用于韧带或肌腱修复的方法.pdf

本发明涉及用于在患者中肌腱和/或韧带修复的方法，其包含将补片应用于所述韧带或肌腱，其中所述补片是柔性的和生物相容的且包含支持层和基质层。

权利要求书
1.  一种用于在受试者中韧带或肌腱修复的方法，其包含：
-将补片应用于所述韧带或肌腱，其中
所述补片是柔性的和生物相容的且包含：
-包含胶原的支持层，和
-包含胶原和透明质酸的基质层。

2.  根据权利要求1所述的方法，其中所述支持层为胶原片层。

3.  根据权利要求1或2所述的方法，其中所述支持层包含猪、牛或马心包膜或猪断层皮。

4.  根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述支持层为细胞多孔的。

5.  根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述支持层包含干燥的猪断层皮层。

6.  根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述基质层为多孔胶原层。

7.  根据权利要求6所述的方法，其中所述基质层包含胶原纤维基质。

8.  根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述基质层的胶原包含猪、马、牛或植物来源的胶原。

9.  根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中所述基质层的透明质酸包含天然、非天然透明质酸。

10.  根据权利要求9所述的方法，其中所述基质层的天然透明质酸包含来自细菌发酵来源的，天然、非人类来源的透明质酸。

11.  根据权利要求1-10任一项所述的方法，其中所述基质层包含纤维、粉末、凝胶、或乳膏状悬浮剂形式的透明质酸。

12.  根据权利要求1-11任一项所述的方法，其中所述基质层为散布着胶原纤维和分散入所述胶原纤维空缺空间的天然透明质酸的多孔胶原复合垫。

13.  根据权利要求1-12任一项所述的方法，其中所述基质层进一步包含选自镇痛剂、抗炎剂、抗生素和促进韧带和/或肌腱再生剂中的一种或更多种化合物。

14.  根据权利要求13所述的方法，其中所述促进韧带和/或肌腱再生的剂选自由以下组成的组：生长因子、双醋瑞因、大黄酸、壳聚糖及其衍生物、富血 小板血浆(PRP)和聚乳酸。

15.  根据权利要求1-14任一项所述的方法，其中所述补片进一步包含第三层，其被布置在所述基质层上，使得所述基质层被夹入所述支持层和所述第三层之间。

16.  根据权利要求15所述的方法，其中所述第三层为胶原片层。

17.  根据权利要求15或16所述的方法，其中所述第三层包含猪、牛或马心包膜或猪断层皮。

18.  根据权利要求15-17任一项所述的方法，其中所述第三层是细胞多孔的。

19.  根据权利要求15-18任一项所述的方法，其中所述第三层包含干燥的猪断皮层。

20.  根据权利要求1-19任一项所述的方法，其中所述补片具有0.5-2mm之间的厚度。

21.  根据权利要求1-20任一项所述的方法，其中所述韧带或肌腱选自在上肢和下肢、肩、肘、腕、手、臀、膝、脚和踝中连接至头、颈、脊柱、胸、骨盆的韧带的组，和在上肢和下肢、肩、肘、手、臀、膝、脚和踝中的肌腱的组。

22.  根据权利要求21的方法，其中
a)所述韧带选自由环甲韧带、牙周韧带、晶状体悬韧带、乳房悬韧带、骶髂前韧带、骶髂后韧带、骶结节韧带、骶棘韧带、耻骨下韧带、耻骨上韧带、阴茎悬韧带、掌侧桡腕韧带、桡腕背侧韧带、尺侧副韧带、桡侧副韧带、肩锁韧带、喙锁韧带、十字韧带、前十字韧带(ACL)、外侧副韧带(LCL)、后十字韧带(PCL)，内侧副韧带(MCL)和髌韧带组成的组；或
b)所述肌腱选自由连接至下肢和上肢的肌腱，在胸和腹部区域、脊柱内包含头和颈部的肌腱，在臀和骨盆区域、膝、脚和踝内的肌腱，四头肌肌腱，髌骨肌腱，胫骨前肌和后肌肌腱，腓骨肌腱，跟腱，脚和脚趾的伸肌、屈肌、外展肌和内收肌肌腱，在肩、肘、和手的肌腱，转轴肌腱，肩胛下肌腱，三角肌和胸肌肌腱，肱二头肌肌腱，肱三头肌肌腱，手和手指的伸肌、屈肌、和外展肌和内收肌肌腱组成的组。

23.  根据权利要求1-22所述的方法，其中所述患者受到影响韧带或肌腱的病症的折磨，所述病症包含韧带或肌腱的炎症、自身免疫疾病、感染、应力、应变、断裂、扭伤、撕脱伤、过度拉伸或撕裂。

