定区某屠 宰场， 加入抗凝剂柠檬酸葡萄糖 (acid citrate dextrose， ACD)， 血液与抗凝剂比例为 1 10， 经 Rnase P RNA 基因及 16S rRNA 基因序列和限制性内切酶酶切分析鉴定为小附红 细胞体阳性的全血 DNA 用于试验， 共计 11 份。 0038 将 11 份小附红细胞体阳性抗凝血以 3 000r/min 离心 10min， 小心吸取红细胞 500L， 放入高压灭菌后的离心管中， 立即进行基因组。

18、 DNA 的提取， 或放于 -20保存备用。 0039 2.2 血液 DNA 提取 0040 按照全血基因组 DNA 提取试剂盒说明书， 提取血液基因组 DNA ： 0041 (1) 将纯化树脂和 GN 结合液放入 75水浴锅中， 溶解出现的结晶或盐析， 并充分 混匀。 0042 (2)将全血轻轻混匀， 吸取500L全血至高压灭菌后的离心管中， 加入1mL纯化树 脂， 漩涡震荡或用枪吹打， 使其充分混匀。室温下放置 3min， 5000r/min 离心 1min， 弃上清， 收集沉淀。 0043 (3) 向沉淀中加入 1mL GN 结合液， 将纯化树脂悬浮， 漩涡震荡或用移液器吹打， 使 其充。

19、分混匀， 5000r/min 离心 1min， 弃上清， 收集沉淀。 0044 (4) 向沉淀中加入 0.5mL 漂洗液， 漂洗纯化树脂 2 次， 5 000r/min 离心 1min， 弃上 清， 收集沉淀。( 如若纯化树脂依然呈现出黄色或者褐色， 表示没有洗净， 重复漂洗 1 次， 直 至纯化树脂呈现出奶白色 ) 0045 (5) 向沉淀中加入 0.8mL 无水乙醇悬浮树脂， 并将混合液装入离心纯化柱中， 12 000r/min 离心 1min， 弃掉废液收集管中的无水乙醇， 再次离心， 尽量除尽乙醇。 0046 (6) 将离心纯化柱套入干净离心管中， 加入 100L TE 缓冲液至纯化树。

20、脂上， 室温 下静置 3 5min， 12 000r/min 离心 2min。洗脱下的全血基因组 DNA 可立即用于下游实验， 说 明 书 CN 104232662 A 5 4/25 页 6 或放于 -20保存备用。 0047 3. 小附红细胞体 MPG1 基因扩增 0048 3.1以小附红细胞体阳性血液基因组DNA为模板进行扩增， PCR反应体系总体积为 25L， 反应体系为 ： 0049 0050 3.2 混合均匀后， 放入 PCR 自动扩增仪中进行扩增， 设置的反应条件为 ： 0051 0052 3.3PCR 按上述反应程序结束后， 吸取 5L PCR 扩增产物， 混合 1L 6load。

21、ing buffer 上样， 于 12g/L 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物， 拍照保存。 0053 3.4PCR 扩增结果 0054 以含有小附红细胞体病原的全血提取的 DNA 为模板， 均成功扩增出了大小约为 1 000bp 左右的片段， 与预期片段长度相符 ( 见图 1)。图 1 中， M ： DNA 标准 DL2 000 ； 1 ： 小附 红细胞体 MPG1 基因 PCR 扩增产物 ； N ： 阴性对照。 0055 4.PCR 扩增产物的纯化 0056 利用 Axygen DNA 胶回收试剂盒， 对 PCR 扩增产物进行纯化回收， 具体操作步骤如 下 ： 0057 (1)PCR 产物。

22、经琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下将目的基因片段条带切下。整个过 程要迅速， 以避免紫外灯照射造成的基因突变。 尽量切除不含目的条带的琼脂糖凝胶， 提高 DNA 回收效率。 0058 (2) 将含有目的基因的琼脂凝糖胶放入 1.5mL 的 EP 管中， 加入 480L Buffer DE-A， 混合均匀后于 75加热直至凝胶块完全熔化 ( 约 8 10min)。 0059 (3)向完全融化后的液体中加240L Buffer DE-B， 混合均匀， 此时混合液变为黄 色。 说 明 书 CN 104232662 A 6 5/25 页 7 0060 (4) 吸取步骤 3 中的混合液， 转移到 DNA 制备。