说明书用于韧带或肌腱修复的方法
技术领域
本发明在于医疗护理装置领域并涉及用于韧带或肌腱修复的方法，其包含韧带或肌腱修复补片的使用。
背景技术
韧带是特化的结缔软组织，其连接不同的器官或组织，并将骨与骨连接。在后一情况下，韧带通过足够的灵活性来向关节提供稳定性，以允许骨的自然运动，然而也是牢固且不可伸展的以防止对被施加力的抵抗。肌腱将肌肉连接至骨骼并且能够经受拉力。此外，在移动过程中肌腱被动地调节力，在无主动功时提供额外的稳定性。其弹性允许肌腱以高效率存储和恢复能量。在肌腱和韧带中，胶原纤维束被嵌入由蛋白多糖组分构成的连接基质中。这些胶原纤维束提供承载元件。在肌腱内，胶原纤维以几乎平行的构造排布，从而使其能够承受高的单向承载。在韧带内，所述胶原纤维较不平行的构造排布，从而使它们能够经受在一个方向上的主要拉应力和在其它方向上较小的应力。
每年，成千上万的人扭伤、撕裂或断裂韧带，尤其在膝、肩和踝，或遭受上肢和下肢的肌腱的损伤，尤其在肩、膝、脚和踝。经常被这些类型的损伤影响的一种这样的韧带是膝前十字韧带(ACL)。所述ACL作为胫骨前移的主要稳定器和作为膝外翻-内翻偏角的第二稳定器，且往往对与运动损伤和交通事故相关的屈曲-旋转外翻力造成的断裂和撕裂敏感。断裂或撕裂通常导致：移动的严重限制；疼痛和不适；以及无法参加运动和锻炼。每年在美国有多于200000人撕裂或断裂其ACL，导致近30亿美元的费用用于ACL重建手术和长期康复。
众所周知ACL具有不良的愈合能力。当ACL遭受导致关节不稳定的显著撕裂或断裂时需要外科的全置换和重建。最常见的做法是通过用患者自身组织，也称为自体移植物替换被撕裂的韧带来重建所撕裂的ACL。用于替换韧带的其 他选项包括来自另一生物体的供体组织，也被称为异体移植物，以及合成移植物。然而，存在与这些治疗相关的各种问题。
外科医生们认为韧带的结构包括胶原纤维、生物可降解聚合物及其复合材料。例如国际专利申请WO95/2550描述了来自ACL和皮肤的成纤维细胞产生的用于ACL重建的胶原支架。Murray等人的美国专利申请第20020123805号描述了包括由胶原或其它材料制成的诱导核的三维支架组合物的对修复断裂的前十字韧带(ACL)的用途，以及将所述组合物结合至断裂的前十字韧带的方法(另参见美国专利申请第20040059416号)。WO2007/087353公开了用于修复撕裂或断裂韧带的三维支架。所述支架可由蛋白质制成，且可以用修复材料诸如水凝胶或胶原进行预处理。Murray等人的美国专利申请第20080031923号描述了胶原凝胶和应用于撕裂韧带以修复所述韧带的胶原-MATRIGELTM凝胶。这些胶原基质多是单组分装置。
一些多组分韧带假体已被描述(参见，例如，美国专利第3,797,047；4，187,558；4,483,023，4,610,688和4,792,336号)。美国专利第4,792,336号公开了一种具有包括乙醇酸或乳酸酯键的可吸收组分的装置，且该装置的剩余部分包括不可吸收组分。该装置包括多个包含可吸收组分的纤维，其可被用作韧带或肌腱修复中的平编织带。通过增加最终编织带的纤度(denier)来获得所需的拉伸强度。美国专利第5,061,283号描述了一种用于韧带修复包含聚对苯二甲酸乙二酯和聚酯/聚醚嵌段共聚物的双组份装置。美国专利第5,263,984号描述了一种假体韧带，其为两种密度的生物可再吸收的丝状体的复合体。然而，本领域内仍然有对促进细胞向内生长和移植组织的化生转换以获得功能性强的新韧带/肌腱的韧带和肌腱修复方法的需求。
发明内容
本发明提供了一种用于在韧带/肌腱损伤(例如关节韧带损伤)中韧带或肌腱修复、再生或重建的方法，其包括在受损的韧带/肌腱区域位点移植支持细胞向内生长和新的组织形成的生物相容性修复补片。
本发明涉及一种用于在患者中韧带或肌腱修复的方法，其包括将补片应用于所述韧带或肌腱的步骤，其中所述补片是柔性的和生物相容的，且包括包含胶原的支持层，和包含胶原和透明质酸的基质层。
在此方法的多个实施方案中，所述支持层为胶原片层。
在此方法的特定实施方案中，所述支持层包含猪、牛或马心包膜或猪断层皮。
在此方法的一些实施方案中，所述支持层是细胞多孔性的。
在此方法的多种实施方案中，所述支持层包含干燥的猪断层皮(Xenoderm)层。
在此方法的一些实施方案中，所述基质层为多孔的胶原层。
在此方法的特定实施方案中，所述基质层包含胶原纤维基质。
在此方法的特定实施方案中，所述基质层的胶原包含猪、马、牛或植物来源的胶原。
在此方法的一些实施方案中，所述基质层的透明质酸包含天然的，非人类来源的透明质酸。
在此方法的多种实施方案中，所述基质层的天然透明质酸包含来自细菌、发酵来源的天然、非人类来源的透明质酸。
在此方法的特定实施方案中，所述基质包含纤维、粉末、凝胶或乳状混悬液形式的透明质酸。
在所述方法其他的实施方案中，所述基质层为散布着胶原纤维和分散入所述胶原纤维空缺空间的天然透明质酸的多孔胶原复合垫。
在该方法的一些实施方案中，所述基质层进一步包含选自镇痛剂、抗炎剂、抗生素和促进韧带或肌腱再生剂中的一种或多种化合物。
在该方法的特定实施方案中，促进韧带或肌腱再生的剂选自由以下组成的组：生长因子、双醋瑞因、大黄酸、壳聚糖及其衍生物、富血小板血浆(PRP)和聚乳酸。所述生长因子可以选自但不限于由以下组成的组：成纤维细胞生长 因子(FGF)，转化生长因子(TGF-β1)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，肝细胞生长因子(HGF)，血液，骨形态发生蛋白(BMP)，骨诱导因子(IFO)，纤连蛋白(FN)，内皮细胞生长因子(ECGF)，牙骨质附着提取物(CAE)，酮色林，人生长激素(HGH)，动物的生长激素，表皮生长因子(EGF)，人α凝血酶，胰岛素样生长因子(IGF-I)，血小板衍生生长因子(PDGF，PDGF-AB)，牙周韧带趋化因子(PDLGF)和生长激素。
在另一个实施方案中，所述剂包括活细胞，例如成纤维细胞和/或干细胞。当使用干细胞时，在特定实施例中，人胚胎干细胞被排除在外。
在所述方法的其他实施方案中，所述补片进一步包含第三层，其被布置在所述基质层上，使得所述基质层被夹入所述支持层和所述第三层之间。
在所述方法的一些实施方案中，所述第三层为胶原片层。
在所述方法的特定实施方案中，所述第三层包含猪、牛或马心包膜或猪断层皮。
在所述方法的进一步实施方案中，所述第三层是细胞多孔性的。
在所述方法的特定实施方案中，所述第三层包含干燥的猪断层皮(Xenoderm)层。
在所述方法的一些实施方案中，所述补片具有0.5-2mm之间的厚度。
在所述方法的其他实施方案中，所述韧带或肌腱选自在上肢和下肢中例如肩、肘、腕、手、臀、膝、脚和踝中连接至头、颈、脊柱、胸、骨盆的韧带的组，和在上肢和下肢中特别是肩、肘、手、臀、膝、脚和踝中的肌腱的组。
在所述方法的特定实施方案中，所述韧带选自由环甲韧带、牙周韧带、晶状体悬韧带、乳房悬韧带、骶髂前韧带、骶髂后韧带、骶结节韧带、骶棘韧带、耻骨下韧带、耻骨上韧带、阴茎悬韧带、掌侧桡腕韧带、桡腕背侧韧带、尺侧副韧带、桡侧副韧带、肩锁韧带、喙锁韧带、十字韧带、前十字韧带(ACL)、外侧副韧带(LCL)、后十字韧带(PCL)，内侧副韧带(MCL)和髌韧带组成的组。
在所述方法的多种实施方案中，所述肌腱选自由以下组成的肌腱的组，但不限于，连接至下肢和上肢的肌腱，在胸和腹部区域、脊柱内包括头和颈部的肌腱，在臀和骨盆区域、膝、脚和踝内的肌腱，以及四头肌腱，髌骨肌腱，胫骨前和后肌腱，腓骨肌腱，跟腱，脚和脚趾的伸肌、屈肌、外展肌和内收肌肌腱，在肩、肘、和手的肌腱，转轴肌腱，肩胛下肌腱，三角肌和胸肌肌腱，肱二头肌肌腱，肱三头肌肌腱，手和手指的伸肌、屈肌、和外展肌和内收肌肌腱。还包括任意其他的韧带和肌腱。
在所述方法的一些实施方案中，所述患者受到影响韧带或肌腱的病症的折磨，包括韧带或肌腱的炎症、自身免疫疾病、感染、应力、应变、断裂、扭伤、撕脱伤、过度拉伸或撕裂。
附图说明
图1显示了用于本发明所述方法的包括形成层叠体12的两层，支持层22和基质层30的可消毒的、柔性的层叠体韧带或肌腱修复补片10的剖视图，其详细描述所述补片的所述基质的构成，其中所述胶原和透明质酸被布置成纤维且所述支持层是多孔的(图1A)或非多孔的(图1B)。
图2显示了用于本发明所述方法的包括两或三层的所述可消毒的、柔性的层叠体韧带或肌腱修复补片的特定实施方案的侧面剖视图，2A中详细描述所述补片的基质的构成，其中所述胶原和透明质酸被布置成纤维，2B中详细描述了所述补片的内层基质的构成，其中所述胶原被布置成纤维且所述透明质酸被布置成乳状混悬液或粘弹溶液，2C中显示在各层中均具有机械稳定特征的支持层和第三层，2D中显示具有有机械稳定特征的支持层的一个实施方案，且2E显示其中所述支持层之中具有复杂机械稳定特征的一个实施方案。