23、管 ( 置于试剂盒内提供的 2mL 离心 管 ) 中， 12 000g 离心 1min。倒掉滤液。 0061 (5) 向制备管中加入 500L Buffer W1， 12 000g 离心 30s， 倒掉滤液。 0062 (6) 向制备管中加入 700L Buffer W2( 确认在 Buffer W2 中已按试剂瓶上的指 定体积加入无水乙醇)， 12 000g离心30s， 弃滤液。 以同样的方法再用700L Buffer W2 洗涤一次， 12 000g 离心 1min。 0063 (7) 制备管放回 2mL 离心管， 12 000g 空离 1min， 尽可能的除尽乙醇。 0064 (8) 制。

24、备管置于新的 1.5ml 离心管 ( 试剂盒内提供 ) 中， 在吸附膜中央加 30L Eluent( 提前置于 65水浴锅中预热 )， 室温静置 1min。12 000g 离心 1min 收集洗脱液。 0065 (9) 洗脱下的 DNA， 直接用于下游实验或者于 -20保存备用。 0066 实施例 2 目的基因 MPG1 的克隆、 筛选、 鉴定与测序 0067 一、 目的基因 MPG1 的克隆 0068 1、 连接 ： 0069 将纯化好的目的基因片段同克隆载体 pMD18-T 连接， 连接体系如下表 ： 0070 0071 将上述反应体系的混合液置于 16连接仪中连接过夜。 0072 2、 。

25、转化 0073 将重组质粒转化至大肠杆菌 DH5 感受态细胞中， 具体操作步骤如下 ： 0074 (1) 首先， 提前 1h 用无菌涂布棒将 40L 20mg/mL X-Gal 及 7L 20 IPTG 均 匀涂布于含氨苄青霉素的 LB 琼脂培养板上， 并倒置放于 37恒温培养箱中， 直至其完全吸 收。 0075 (2)取33.5L冰上融化的DH5感受态细胞， 加入到含10L DNA连接产物的离 心管中， 轻轻吹打混合均匀， 混合物冰浴 30min。 0076 (3) 将含冰浴的连接产物及 DH5 感受态细胞混合液的离心管放入 42水浴中， 热激 90s， 随后快速将管转移至冰上， 静置 5m。

26、in， 该过程保证离心管轻拿轻放， 不要摇动离 心管。 0077 (4) 向离心管中加入 400L 无菌无抗的 LB 液体培养基， 混合均匀后， 于 37恒温 摇床 200r/min 培养 1h， 复苏细菌。 0078 (5)1h 后取菌液 200L 均匀涂于 LB 琼脂培养板上， 待菌液被培养基完全吸收后， 平板倒置， 37过夜培养， 约 10h 12h。 0079 二、 阳性重组质粒 pMD18-T-MPG1 的筛选与鉴定 0080 1、 PCR 扩增鉴定 0081 从过夜培养的含氨苄青霉素 LB 琼脂平板上， 挑取形状规则圆整的单个白色菌落， 接种到 5mL LB 液体培养基中 ( 含有。

27、 1 1000 的氨苄青霉素 )， 37培养 8h 10h。以菌 说 明 书 CN 104232662 A 7 6/25 页 8 液为模板， 以 MSG1-F、 MSG1-R 为引物对， PCR 鉴定重组质粒， 反应体系如下 ： 0082 0083 混合均匀后， 放入 PCR 自动扩增仪中进行扩增， 设置的反应条件为 ： 0084 0085 反应结束后， 吸取 5L 菌液 PCR 扩增产物， 于 12g/L 琼脂糖凝胶电泳检测， 拍照保 存。 0086 2、 重组质粒 pMD18-T-MPG1 的酶切鉴定 0087 (1) 质粒小量提取 0088 将阳性克隆的菌液， 使用试剂盒进行质粒提取， 。

28、步骤如下 ： 0089 1) 吸取恒温培养的菌液 3mL， 12 000r/min 离心 1min， 收集细菌沉淀， 尽量吸除上 清 ( 分两次将 3mL 菌体沉淀收集到一个离心管中 )。 0090 2) 向留有菌体沉淀的离心管中加入 250L 溶液 P1( 提前已向其中加入试剂盒提 供的 RNase A)， 使用移液器彻底悬浮细菌沉淀。 0091 3) 加入 250L 溶液 P2， 温和地上下翻转 6 8 次， 使菌体充分裂解。 0092 4) 加入 250L 溶液 P2， 温和地上下翻转混合 6 8 次使菌体充分裂解， 注意不要 剧烈震荡， 以免打断基因组 DNA， 造成提取的质粒中混有基。

29、因组 DNA 片断且所用时间不应超 过 5min。 0093 5) 待菌液变得清亮粘稠， 向加入 350L 溶液 P3， 立即温和地上下翻转 6 8 次， 并充分混匀， 此时将出现白色絮状沉淀， 12 000r/min 离心 8 10min。 0094 6) 收集上清液， 用移液器转移到吸附柱 CP3 中， 并将吸附柱放入收集管中， 注意尽 量不要吸出沉淀。12 000r/min 离心 1min， 倒掉收集管中的废液， 将 CP3 放入收集管中。 0095 7)向CP3中加500L去蛋白液PD， 12 000r/min离心1min， 倒掉收集管中的废液， 将吸附柱 CP3 重新放回到收集管中。。

30、向吸附柱 CP3 中加入 600L 漂洗液 PW( 请先检查是 否已加入无水乙醇 )， 12 000r/min 离心 30-60s， 倒掉收集管中的废液， 将 CP3 放入收集管 中。 0096 8) 加 600L 漂洗液 PW， 12 000r/min 离心 1min， 0097 9) 倒掉收集管中的废液， 将 CP3 放入收集管中， 12 000rpm 离心 2min， 将吸附柱中 说 明 书 CN 104232662 A 8 7/25 页 9 残余的漂洗液去除(将CP3开盖， 置于室温放置数分钟， 以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗 液 )。 0098 10)将CP3置于一个干净的离心管中，。

31、 向吸附膜的中间部位滴加75L洗脱缓冲液 EB， 室温放置3min， 12 000r/min离心1min将质粒溶液收集到离心管中， 将收集的质粒溶液 加入到吸附柱中， 12 000r/min 离心 1min， 提高回收率。 0099 11) 将所提取的质粒立即用于下有实验或保存在 -20备用。 0100 (2) 酶切鉴定 0101 将小量提取后的质粒pMD18-T-MPG1， 用内切酶Xba I及Sal I双酶切， 酶切体系如 下 ： 0102 0103 将上述混合液放于37水浴锅中进行酶切反应， 30min后吸取5L酶切产物混合 1L 6loading buffer 上样， 于 12g/L 。

32、的琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物， 拍照保存。 0104 3、 目的基因 MPG1 核苷酸序列测序 0105 选取菌液 PCR 阳性， 且酶切鉴定阳性的重组菌， 吸取 700L， 送公司测序。 0106 测序结果显示， 11 条小附红细胞体 MPG1 基因序列如 SEQ ID NO.14 24 所示， 其 预测的氨基酸序列如 SEQ ID NO.3 13 所示。 0107 实施例 3 MPG1 基因序列的比较与分析 0108 1. 方法 0109 将测序获得的结果， 用在线 BLAST(http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 进行同源性搜索， 确定插入的基因。

33、片段正确与否， 并用 BioEdit 软件及 DNAMAN 软件将结果 与 NCBI 上公布的 MSG1 序列 ( 登录号为 AM407404.1) 进行序列比对分析。 0110 2. 结果 0111 (1) 在线 BLASTn 比对 0112 共获得了 11 条小附红细胞体 MPG1 基因序列， 这些基因序列的长度均为 1 011bp， BLASTn 软件在线分析显示所获序列全部与 GenBank 公布的猪附红细胞体 MSG1 基因 ( 登录 号为 AM407404.1， MSG1 氨基酸序列为 SEQ ID NO.1 所示， MSG1 核苷酸序列为 SEQ ID NO.2 所示 ) 同源 。

34、( 见图 2)。 0113 (2)MPG1 核苷酸序列比对 0114 1)本发明将所获得的11条小附红细胞体MPG1序列用DNAstar软件进行一致性分 析， 结果显示它们之间的同源性为 96.8 99.9， 核苷酸变异率在 0.1 3.2之间 ； MPG1 基因阅读框全长 1 011bp， 与 MSG1 基因一样编码 336 个氨基酸， 用 DNAstar 软件将核 苷酸序列翻译成氨基酸序列， 分析结果显示氨基酸的相似性为 97.9 100之间。详细 说 明 书 CN 104232662 A 9 8/25 页 10 结果见下表 1。 0115 表 1 不同株小附红细胞体 MPG1 基因的相似。