图3显示了用于本发明所述方法的包含支持、基质和第三层的可消毒的、柔性的层叠体韧带或肌腱修复补片的一个实施方案的侧面剖视图。层22是多孔支持层，其中层16可选地为闭合或多孔的。该基质结构类似于在图2E中突出显示的那些。
图4显示了本发明的补片(A层)对移植物一种可能的应用程序，其中使用注入所述移植物和所述补片和环形螺线之间的自体生长因子增强胶将所述补片固定于所述移植物。如果所述补片由支持层和基质层组成，其可以将所述基质或支持层面向该损伤部位施用，其中一些实施方案中优选基质层面向所述损伤部位。在其他实施方案中，如果所述补片包含支持、基质和第三层，所述补片可将所述支持或第三层面向所述受伤部位施用。示例性的补片详见图1A，1B，2A-2E和3。
图5显示了没有骨附着物的韧带或肌腱移植物的另一个示意图。本发明所述补片(层A)例如，如图1A，1B，2A-2E和3中详述的补片，被切割成大致对应于所述移植物的尺寸的长度和宽度。使用注入所述移植物和所述补片和环形螺线之间的自体生长因子增强胶将所述补片固定于所述移植物。
图6显示了从纤维蛋白血块(59)迁移进入受损的肌腱/韧带(61)和进入分化为成纤维细胞(62)的修复补片基质(12)的祖细胞(60)。图6a：肌腱/韧带修复补片侧视图；图6b：肌腱/韧带修复过程的横截面。
发明详述
韧带和肌腱修复领域中面临的一个问题是如何促进在韧带或肌腱损伤的部位韧带或肌腱组织的再生。
本文所用术语“韧带或肌腱损伤”指影响所述韧带或肌腱的慢性或急性病况。韧带或肌腱损伤的实例为韧带或肌腱的炎症、自身免疫性疾病、感染、应力、应变、断裂、扭伤、撕脱伤、过度拉伸或撕裂。
本发明的一个目的是提供一种用于韧带或肌腱修复的方法，其引起功能性的、解剖学的韧带或肌腱组织的恢复。
本发明所用术语“韧带或肌腱修复”意味着所述韧带或肌腱损伤、影响所述韧带或肌腱的慢性或急性病况愈合或至少减轻，使得所述韧带或肌腱的功能至少部分恢复或完全恢复。
仅基于合成的非胶原聚合物的已知可吸收假体的缺点为所述假体不能表现 出生物聚合物诸如胶原的有益的损害愈合性质。众所周知损伤愈合细胞诸如成纤维细胞对胶原及其他特定生物聚合物具有特异亲和力。此性质被称为胶原的趋化作用。
本发明基本发明人出乎意料的发现，即包括包含胶原的支持层和包含胶原和透明质酸的基质层的柔性、生物相容补片可有利地用于韧带和肌腱修复，并且可能协同软骨下血和其MSC或增加的成纤维细胞培养和纤维蛋白胶，呈现强有力地增强所述韧带修复过程或所植入的韧带移植物结构转化为新韧带的生物工厂。其也应用于肌腱修复中补片的使用。
因此，本发明涉及一种用于在受试者诸如人类患者中韧带或肌腱修复的方法，其包含将此补片应用于所述受试者的韧带或肌腱。
因此，在特定实施方案中，本发明涉及一种用于在受试者中韧带修复的方法，其包含将此补片应用于所述受试者的韧带。
此外，在多种实施方案中，本发明涉及一种用于在受试者中肌腱修复的方法，其包含将此补片应用于所述受试者的肌腱。
所述受试者可为人类患者。
要求保护的方法是有利的，因为其促进受损的韧带和肌腱或韧带和肌腱移植物的更快再生，因此提供归因于患者更快功能性和解剖学恢复的益处。
此外，所要求保护的方法是有利的，因为所述韧带或肌腱修复方法不需要如现有技术方法所做的细胞培养。然而，在一些实施方案中所述方法可包含修复补片的使用，所述补片包含培养的细胞用于进一步增强韧带或肌腱修复。
在特定实施方案中，本文描述的方法在损伤部位不扩散纤维组织的形成。
因此本发明涉及一种用于在患者内韧带或肌腱修复的方法，其包含将补片应用于所述韧带或肌腱的步骤，其中所述补片是柔性的，生物相容的，且包括包含胶原的支持层，和包含胶原和透明质酸的基质层。
所述补片是生物可接受的，相容的，且易于使用。其具有一个相对快速的凝固时间，并具有所需的粘合和凝聚性质。其为无毒的且非刚性。另外，它不 干扰愈合过程或新的韧带或肌腱组织的形成，并且不促进其他干扰的或不期望的组织的形成。
虽然本发明被描述用于在人类中使用，但是在特定实施方案中本文描述的本发明所述方法可以应用于动物，包括但不限于哺乳动物和鸟类。在多种实施方案中，所述韧带或肌腱修复方法应用于哺乳动物，诸如狗、猫、马、母牛、羊、猪、猴、猿、黑猩猩、人类和其它哺乳动物，其中之一可能要修复受损的韧带或肌腱。然而，此列表并不详尽，且使用者可容易地将此修复补片使用于任何动物。
本文描述的病况的“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”、“修复(repair)”、“修复(repairing)”，“愈合(heal)”或“愈合(healing)”指执行可能包括向受试者(人或其它)施用一种或更多种药物和/或对患者进行外科手术(微创性或其他)的方案，以试图减轻本文所描述病况例如韧带或肌腱的切断或其他类型损伤的迹象或症状。所述术语还包括此病况的预防，例如通过预防复发。当切断的或受损的韧带或肌腱不正常愈合和使关节不稳定且疼痛时，复发可能发生。另外，预防可包括抑制有时在从另一种类型损伤愈合期间发生于韧带的瘢痕组织和/或粘连的形成。此外，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”不需要迹象或症状的完全减轻，并且不需要治愈。
在特定实施方案中，所述修复补片由包含天然聚合物和/或合成聚合物的层制成。在多种实施方案中，所述支持层和/或基质层的胶原包含动物或植物来源的胶原。
在特定实施方案中，所述支持层和/或基质层的胶原可从动物，优选哺乳动物诸如狗、猫、马、母牛、羊、猪、猴、猿、黑猩猩，或人类获得。在特定实施方案中，采用自体修复补片，其中所述胶原是从使用所述用于韧带或肌腱修复的修复补片治疗的受试者制备。在这些实施方案中，可从人类患者分离胶原以制备之后植入该患者用于韧带或肌腱修复的补片。
胶原的来源是胶原组织，其在哺乳动物内包括皮肤(隐藏)、肌腱、肠、阔 筋膜、心包和脑硬膜。获得胶原的一种可能性是小肠的粘膜下层的使用。胶原层可以从牙本质和皮质骨制备，例如从猪或牛的牙本质和皮质骨。
例如，所述胶原可为I、II、III、IV、V、IX或X型。优选地所述胶原为I型。
I型胶原是人类前十字韧带细胞外基质的主要组分，并提供制造生物工程支架的选择的实例。胶原主要以纤维形式出现，通过改变体积分数、纤维取向以及胶原的交联程度允许具有非常不同的机械性质的材料的设计。还可通过改变孔尺寸、交联的程度，以及另外的化合物诸如糖胺聚糖、生长因子和细胞因子的使用，来改变细胞渗透率和支架降解的生物性质。在特定实施方案中，本文所公开的基于胶原的层是从患者自身的皮肤制造，因而最小化植入物的抗原性。
细胞因子是由许多细胞分泌的小细胞信号蛋白分子。细胞因子可以是蛋白、肽或糖蛋白。基于其假定的功能、分泌细胞或作用靶点，细胞因子已被分类成淋巴因子、白细胞介素和趋化因子。细胞因子的组包括，但不限于IL-2、IL-4、γ干扰素(IFN-γ)、TGF-β、IL-10、IL-13，促红细胞生成素(EPO)、促血小板生成素(TPO)、IL-17和IL-18。
在多种实施方案中，所述支持层为胶原片层。
在特定实施方案中，所述支持层优选为生物相容的、生物可降解的、亲水性的、非反应性的和/或能够具有或具有限定的结构。
在特定实施方案中，所述支持胶原片层可为多孔或非多孔的。
在本发明的意义上多孔的意味着所述层是细胞可渗透的，且因此包含细胞可通过其迁移的孔。在特定实施方案中，所述支持层具有其直径为1μm-2mm的孔。
在另一方面，非多孔层不包含细胞能够通过其迁移的孔。在特定实施方案中，所述非多孔层包含分子能但细胞不能够通过其迁移的孔。可渗透该层的分子仅可能是小分子，诸如水或营养物，诸如葡萄糖，或者，也可为更大的分子，诸如蛋白质。在其他实施方案中，所述非多孔层是完全不渗透的。在特定实施 方案中，所述支持胶原片层是细胞多孔的。
此外，在多种实施方案中用一种或多种剂涂覆或浸渍所述支持层以提高韧带或肌腱修复，所述剂诸如透明质酸、血管生成因子、生长因子、抗炎化合物、细胞因子和/或胶原酶抑制剂。这些剂可以立即扩散到体内直达修复位点和/或随时间释放或在所述支持层驻留。对于后者的效果，所述剂可配制成控释制剂，诸如持续释放制剂或延迟释放制剂。
在多种实施方案中，所述支持层包含心包膜或断层皮。
所述心包膜可选自包括但不限于狗、猫、马、母牛、猪、猴、猿、黑猩猩、羊或人类心包膜的组。
所述断层皮可选自包括但不限于狗、猫、马、母牛、猪、猴、猿、黑猩猩、羊或人类断层皮的组。
在多种实施方案中，所述支持层包含猪心包膜或猪断层皮。在一些实施方案中，所述支持层包含干燥的猪断层皮。
在胶原支持层中的孔可以是天然来源的，也可以是所述胶原层的制备后进行的处理的结果。例如，可通过冲压，冲孔，冲切和/或冲裁将孔引入支持层。
在一个实施方案中，所述支持层包含心包膜，其最初是非多孔的或基本上无孔的，且其经受将孔引入该膜的处理。此处理实现心包膜制成的细胞多孔胶原层的供应。例如，可通过冲压，冲孔，冲切和/或冲裁将孔引入所述心包膜。在特定实施方案中，所述支持层包含细胞多孔心包膜，其选自包括但不限于狗、猫、马、母牛、猪、猴、猿、黑猩猩、羊或人类细胞多孔心包膜的组。在特定实施方案中，所述支持层包含细胞多孔猪心包膜。
在多种实施方案中，所述支持层包含干燥的断皮层，其中所述断皮层可选自狗、猫、马、母牛、猪、猴、猿、黑猩猩、羊或人类来源。在一个实施方案中，所述支持层包含干燥的猪断皮层(Xenoderm)。
因此，如图1A和1B所示，本发明中采用的修复补片可以是包含两层的可植入的韧带或肌腱修复补片10，其为生物相容的和生理学上可吸收的，并且在 原位起作用以促进韧带或肌腱损伤部位中韧带或肌腱组织的再生。本韧带或肌腱修复补片10为可以在损伤部位植入并作用于促进韧带或肌腱组织再生的柔性层压板12。韧带或肌腱修复补片10的目的是刺激韧带或肌腱组织的原位修复，例如在患有韧带和/或肌腱损伤的患者中所述韧带或肌腱修复布片10的关节镜或开放性外科手术应用后。所述补片可由支持层(1A多孔，1B非多孔)，和包含胶原纤维36、透明质酸纤维40、双醋瑞因46a和大黄酸46b的基质层30组成。
在特定实施方案中，所述韧带或肌腱修复补片10通过其成分与胶原酶和其它蛋白酶的相互作用是生物可降解的，且将随时间被再吸收并消失。在这种情况下，所述韧带或肌腱修复补片10的层叠体12完全以既生物相容且生理上可吸收的材料构成，以使所述韧带或肌腱修复补片可被植入到患者内，并随时间从植入部位消失。
一般而言，基质层可由天然的或合成的材料制成。合成基质主要由聚合材料制成。合成基质提供一系列谨慎限定的化学成分和结构布置的优势。一些合成的基质是不可降解的。虽然所述不可降解的基质可有助于修复，但不可降解的基质不能被重塑代替，因此往往不能用以完全再生韧带或肌腱。由于与磨损颗粒的生成相关的问题，在关节内永久遗留外来材料也是不期望的，因此可降解材料是优选的。可以设计可降解的合成的基质来控制降解速率。
在特定实施方案中，所述基质层包含胶原和透明质酸且是例如通过炎症过程的滑液和分解酶来制备，以使得其优选为可压缩和/或弹性的并具有降解抗性。滑液作为正常的关节活动的一部分，自然地预防血块形成。
基质层可以是固体材料，以便维持其形状，或是能够改变其形状和/或尺寸的半固体材料。基质层可制成为可膨胀材料允许其视需要收缩或膨胀。在特定实施方案中，所述基质层能够吸收所述基质层与之接触的或被添加至所述基质层的血浆、血液、其它体液、细胞、蛋白质、聚合物、液体、凝胶或其它材料。
在其他实施方案中，所述基质层为多孔胶原层。在特定实施方案中，所述 胶原基质层的孔是细胞多孔的。
在特定的实施方案中，所述胶原基质层由胶原纤维或高度交联的胶原制成。
在特定的实施方案中，所述基质层包含胶原纤维基质。
所述基质层的胶原可选自动物或植物来源。
在特定实施方案中，所述基质的胶原选自包括但不限于狗、猫、马、母牛、羊、猪、猴、猿、黑猩猩、羊、人类或植物来源胶原的组。
在多种实施方案中，所述基质层的胶原包含猪、马、牛或植物来源的胶原。
在特定实施方案中，所述胶原基质层包含胶原的生物可接受的溶胶-凝胶、凝胶、纤维基质、海绵状物、泡沫状胶原、支架、蜂窝状物，水凝胶，或聚合物网状物。
在多种实施方案中，所述基质为简单的溶胶-凝胶溶液，在特定情况下从液体(溶胶)转变成固体材料(凝胶)的胶体混悬液。所述溶胶是通过加热转变成凝胶的水性胶原混悬液。
在多种实施方案中，所述基质层包含可从I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX型和/或X型胶原制备的胶原。在特定实施方案中，所述基质层由I型胶原，II型胶原，IV型胶原，含有蛋白多糖、糖胺聚糖或糖蛋白和/或明胶的细胞收缩的胶原制成。在多种实施方式中，所述基质层进一步包含琼脂糖、芳香族有机酸聚合物、纤连蛋白、层粘连蛋白、生物活性生长因子、抗炎化合物、细胞因子、弹性蛋白、纤维蛋白、天然和/或由聚合酸制成的合成聚合纤维，所述聚合酸诸如聚乳酸、聚乙醇酸或聚氨基酸、聚己内酸酯、聚氨基酸，多肽凝胶、它们的共聚物及它们的组合。在特定实施方案中，所述基质包含凝胶溶液基质，其可为聚合的热可逆凝胶化的水凝胶。
在多种实施方式中，所述基质层被天然或非天然的聚合物涂覆。该涂层包含凝胶，具体为水凝胶，选自由海藻酸钠、透明质酸、交联透明质酸、交联海藻酸钙和海藻酸钙交联的透明质酸的混合物组成的组。
透明质酸，又称为玻尿酸或玻尿酸盐，是一种糖胺聚糖。其为来自细菌至 更高级动物包括人类的，具有生物学功能的天然存在的生物聚合物。在动物中，它是细胞外基质的主要组分之一。它显著有助于细胞增殖和迁移，并且还可能涉及某些恶性肿瘤的进展。玻尿酸天然发现于身体的许多组织诸如皮肤、软骨和玻璃体液。因此，它非常适合于靶向这些组织的生物医学应用。可在本发明中使用的玻尿酸可为任何分子量，例如从约100kDa至几百万Da，优选500kDa至6000kDa之间。在多种实施方案中，所述基质层的透明质酸包含天然透明质酸。在特定实施方案中，所述基质的透明质酸选自包括但不限于狗、猫、马、母牛、猪、猴、猿、黑猩猩、羊、人，植物或微生物来源的透明质酸的组。
在多种实施方案中，所述基质层的透明质酸包含天然、非天然的透明质酸。
在特定实施方案中，所述基质层的天然透明质酸包含来自细菌发酵来源的天然、非人类来源的透明质酸
涉及兽疫链球菌株的透明质酸(HA)细胞生产首次描述于1989年，造成发酵透明质酸的首次商业化生产。
Novozymes商品名为HyaCare的超高纯的透明质酸钠通过新型非致病菌株枯草芽孢杆菌的发酵来制备，来自其的产品是公认安全的(GRAS)。
在特定实施方案中，所述透明质酸可以是兽疫链球菌或枯草芽孢杆菌来源的。
在多种实施方案中，所述基质包含纤维、粉末、溶液、凝胶或乳状混悬液形式的透明质酸。
在特定实施方案中，所述胶原基质被浸入透明质酸溶液或凝胶。从而所述基质被所述透明质酸分散。
在多种实施方案中，所述基质层包含与透明质酸共聚合的胶原。
在本发明的方法中采用的修复补片可包含在韧带或肌腱修复中有利的一定的胶原与HA重量范围比。在特定实施方案中，如果HA具有0.5至6百万道尔顿之间的分子量，胶原与HA的重量范围比为约0.1:99.9至约50:50。
在特定实施方案中，所述基质层是散布着胶原纤维和分散入所述胶原纤维 空缺空间的天然透明质酸的细胞多孔胶原复合垫。
在一些实施方案中，所述基质层包含胶原，透明质酸和聚乳酸，例如，聚-L-乳酸。例如，所述基质层可以是散布着胶原纤维和分散入所述胶原纤维空缺空间的天然透明质酸和聚乳酸例如聚-L-乳酸的细胞多孔胶原复合垫。
基质层可进一步包含蛋白质、冻干的材料或任何其他合适的材料。在此上下文中，蛋白质可以是合成的、生物可吸收的或天然存在的蛋白质。在多种实施方案中，所述基质层包括选自细胞外基质蛋白的组的蛋白质。细胞外基质蛋白的组包括，但不限于纤维蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白。
冻干材料是当液体、凝胶或其他流体被加入或与其接触时能够溶胀的材料。
在多种实施方案中，所述基质层进一步包含糖胺聚糖(GAG)、玻尿酸组分、和各种合成的组分。
胶原-糖胺聚糖(CG)共聚物已成功地用于真皮和外周神经的再生。已将制作成海绵状和纤维状支架的多孔天然聚合物作为植入物研究，以促进选定的肌肉骨骼组织包括韧带和肌腱的再生。支架诸如海绵支架，也可以由肌腱(异种移植物、同种异体移植物、自体移植物)或韧带或皮肤或其他结缔组织制成，其可以是在天然状态的或被处理以促进细胞向内生长或其它生物学特性的。
在多种实施方案中，所述基质层包含胶原-糖胺聚糖(CG)共聚物。
糖胺聚糖(GAG)或粘多糖是由与己糖醛酸或己糖部分以糖苷键结合且或多或少有规则地交替的己糖胺残基组成的多糖，。GAG是动物来源的，具有组织特异性分布(参见例如Dodgson等人，碳水化合物代谢及其障碍，Dickens等人编辑，Vol.1，科学出版社(1968))。同GAG的反应还提供胶原另一种有价值的性质，即无法引起来自动物宿主的免疫反应(异物反应)。
在特定实施方案中，所述基质包含GAG，其包括但不限于含有硫酸基团的那些诸如透明质酸、肝素、硫酸肝素，6-硫酸软骨素，4-硫酸软骨素，硫酸皮肤素和硫酸角蛋白。