35、性比较 0116 0117 注 ： 左下侧为核苷酸序列相似性的比较结果， 右上侧为氨基酸序列相似性的比较 结果。 FX表示样品来源于上海长宁区某屠宰场 ； SJ、 JD分别表示样品来源于上海市松江区、 嘉定区某屠宰场。 0118 2)本发明将所获得的11条小附红细胞体MPG1序列与GenBank上登录的猪附红细 胞体MSG1基因(AM407404.1)以及随机选择的8条田间获得的猪附红细胞体MSG1基因序列 用DNAMAN软件分析。 结果显示， 所获得的小附红细胞体MPG1基因序列与猪附红细胞体MSG1 序列高度相似， MSG1基因与GenBank上登录的德国54/96分离株MSG1(AM40。

36、7404.1)之间的 核苷酸变异率在 1.7 3.5之间， 而 MPG1 基因与 GenBank 上登录的 MSG1(AM407404.1) 之间的核苷酸相似性为96.698.2， 变异率在1.83.4之间， 氨基酸的相似性为 98.2 100之间。见下表 2。 0119 表 2 不同株小附红细胞体 MPG1 基因与 MSG1 基因的相似性比较 0120 0121 说 明 书 CN 104232662 A 10 9/25 页 11 0122 注 ： 左下侧为核苷酸序列相似性的比较结果， 右上侧为氨基酸序列相似性的比较 结果。CN、 FX 表示样品来源于上海长宁区某屠宰场， 但为不同批次采集样品。

37、 ； SJ、 JD 分别表 示样品来源于上海市松江区、 嘉定区某屠宰场。MSG1 为 GenBank 上登录的 MSG1 基因序列， 登录号为 AM4074041。加粗部分代表 mpg 基因序列， 非加粗代表 MSG1 基因序列。 0123 3)11 条获得的 MPG1 基因共在 58 个位点上出现突变， 部分核苷酸突变位点见图 3( 图 3 中， CN、 FX 表示样品来源于上海长宁区某屠宰场， 但为不同批次采集样品 ； SJ、 JD 分 别表示样品来源于上海市松江区、 嘉定区某屠宰场 )。其中有 30 个突变点在多个分离株同 时出现， 变异位点发生在核苷酸序列的第 132、 219、 22。

38、2、 286、 327、 339、 387、 390、 432、 444、 447、 490、 558、 598、 651、 690、 723、 732、 756、 757、 782、 792、 849、 867、 886、 870、 934、 951、 954 和 988位， 其中仅有2个突变位点， 即第390位和651位为嘧啶与嘌呤的颠换， 其余均为嘌呤与 嘌呤、 嘧啶到嘧啶的转换， 且上述两个位点的颠换， 均不导致所编码氨基酸的变异 ； 有 2 个 位点存在错义突变， 分别为 261 位氨基酸残基由丙氨酸突变成缬氨酸， 296 位由缬氨酸突变 成异亮氨酸， 其余均为同义突变。此外， 在某。

39、些个别分离株中存在部分氨基酸突变， 部分突 变位点见图 4。图 4 中， CN、 FX 表示样品来源于上海长宁区某屠宰场， 但为不同批次采集样 品 ； SJ、 JD 分别表示样品来源于上海市松江区、 嘉定区某屠宰场。 0124 4)MPG1 基因进化分析 0125 将 GenBank 下载的猪附红细胞体 MSG1 基因与上海地区分离得到的部分猪附红细 胞体 MSG1 基因序列及 MPG1 基因进行系统进化分析， 构建系统发育树 ( 见图 5， 图 5 中， CN、 FX 表示样品来源于上海长宁区某屠宰场， 但为不同批次采集样品 ； SJ、 JD 分别表示样品来 源于上海市松江区、 嘉定区某屠宰。

40、场 )。 0126 系统进化发育树结果显示， 上海地区分离获得的 11 条小附红细胞体 MPG1 基因共 生成 4 个聚簇， 且每个聚簇都由 MSG1 基因与 MPG1 基因共同组成， 这说明在进化上猪源附红 细胞体g1基因保持同步。 除嘉定(JD)部分MPG1与MSG1基因、 松江(SJ)部分MPG1与MSG1 基因形成一个单独的聚簇外， 其余聚簇由来自不同场的 MPG1 与 MSG1 基因混合组成。其中 MPG1-SJ-135 序列与 GenBank 下载的 MSG1 序列成为一个分支， 提示在进化上二者亲缘关系 较近。 0127 实施例 4 猪源附红细胞体实时荧光定量 PCR 检测方法的。