其他的GAG也可适用于形成本文所描述的基质，本领域技术人员仅使用常 规实验将了解或者能够确定其它合适的GAG。为更详细描述粘多糖，请参见Aspinall,多糖，Pergamon出版社，牛津(1970)。
在特定实施方案中，所述基质包含至少一种或更多种胶原-GAG共聚物，其包括但不限于透明质酸、肝素、硫酸肝素、6-硫酸软骨素、4-硫酸软骨素、硫酸皮肤素和硫酸角蛋白。
在本发明的特定方面，所述基质层包含海绵状体或海绵样结构。
建立所述海绵支架的材料可以是亲水性的。海绵支架视需要能够压缩和扩张。例如，在植入修复部位之前或期间，海绵支架可以是压缩的。压缩的海绵支架允许海绵支架在所述修复部位之内扩张。当放置在修复部位且在该位置只扩张一次时海绵状体可以是被冻干的和/或压缩的。在与所述修复部位或添加至所述修复部位的血液或其它流体接触后，可能出现海绵支架的扩张。海绵支架可为多孔的。在植入修复部位之前海绵支架可以是饱和的或涂覆有液体、凝胶或水凝胶修复材料。海绵支架的涂覆或饱和可易化向相对不确定的缺损区域内的植入，以及有助于填补特别大的缺损区域。在一个优选的实施方案中，海绵支架用水凝胶处理。根据本发明有用的支架和修复材料的实例可发现于美国专利第6,964,685号和美国专利申请第2004/0059416和2005/0261736号，各个申请的全部内容都通过引用并入本文中。在本申请文件中公开的所有基质涂层特此明确地公开作为海绵支架基质适合的涂层。
在多种实施方案中，胶原建立海绵支架。
在多种实施方案中，所述基质层进一步包含来自以下聚合物的一种或更多种：天然或合成聚合物、可再吸收或不可再吸收聚合物。
可再吸收的聚合物的实例包括，但不限于，聚(α羟基酸)，聚丙交酯-共-乙交酯(PLGA)，聚丙交酯(PLA)，聚乙交酯(PG)，聚(α羟基酸)的聚乙二醇(PEG)的共轭物，聚原酸酯，聚阿司匹林，聚磷腈，弹性蛋白，丝，纤维素淀粉，壳聚糖，明胶，藻酸盐，环糊精，聚右旋糖，右旋糖酐，乙烯吡咯烷酮，聚乙烯醇(PVA)，PVA-g-PLGA，聚乙二醇对苯二甲酸酯和聚丁烯对苯二 甲酸酯(PEGT-PBT)共聚物(polyactive)，甲基丙烯酸酯，聚(N-异丙基丙烯酰胺)，聚乙烯氧化物(也称作聚氧化乙烯或PEO)，聚丙烯氧化物(也称为聚氧化丙烯或PPO)，聚(天冬氨酸酸)(PAA)，PEO-PPO-PEO(Pluronics(R),BASF)，BASF)，PEO-PPO-PAA共聚物，PLGA-PEO-PLGA，聚磷酸酯，聚酸酐，聚酯-酸酐，聚氨基酸，聚尿烷-酯，聚膦嗪，聚己内酯，聚三亚甲基碳酸酯，聚二噁烷酮，聚酰胺酯，聚缩酮，聚缩醛，糖胺聚糖，硫酸软骨素，透明质酸酯，聚乙烯-乙酸乙烯酯，有机硅，聚尿烷，聚丙烯富马酸酯，聚去氨基酪氨酸碳酸酯，聚去氨基酪氨酸芳基化物，聚去氨基酪氨酸酯碳酸酯，聚去氨基酪氨酸酯芳基化物，聚邻位碳酸酯，聚碳酸酯，或其共聚物或物理共混物及其的组合。
术语“壳聚糖”和“壳聚糖及其衍生物”指包括但不限于壳聚糖，壳聚糖盐酸盐，羧甲基壳聚糖，壳聚糖乳酸盐，壳聚糖乙酸盐，壳聚糖谷氨酸盐，壳聚糖琥珀酸盐，N-(2-羟基)丙基-3-三甲基铵壳聚糖氯化物，N-三亚甲基壳聚糖氯化物，及其药学上可接受的盐的化合物的组。
不可再吸收的聚合物可包括但不限于，聚乙烯，聚甲醛，有机硅，聚尿烷，有机硅和聚尿烷共聚物，聚烯烃诸如聚异丁烯和聚异萜烯，丙烯酰胺诸如聚丙烯酸和聚(丙烯腈-丙烯酸)，氯丁橡胶，腈，丙烯酸酯诸如聚丙烯酸酯，聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)，甲基丙烯酸甲酯，2-羟乙基甲基丙烯酸酯，以及丙烯酸酯和N-乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基内酰胺、丙烯酰胺、聚尿烷和聚丙烯腈共聚物，聚葡甘露聚糖凝胶，烷基纤维素，羟基烷基甲基纤维素，硫化橡胶及其组合。聚尿烷的实例包括热塑性聚尿烷，脂肪族聚尿烷，链段聚尿烷，亲水聚尿烷，聚醚-尿烷，聚碳酸酯-尿烷和有机硅聚醚尿烷。本文所描述的硫化橡胶可例如通过利用根据例如Summers等人U.S.专利第5,245,098号中描述从1-己烯和5-甲基-1,4-己二烯生产的共聚物的硫化工艺来生产。
其它合适的不可再吸收的材料包括但不限于轻度或高度交联的生物相容的均聚物和亲水性单体诸如2-羟基烷基丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯，N-乙烯基单体，和乙烯不饱和的酸和碱的共聚物；聚氰基丙烯酸酯，聚乙烯氧化物-聚丙二醇嵌 段共聚物，聚半乳糖醛酸，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯乙酸酯，聚亚烷基二醇，聚乙烯氧化物，磺化聚合物，乙烯醚单体或聚合物，海藻酸盐，聚乙烯基胺，聚乙烯基吡啶和聚乙烯咪唑。
在特定实施方案中，以上聚合物与所述基质层的胶原和/或透明质酸交联。
本领域技术人员清楚知道根据所述生物可吸收的聚合物中的交联的量，可减少所述聚合物的降解时间，因而允许基质降解的速率的控制。
在多种实施方案中，所述基质层进一步包含一种或更多种选自止痛剂，抗炎剂，抗生素和促进韧带或肌腱的再生的剂的化合物。
这些化合物在本发明的意义上选自包含但不限于小分子、蛋白质、RNA、DNA、PNA的组。
因此，所述基质可以掺入治疗蛋白质，其包括但不限于激素，细胞因子，生长因子，抗炎化合物，凝血因子，抗蛋白酶的蛋白质例如α-1抗胰蛋白酶，血管生成蛋白例如血管内皮生长因子，成纤维细胞生长因子，抗血管生成蛋白例如内皮抑制素，血管抑制素，以及其它存在于血液中的蛋白质，骨形态发生蛋白(BMP)，骨诱导因子(IFO)，纤连蛋白(FN)，内皮细胞生长因子(ECGF)，牙骨质附着提取物(CAE)，酮色林，人生长激素(HGH)，动物生长激素，表皮生长因子(EOF)，人α凝血酶，转化生长因子(TGF-β)，胰岛素样生长因子(IGF-1)，血小板衍生生长因子(PDGF)，成纤维细胞生长因子(FGF、bFGF等)，以及用于治疗目的的牙周韧带趋化因子(PDLGF)，生长素，以及细胞外基质蛋白，包括但不限于纤维蛋白，弹性蛋白，纤连蛋白，层粘连蛋白。
抗炎化合物是在给定部位降低或预防炎症反应的化合物。抗炎化合物的组包括，但不限于双醋瑞因和大黄酸。
双醋瑞因46a和大黄酸46b(参见图1和2)抑制炎性细胞因子诸如白细胞介素-1(IL-1)，IL-6，一氧化氮(NO)，肿瘤坏死因子α(TNF-a)，ADAMTS(具有血小板反应蛋白基序的解酵素和金属蛋白酶)，自由基和基质金属蛋白酶(它们均参与炎症和韧带和肌腱的破坏)的产生和活性。双醋瑞因46a和大黄 酸46b也刺激生长因子诸如TGF-β的产生，其转而刺激韧带和肌腱组分的表达，所述韧带和肌腱组分诸如透明质酸，蛋白聚糖，聚集蛋白聚糖和胶原酶II，它们全都为韧带和肌腱组织的重要组分。生长激素还将刺激韧带和肌腱组织的生长。
在特定实施方案中，所述基质包含选自包括但不限于阿司匹林，对乙酰氨基酚，双氯芬酸，布洛芬和水的组的小分子。
在特定实施方案中，所述促进韧带或肌腱再生的剂选自由生长因子，双醋瑞因，大黄酸，壳聚糖，富血小板血浆(PRP)和聚乳酸组成的组。因此，在一些实施方案中，所述基质层包含或由胶原，透明质酸和壳聚糖或壳聚糖类组成。
在多种实施方案中，双醋瑞因和/或大黄酸在所述补片中的含量为约300ng至5mg的范围内。在某些实施方案中，双醋瑞因和/或大黄酸在所述补片中的含量为300ng至75μg的范围内。在一些实施例中，双醋瑞因和/或大黄酸在所述基质层中的含量为选自由300ng至5mg，300ng至1mg，300ng至750μg，300ng至500μg，300ng至250μg，300ng至100μg，300ng至75μg，300ng至50μg，300ng至25μg，300ng至10μg，300ng至5μg，300ng至2，5μg，以及300ng至1μg组成的组的范围内。
所述双醋瑞因和/或大黄酸可以以粉末形式、作为溶液或作为含有双醋瑞因和/或大黄酸的HA凝胶或乳膏添加至所述基质
阴离子聚合物也可用于抑制纤维化，疤痕或粘连。在特定实施方案中所述基质进一步包含阴离子聚合物。阴离子聚合物的组包括但不限于硫酸右旋糖酐，戊聚糖，壳聚糖。
所述基质层可进一步包括血液。所述术语血液包括全血、血浆、血清和从血液中分离的组分，并可以是自体的或异种来源。在特定实施方案中，所述修复补片首先用血液浸透，使得所述基质层包括血液，然后应用到受损的韧带或肌腱。在替代的实施方案中，首先将所述修复补片应用到受损的韧带或肌腱，然后血液被添加至所附补片或从损伤部位接收，使得所述基质层包含血。特别地，所述修复补片的基质层可以包含血清，其在所述补片应用至损伤韧带或肌 腱之前或之后应用至所述补片。