41、建立 0128 (1) 引物和探针的设计 ： 0129 根据小附红细胞体 MPG1 基因全长序列设计一对特异性引物和 TaqMan 探针， 探针 5 端标记的荧光报告基团为 FAM， 3 端标记的淬灭基团为 MGB， 扩增片段长度为 136bp， 是 SEQ ID NO.13 23 中任意一条序列第 658 793 位碱基之间核苷酸序列。所设计的引物 和探针序列如下 ： 0130 MF2 ： 5 -GCTGCTGCAATTGGAAGAGTA-3 (SEQ ID NO.27) ； 0131 MR2 ： 5 -TGATTTCTTCTGCAGAAACAGACT-3 (SEQ ID NO.28) ； 。

42、0132 Probe ： 5 (FAM)-TTGATGGAATTGCACACAGA-3 (MGB)(SEQ ID NO.29)。 说 明 书 CN 104232662 A 11 10/25 页 12 0133 (2) 实时荧光定量 PCR 检测方法的确定 ： 0134 1) 建立荧光定量 PCR 反应体系 ： 10PCR Buffer 2L， MgCl2(50mM)1.2L， dNTP(10mM)0.5L， 上、 下 游 引 物 (10mM) 各 0.5L， 探 针 (10mM)0.2L， Taq 酶 (5U/ L)0.2L， DNA 模板 1L， 用灭菌双蒸水补齐 20L。每个样品检测设置 。

43、3 个重复。 0135 2) 荧光定量 PCR 反应条件 ： Pre-PCR read， 50 1min ； 95变性 10min ； 95变性 15s， 60退火延伸 1min， 共 40 个循环 ； 60延伸 1min。 0136 3) 荧光定量 PCR 标准曲线的绘制 ： 0137 制备包含猪源附红细胞体 G1 全长基因的阳性重组质粒， 采用获得的阳性重组质 粒 DNA 做荧光定量标准品， 测定浓度并并根据下述公式换算成拷贝数 /L 后， 10 倍梯度稀 释， 以 7 个稀释度的质粒标准品建立标准曲线。 0138 0139 注 ： 每个碱基的平均分子量为 660。 0140 4) 荧光定。

44、量 PCR 检测 ： 根据标准曲线分析被检血样中的猪源附红细胞体浓度。 0141 5) 结果显示， 本发明建立的猪源附红细胞体实时荧光定量 PCR 方法检测质粒 DNA 拷贝数在 102 109范围内 ( 图 6， 从左到右依次为样品拷贝数 109拷贝 /L 10 拷贝 / L)， 质粒拷贝数的对数与 Ct 值呈良好的线性关系， 扩增效率百分数达 108.429， 相关系数 R2 0.993( 图 7)。对 11 份小附红细胞体阳性样品进行检测， 结果均成功地获得了扩增曲 线 ( 图 8)。 0142 以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式， 其描述较为具体和详细， 但并不能 因此而理解为对本。

45、发明专利范围的限制。 应当指出的是， 对于本领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改进， 这些都属于本发明的保护范 围。因此， 本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 0143 说 明 书 CN 104232662 A 12 11/25 页 13 0144 说 明 书 CN 104232662 A 13 12/25 页 14 0145 说 明 书 CN 104232662 A 14 13/25 页 15 0146 说 明 书 CN 104232662 A 15 14/25 页 16 0147 说 明 书 CN 104232662 A 16 15/25 。

46、页 17 0148 说 明 书 CN 104232662 A 17 16/25 页 18 0149 说 明 书 CN 104232662 A 18 17/25 页 19 0150 说 明 书 CN 104232662 A 19 18/25 页 20 0151 说 明 书 CN 104232662 A 20 19/25 页 21 0152 说 明 书 CN 104232662 A 21 20/25 页 22 0153 说 明 书 CN 104232662 A 22 21/25 页 23 0154 说 明 书 CN 104232662 A 23 22/25 页 24 0155 说 明 书 CN 1。

47、04232662 A 24 23/25 页 25 0156 说 明 书 CN 104232662 A 25 24/25 页 26 0157 说 明 书 CN 104232662 A 26 25/25 页 27 说 明 书 CN 104232662 A 27 1/6 页 28 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104232662 A 28 2/6 页 29 图 3 说 明 书 附 图 CN 104232662 A 29 3/6 页 30 图 4 说 明 书 附 图 CN 104232662 A 30 4/6 页 31 图 5 说 明 书 附 图 CN 104232662 A 31 5/6 页 32 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 104232662 A 32 6/6 页 33 图 8 说 明 书 附 图 CN 104232662 A 33 。