本发明的意义上的血浆包括血液细胞组分分离后剩下的血液的部分。此部分对应于约55％的血体积。血浆包含水，蛋白质，碳水化合物，电解质，脂肪及脂质。血浆蛋白的组包含免疫球蛋白，白蛋白，激素和凝血因子。凝血因子的组包含纤维蛋白原(因子I)，纤维蛋白(因子Ia)，凝血酶原(因子Ⅱ)，凝血酶(因子IIa)，促凝血酶原激酶(也称为组织因子，TF或因子Ⅲ)，促凝血球蛋白原(因子V)，前转化素(因子VII)，抗血友病球蛋白A(因子VIII)，抗血友病球蛋白B(也称为因子IX或Christmas因子)，Stuart-Prower因子(因子X)，血浆凝血激酶前质(也称为PTA，因子XI或Rosenthal因子)，Hageman因子(因子XII)和纤维蛋白稳定因子(因子XIII)。凝血因子的组包含凝血因子失活和激活的变体。本领域技术人员通过添加“a”来标记激活的凝血因子，例如Ia，IIa，IIIa，VIIa,VIIIa，IXa,Xa,XIa,XIIa和XIIIa。
血清是血液凝固和血液细胞组分分离后剩下的血液液体部分。基本上，血清的组分对应于减去凝血因子的血浆组分。
在各种实施方案中，所述补片进一步包含第三层，其被布置在所述基质层上，使得所述基质层被夹入所述支持层和所述第三层之间。
在特定实施方案中，所述第三层包括但不限于聚(α羟基酸)，丙交酯-共聚-乙交酯(PLGA)，聚丙交酯(PLA)，聚乙交酯(PG)，聚(α羟基酸)的聚乙二醇(PEG)的共轭物，聚原酸酯，聚阿司匹林，聚磷腈，胶原，弹性蛋白，丝，纤维素淀粉，壳聚糖，明胶，海藻酸盐，纤连蛋白，层粘连蛋白，弹性蛋白，纤维蛋白或其组合。
在多种实施方案中，所述第三层包含胶原片层。
所述胶原片层的胶原的来源可以选自包括但不限于狗、猫、马、母牛、猪、猴、猿、黑猩猩、羊或人的组。
在多种实施方案中，所述第三层包含心包膜或断层皮，例如干燥的猪断层皮。
所述心包膜可选自包括但不限于狗、猫、马、母牛、猪、猴、猿、黑猩猩、羊或人类心包膜的组。
所述断层皮可选自包括但不限于狗、猫、马、母牛、猪、猴、猿、黑猩猩、羊或人类断层皮的组。
在多种实施方案中，所述第三层包含猪、牛或马的心包膜或猪断层皮。
所述胶原第三层可为细胞多孔或非多孔的。
在一些实施方案中，所述胶原第三层为细胞多孔的。
如果所述胶原第三层包含孔，那么在胶原第三层的孔可以是天然来源的，也可以是在所述胶原层的制备后进行的处理的结果。
在一个实施方案中，所述第三层包含心包膜，所述心包膜基本上是无孔的且其经受将孔引入该膜的处理。此处理实现心包膜制成的细胞多孔胶原层的供应。例如，可通过冲压，冲孔，冲切和/或冲裁将孔引入所述心包膜。在特定实施方案中，所述第三层包含细胞多孔心包膜，其选自包括但不限于狗、猫、马、母牛、猪、猴、猿、黑猩猩、羊或人类细胞多孔心包膜的组。在特定实施方案中，所述第三层包含细胞多孔猪心包膜。
在多种实施方案中，所述第三层包含干燥的断皮层，其中所述断皮层可选自狗、猫、马、母牛、猪、猴、猿、黑猩猩、羊或人类来源。在一个实施方案中，所述第三层包含干燥的猪断皮层(Xenoderm)。
在特定的实施方案中，所述支持层和所述第三层由于由相同材料制成而是完全相同的。这意味着在多种实施方案中，所述第三层由与以上描述的用于支持层的相同材料制成。
在多种实施方案中，所述补片包含支持层和基质层。在多种进一步的实施方案中所述补片包含支持层、基质层和第三层。
在替代实施方式中，所述补片包括支持和基质层，其中所述支持层由心包膜制成，并且所述膜是非多孔的。在其特定实施方案中，所述心包膜是猪心包膜。
在替代实施方案中，所述补片包括支持和基质层，其中所述支持层由心包膜制成，其中所述膜是细胞多孔的。在其特定实施方案中，该心包膜是猪心包膜。
在特定实施方案中，所述补片包含支持、基质，以及第三层，其中所述支持层和所述第三层是非多孔的心包膜。在其特定的实施方案中，所述非多孔心包膜是非多孔的猪心包膜。
在特定实施方案中，所述补片包含支持、基质，以及第三层，其中所述支持层和所述第三层是细胞多孔的心包膜。在其特定的实施方案中，所述细胞多孔心包膜是细胞多孔的猪心包膜。
在替代实施方式中，所述补片包含支持、基质以及第三层，其中所述支持层和所述第三层是心包膜，其中支持或第三层是非多孔性的，而其他层是细胞多孔的。在其特定实施方案中，所述心包膜是猪心包膜。在其特定实施方案中，应用所述补片使得非多孔层面向韧带或肌腱损伤部位，其中，在其它实施方案中，将补片应用至损伤部位使得细胞的多孔层面向受损伤的部位。
在特定情况下，将包含非多孔支持层和/或第三层的补片应用至损伤的韧带或肌腱可能是进一步有利的。从而，由停留在损伤部位下或附近的细胞分泌的生长因子被截留且局部浓缩，从而导致损伤部位细胞的生长增强和更快速的韧带或肌腱修复。此外，对韧带或肌腱修复不利的化合物和细胞被排除在损伤部位外。
另外，包含支持层和基质层的补片是有利的，其中所述支持层是非多孔的且将所述补片应用至损伤韧带或肌腱，所述基质面向损伤，因为自体的离心分离血清部分提供的生长因子、PRP或软骨下血块将协同接种于所述胶原支持层或基质层的软骨、滑膜或脂肪MSC，在韧带和/或肌腱损伤部位或在自体、同种异体移植物或异种移植物表面增强修复过程。此外，在所述补片应用至损伤前已被添加到基质的外源性化合物例如生长因子和抗炎化合物，仅向损伤的韧带或肌腱释放。从而在受伤部位的外源性化合物的浓度与其中所述化合物允许全 向扩散的情况相比，是增加的。这增强了来自外源化合物的利益。
如果补片包含支持层和基质层，那么所述补片的层可以用热或化学，或其它合适的层压技术来层叠在一起。在特定实施方案中，首先形成第一层然后在其上形成第二层。例如，首先形成所述基质层，然后所述支持层在其上形成。或者，首先形成所述支持层然后所述基质层在所述支持层上形成。
如果补片包支持层、基质层和第三层，那么所述补片的层可以用热或化学，或其它合适的层压技术来层叠在一起。在特定实施方案中，首先形成第一层然后第二层在其上形成，第三层在第一和第二层的复合物上形成。例如，首先形成基质层，然后在基质层上形成支持层。在第三步中，第三层在基质层上形成，并夹入基质层与支持层之间。或者，首先形成支持/第三层，然后在所述支持/第三层上形成基质层，然后在所述基质层上，在所述支持/第三层的相对位点形成第三/支持层。在其他实施方案中，所述三层在彼此上成层且在单一的步骤中层叠成所述补片。
可植入的层叠体韧带或肌腱修复补片是生物相容的外科装置。在特定实施方案中，所述补片是生理上可吸收的。在多种实施方案中，所述补片目的是原位韧带或肌腱修复。
在一些实施方案中，所述补片是适合的，因为其在某些实施方案中允许细胞从损伤部位迁移以进入基质层。基质层是胶原层且可以是自体干细胞和其它血液组分的在损伤部位的扩散槽。所述基质层可包括在软骨下、滑膜、脂肪或造血系统来源的自体干细胞的存在下促进韧带和/或腱修复的化学组分。因此，在一些实施方案中，以基质层面向损伤部位将所述补片放置在所述损伤部。且可任选地，所述基质层可以由支持和/或第三层封闭，使得细胞不能穿透至所述基质层，但允许其他小分子化合物例如水，气体和小分子穿过。从而本发明提供了一种原位愈合/组织生长促进方法来修复韧带或肌腱损伤。
在特定实施方案中，韧带或肌腱修复补片层叠体12具有任选为闭塞的或多孔的第三层，层16和多孔支持层22(参见图2A至2C和3)。在另一个优选的 实施方案中，所述韧带或肌腱修复补片层叠体12仅包括两个层，支持层22和基质层30(参见图2D和2E)。在多种实施方案中，支持层意欲面向损伤部位韧带或肌腱的表面。在多种实施方案中，所述第三层意欲面向损伤部位韧带或肌腱的表面。在其他实施方案中双层补片的基质层面向韧带或肌腱损伤部位(也参见图4和图5)。三层修复补片的第三层16和/或支持层22均可以由片状胶原制成(参见Angele等人，美国专利第6,737,072号，其内容通过引用并入本文)。片状胶原合意的市售来源实例为：XENODERM(tm)，mbp股份有限公司，德国。在特定实施方案中，所述基质层30提供其中截留间充质干细胞或韧带或肌腱的干细胞的胶原基质，以及在基质层30其他天然组分的存在下，他们将在其上生长和分化的细胞生长支持介质。
在多种实施方案中，所述基质层30是散布着非人类来源胶原纤维36和天然透明质酸纤维40的多孔胶原复合垫。如图2A所示以天然HA纤维40的形式，或如图2B中作为分散入胶原纤维36的空缺空间中的凝胶或乳膏状悬浮液42中的HA粉末40a，在所述基质30中提供所述天然HA。
在特定实施方案中，所述基质层30(参见图2B)还包括一种或更多种组织的生长激素和/或抗炎化合物46。在某些实施方案中，所述抗炎化合物为双醋瑞因46a和大黄酸46b。在图2B中图解的实施方案中，混悬液42中还含有大黄酸46b和/或双醋瑞因46a。在多种实施方案中，所述基质层30还包括壳聚糖组分和/或聚乳酸组分。
在本发明的方法的多种实施方案中配置所述修复补片，使得来自所述修复补片10外部来源的自体间充质干细胞60，通过多孔支持层22扩散进入补片10和进入基质层30，在那儿它们由基质层30的纤维组分(胶原纤维36和/或HA纤维40a)支持(例如图2A-2E，3，6a和6b)。在多种实施方案中，基质纤维40&40a可以提供用于干细胞生长和分化成韧带或肌腱细胞的支持介质。外源因子46(诸如双醋瑞因)下调有助于炎症的炎性参数(例如，细胞因子：IL-1，TNF-α，和自由基)。在特定实施方案中，基质层中存在一种或更多种生长激素。 那些一种或更多种生长激素可刺激韧带和/或肌腱组织的产生。
在多种实施方案中，所述修复补片可包含支持层、基质层，和第三层，其中所述支持层包括穿孔的断皮层，例如猪断皮层(Xenoderm)，且第三层包含非穿孔的断皮层，例如猪断皮层(Xenoderm)。或者，所述支持层和所述第三层均包含穿孔的断皮层，例如猪断皮层(Xenoderm)。在特定实施方案中，所述支持层和所述第三层由断皮层组成。在一些实施方案中，所述基质层可包含胶原、透明质酸和聚乳酸，例如聚-L-乳酸。例如，所述基质层可为散布着胶原纤维和分散入所述胶原纤维空缺空间的天然透明质酸和聚乳酸例如聚-L-乳酸的细胞多孔胶原复合垫。在一些实施方案中，所述基质层可包含如本文所公开的其它化合物，例如，生长因子，壳聚糖，大黄酸和双醋瑞因。
通常，本发明的修复补片增强肌腱和韧带修复，加强并有利于自体韧带和肌腱移植物的整合。在某些实施方案中，所述基质层被用作用于向治疗部位外源添加、附着、掺入、嵌入或接种细胞诸如成纤维细胞、肌腱细胞、其前体细胞、间充质细胞、韧带或肌腱细胞、不同来源的干细胞的支持结构。根据本发明添加这些细胞来增加或提供刺激以增强在损伤的韧带或肌腱部位或在韧带和/或腱移植物部位的修复过程。用于本发明中的适合的细胞为自体或异源细胞如同种异体或异种细胞、细胞系和/或原核细胞。通常，外源添加到基质层或胶原支架的细胞是市售的或从使用本领域已知方法体外培养的韧带或肌腱分离的。
在一个实施方案中，所述方法包含通过粘附、掺入、嵌入或接种细胞进入胶原支架基质层或支持/第三层，将祖细胞、成熟成纤维细胞、韧带或肌腱细胞或其他细胞体外(in vitro)或体内(ex vivo)添加至本发明的所述装置。外科手术之前、期间或甚至之后，将所培养的细胞照此添加到基质层，或附着到支持层和/或第三层。该外源添加的细胞可诱导与新韧带或新肌腱一致的蛋白质和基质组分的产生或生产，或诱导原生细胞从未受损伤的韧带或肌腱向损伤的部位迁移。
在多种实施方案中，所述补片具有0.1-10mm、0.5-2mm、0.5-1mm或0.75 -1.25mm之间的厚度。
如果所述补片包括层叠的支持层和基质层，那么可以基质层面向韧带的方式将补片应用于损伤韧带。在一种替代实施方式中，可以所述支持层面向所述韧带的方式将补片应用至受损韧带。同此，公开了用于损伤肌腱应用的相同的补片应用模式。
如果补片包括层叠的支持层、基质层和第三层，那么可以第三层面向韧带的方式将补片应用于受伤的韧带。在一种替代实施方式中，可以支持层面向韧带的方式将补片应用于损伤韧带。同此，公开了用于损伤肌腱应用的相同的补片应用模式。
在特定实施方案中，所述补片包含细胞多孔胶原支持层和基质层，且可以所述支持层面向损伤韧带的方式将所述补片应用于损伤韧带。在替代实施方案中，所述补片包括细胞多孔胶原支持层和基质层，且可以所述基质层面向所述韧带的方式将所述补片应用于损伤韧带。在进一步的实施方案中，所述补片包含细胞多孔胶原第三层，细胞多孔胶原支持层和基质层，且可以第三层或支持层面向韧带的方式将所述补片应用于损伤韧带。在进一步的实施方案中补片包含细胞多孔胶原第三层，非多孔的胶原支持层和基质层，且可以第三层或支持层面向韧带的方式将所述补片应用于损伤韧带。在进一步的实施方案中，所述补片包含非多孔胶原第三层，非多孔胶原支持层和基质层，且可以第三层或支持层面向韧带的方式将所述补片应用于损伤的韧带。补片的这些应用模式也类似地适用于对损伤肌腱的应用。
在特定实施方案中，用本文所公开的糖胺聚糖(GAG)或粘多糖涂覆所述支持层。在一些实施方案中，用本文所公开的透明质酸涂覆所述支持层。
在其他实施方案中，如果所述补片包括第三层，那么用本文所公开的糖胺聚糖(GAG)或粘多糖涂覆所述第三层。在多种实施方案中，用本文所公开的透明质酸涂覆所述第三层。
在特定实施方案中，设计所述补片使得所述补片是完全生物可吸收的。因 此，一旦被植入，所述补片随着时间自动降解。技术人员能够很好地设计所述补片以使得所述补片在韧带或肌腱愈合期间或韧带或肌腱愈合完成后降解。
在多种实施方案中，所述补片不是生物可降解的且一旦韧带或肌腱被修复必须被移出。
本发明所述方法适用于韧带和/或肌腱修复。
在多种实施方案中，所述韧带选自但不限于，连接至下肢和上肢、头和颈例如肩、肘、腕、手、臀、膝、脚踝和脊椎的韧带的组。
在特定实施方案中，所述韧带选自包含但不限于环甲韧带、牙周韧带、晶状体悬韧带、乳房悬韧带、骶髂前韧带、骶髂后韧带、骶结节韧带、骶棘韧带、耻骨下韧带、耻骨上韧带、阴茎悬韧带、掌侧桡腕韧带、桡腕背侧韧带、十字韧带、前十字韧带(ACL)、外侧副韧带(LCL)、后十字韧带(PCL)，内侧副韧带(MCL)和髌韧带的组。
在多种实施方案中，所述肌腱选自但不限于连接至下肢和上肢的肌腱诸如肘、手、膝、脚和踝的肌腱，和肩、臀、脊椎、胸和腹部肌腱的肌腱的组。
在特定实施方案中，所述肌腱选自包含但不限于跟腱(Achilles tendon)、肱二头肌肌腱、肱三头肌肌腱，长伸肌肌腱、腓骨肌腱、胫骨前肌肌腱和后肌肌腱、肩胛下肌肌腱、肩袖肌腱、四头肌腱和髌骨肌腱的组。还包括存在于手和脚的所有肌腱。本发明的方法可应用于患者，其中所述患者受到影响韧带和/或肌腱的病症的折磨，所述病症包括但不限于韧带和/或肌腱的炎症、自身免疫疾病、感染、应力、应变、断裂、扭伤、撕脱伤、过度拉伸或撕裂。
在特定实施方案中，将所述修复补片应用至损伤韧带和/或肌腱之前，所述损伤部位为接收所述补片作准备。
在特定实施方案中，附于损伤韧带或肌腱之前或之后，用血液浸透所述修复补片以截留在所述补片中的自体间充质干细胞(MSC)，并在损伤部位释放生长因子。这些多功能间充质干细胞(MSC)在胶原补片的存在下将分化成成纤维细胞，随后成为成熟的韧带或肌腱细胞以修复韧带或肌腱损伤部位或转化韧 带或肌腱移植物组织。
在损伤部位作准备后，可执行进一步程序。
在特定实施方案中，为了将所述修复补片固定于损伤的韧带或肌腱，可使用外科手术缝合线将所述补片固定于韧带或肌腱。在特定实施方案中，使用缝合线通过缝合和/或向损伤肌腱或韧带的固定部位添加胶以将所述补片捆绑至损伤韧带/肌腱来将所述补片固定于损伤韧带或肌腱。
所述缝合线可以由选自但不限于二甲基硅氧烷、聚四氟乙烯(PTFE)、尤其是缩合PTFE(cPTFE)或膨体聚四氟乙烯(ePTFE)、聚乙烯、聚乳酸、聚二噁烷酮、己内酯、聚乙醇酸、胶原聚酯和基于丙烯酰聚合物例如丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯的材料制成。特别合适的聚合物例如是聚丙烯(PP)和聚卡普隆的混合聚合物、聚对二噁烷酮、聚酯、聚偏二氟乙烯(PVDF)，聚丙烯(PP)特别是缩合PP(cPP)，聚四氟乙烯(PTFE)，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，聚对苯二甲酸乙酯、聚醚酮(PEK)和聚醚醚酮(PEEK)的聚合物。
所述外科缝合线是生物相容的。
在多种实施方案中，通过将所述补片缝合至韧带或肌腱，将所述修复补片固定至损伤韧带或肌腱。通常，生物可吸收的外科手术缝合线被用于固定所述补片。所述外科手术缝合线可由聚乳酸、聚二噁烷酮和己内酯、聚乙醇酸和胶原制成。
在特定实施方案中，所述修复补片包括生长因子、抗炎化合物和/或抗体，其可以是重组来源和/或从血液例如自体血中分离的。因此，在一些实施方案中，补片包含例如TGF-βI和/或一种或更多种本文描述的生长因子。
在特定实施方案中，为了将所述修复补片固定于创伤的韧带或肌腱，通过胶合/或使用外科手术缝合线的接合和/或使用外科手术缝合线的捆绑将所述补片固定于韧带或肌腱。
所述胶和/或所述外科手术缝合线可为生物相容的。
所述胶可选自包括但不限于明胶、海藻酸、琼脂糖、淀粉、纤维蛋白、胶 原、层粘连蛋白、弹性蛋白、粘连蛋白、蛋白多糖和/或糖胺聚糖例如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和/或硫酸角质素、酪蛋白、右旋糖酐、羧甲基纤维素(caramellose)、果胶，卡拉胶，和黄原胶的组。
例如，本系统的方法可以包含纤维蛋白胶/纤维蛋白胶组合物在损伤部位的制备和应用。所述纤维蛋白胶/纤维蛋白胶组合物可与体液混合以形成体液纤维蛋白胶复合物。
在多种实施方案中，本发明所述方法可进一步包含在所述修复补片的应用和/或胶例如纤维蛋白胶对所述补片的应用之前或之后，将胶例如纤维蛋白胶应用至损伤肌腱或韧带的步骤。在特定实施方案中，如果所述补片包括支持层和基质层，那么可在将所述补片应用至损伤韧带或肌腱之前和/或之后，将胶例如纤维蛋白胶应用于所述支持层和/或基质层。在多种实施方案中，如果所述补片包括支持层、基质层和第三层，那么可在将所述补片应用至创伤韧带或肌腱之前和/或之后，将胶例如纤维蛋白胶应用于所述支持层和/或第三层。
在特定实施方案中，所述胶是纤维蛋白或纤维蛋白组合物。纤维蛋白组合物可包括纤维蛋白和其他组分。该其它组分可为生长因子、抗炎化合物和/或抗体。在特定实施方案中，所述其他组分例如生长因子、抗炎化合物和/或抗体，是重组的和/或从血液中分离。因此，在一些实施方案中，纤维蛋白胶组合物中的至少一种组分是从血液或血清分离的，即离心后回收的血清，其包括数种生长因子如TGF-βΙ和/或一种或多种如本文所描述的生长因子。在多种实施方案中，所述纤维蛋白胶组合物包含从自体血液中分离的至少一种自体生长因子。然后所述纤维蛋白胶组合物可刺激干细胞在韧带和/或肌腱损伤/补片交界面的分化。
在特定实施方案中，将胶例如纤维蛋白胶应用于损伤部位，随后将柔性层叠体修复补片在损伤部位的胶上放置于损伤部位。在所述修复补片置于损伤部位的位置后还可随意应用所述胶例如纤维蛋白胶，以进一步完成所述修复补片对损伤部位的附着。例如，可注入所述胶以达成覆盖损伤部位。另外，所述补 片可通过外科手术缝合线进一步固定。一旦完成此步骤，该外科手术阶段完成且所述韧带/肌腱修复补片继续其原位愈合目的。
在特定实施方案中，将所述补片原位应用于韧带或肌腱。因此，在特定实施方案中，可以以内镜程序将所述补片应用于韧带或肌腱。
或者，从患者获得韧带/肌腱移植物，然后如上描述应用所述补片并之后将所述移植物引入外科准备位点。
本文还公开了如本文所描述的韧带和/或肌腱修复补片。
本文还公开了如本文所描述的用于损伤韧带和/或肌腱治疗的韧带和/或肌腱修复补片。
本文所描述的与韧带修复相关的所有程序和装置也同时作为涉及肌腱修复的程序公开，反之亦然。
实施例
实施例1：修复补片的制备
使用胶原片22(Xenoderm-猪1和3型胶原)作为支持层22。所述支持层具有耐剪切和拉应力的机械性质，并在约6周内可再吸收。将所述胶原片22放入成型器，然后装载添加双醋瑞因溶液或双醋瑞因粉末的胶原-HA悬浮液以获得在所述补片中冷冻干燥和灭菌后以干重量计0.3-75μg的含量。结果生成将支持层放置于损伤的韧带/肌腱部位的双层胶原垫。制造后且灭菌前，该垫被放进机械压力机以获得0.5-2mm的厚度。冷冻干燥的最终产品的HA-浓度在约0.1％至2％的范围内。所述HA为天然HA，即发酵来源的非化学修饰HA。
实施例2：心包膜的生产
1.来自牛来源的原料回收
使用牛心囊(心包)作为起始原料，屠宰场内官方兽医常规肉类质检后，首先从附着器官部分分离，并大概去除脂肪和结缔组织。从而获得每块近似30cm×15cm尺寸和约一公斤重量的片状块。经如此制备的牛心包膜被连同冰装载在冷藏包中从该屠宰场运输至生产地，并根据回收的原材料的量，在他们被进 一步处理前，其间在那存储于-20℃以下。
2.湿法化学处理
该原始心包块首先单独地用纯水漂洗，通常用流动水浸泡以除去附着的血液和水溶性蛋白部分。浸泡后，所有宏观可见的脂肪组织和基膜残余物被除去。随后在室温下用2％氢氧化钠水溶液处理。该心包块(5,000克)保持在碱液浴(37.5升)中总共16小时。由此清除之后是去矿物质水中10分钟的漂洗处理，重复该处理直到漂洗流出水的pH降低到低于8，这在约1小时后达到。基膜和脂肪残余物仍可观察到，如果有的话，那么它们在此处理阶段被除去。然后大量溶胀的心包块被转移到37.5升10％的食盐水中以调节进一步处理步骤所必需的溶胀状态(部分消溶胀)。在室温下进行NaCl处理，其随后是用去矿物质水的漂洗处理。为了除去来自该心包材料的任意干扰重金属离子以及任意可能的石灰夹杂物，该材料之后经受使用37.5升的调节至弱碱性并具有100ml内0.3g的浓度的EDTA溶液的处理。然后，将该材料如之前处理步骤用去矿物质水漂洗以除去过量的配位剂，并同时使pH值至8.5。该一次处理随后是用37.5升乙酸盐缓冲液(pH 4.8；每100ml组成：100ml中以体积计59份0.01摩尔的3水乙酸钠溶液和100ml中以体积计41份0.01摩尔的醋酸)充任缓冲所有遗留在所述心包组织的残留物(如果有的话)，并为随后的漂白操作制备弱酸性介质的目的。如上所述通过用去矿物质水漂洗除去任何过量的缓冲物质。
3.氧化漂白
湿法化学处理后，所述心包块在37.5升的1.5％的过氧化氢溶液中经受一小时氧化漂白操作。所述漂白过程以及前述处理步骤在室温下进行。从而在一方面，保证净化操作的效率，同时在另一方面，避免了胶原组织的变质。
4.冲洗
为了除去任何过量试剂，所述材料随后根据常规方案用去矿物质水漂洗。
5.脱脂
将漂洗过的牛心包块置于牛心包组织完全被丙酮覆盖的量的丙酮中。8小时 内更换溶剂三次。因此脱水的牛心包块随后转移到Soxhlet装置，用丙酮提取约8小时。提取后，将心包块风干，然后用去矿物质水在运输容器中再水合。
6.冻干
在自动控制冻干机中起干燥作用。冷冻干燥详细过程如下：
将温度降低到+1℃，将温度降低至-40℃，打开真空中，加热托盘至+40℃，并用完全真空干燥。
7.灭菌
通过2.5Mrad照射灭菌起灭菌作用。
实施例3：柔性和生物相容的修复补片上的成纤维细胞培养
为了测定在本发明修复补片上的成纤维细胞培养期间的细胞活性，使用人真皮成纤维细胞系WS1。该细胞系在标准条件(37℃，5％CO2)下Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)和10％胎牛血清(FCS)中生长。
成纤维细胞被转移到本发明的修复补片和参照材料，并在标准条件(37℃，5％CO2)在DMEM中培养长达5周的时间段。使用WST1测试来测定细胞增殖率。此测试是测量细胞酶活性的比色测试，该细胞酶将四唑染料、WST1还原成不可溶甲瓒，显紫色。另外，用ELISA分析培养基样品以测定其I型原胶原浓度。在荧光显微镜下每周一次通过活/死细胞染色来分析细胞活性。
为了本发明的修复补片的体外测试，在其表面上接种成纤维细胞。细胞在无血清培养基中在标准培养条件下孵育14天。3、7和14天后测定细胞活性和I型胶原的de-novo合成率。在细胞培养板中的第二胶原补片以及单层培养作为对照。
结果表明本发明的修复补片的细胞沉降合格。在孵育时间期间，成纤维细胞能够在所述补片上存活并能合成I型原胶原。活/死成纤维细胞染色的结果是大部分活细胞在所述补片上。另外，可具体测定本发明所述修复补片的表面的过度增长。在孵化14天后，相比于单层参照，在本发明所述修复补片上生长的成纤维细胞显示增强的代谢活性以及增强的I型原胶原浓度水平。
尽管上面的描述包含许多细节，但是这些不应理解为对本发明范围的限制，而是作为其一个或另一个优选实施方案的示例。可能有对本领域技术人员而言显而易见的许多其他变化。因此，应当通过所附的权利要求及其等效物的范围，而不是仅仅通过实施方案来确定本发明的范围。本文引用的所有文献在此通过引用以其全文并入本文。可适当的在本文具体公开的任意元素、限制不存在时实行本文说明描述的发明。因此，例如，应宽泛且没有限制地解读所述术语“包含”、“包括”、“含有”等。另外，本文采用的术语和短语作为说明的且无限制的术语使用，且在这些术语和短语的使用中没有排除任意所显示和描述的特征或其部分的等同物的意图，但应认识到本发明所要求保护的范围内的各种修改是可能的。因此，应当理解的是，虽然已通过优选实施方案和任选的特征具体公开本发明，但本领域技术人员可采取本文公开的在其中体现的本发明的修改和变化，并且这样的修改和变化被认为是在本发明的范围之内。本文已广泛地和一般性地描述本发明。落入本发明一般公开内容的各个下位种类和亚属分组也构成本发明的一部分。这包括具有从种属去除任意主体的附带条件或负面限制的本发明类属描述，无论该切除的材料是否在本文具体地叙述。此外，在依据Markush组来描述本发明的特征或方面之处，本领域的技术人员将认识到，本发明也由此依据Markush组的任意独立成员或成员的亚组来描述。本发明的其他实施方案将从以下权利要求变得显而易见。