《一种利用栽培室制备冬虫夏草菌种材料的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种利用栽培室制备冬虫夏草菌种材料的方法.pdf（12页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 104304016 A (43)申请公布日 2015.01.28 CN 104304016 A (21)申请号 201410541663.4 (22)申请日 2014.09.30 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 中山大学 地址 510275 广东省广州市海珠区新港西路 135 号 (72)发明人 钟欣 张古忍 刘昕 阚绪甜 李少松 何健敏 (54) 发明名称 一种利用栽培室制备冬虫夏草菌种材料的方 法 (57) 摘要 本发明涉及一种利用栽培室制备具有高侵染 活性的冬虫夏草菌种材料的方法。该方法利用建 立自动化或手动控制气候条件的高寒植物组培苗 栽。
2、培室， 模拟青藏高原的温度、 湿度及光照等气候 因子， 应用组织培养快速繁殖栽培技术获得高寒 植物组培苗， 将制备的冬虫夏草菌源喷施接种到 高寒植物组培苗上， 通过营造适应环境促进冬虫 夏草菌的无性阶段中国被毛孢与高寒植物组织共 生， 共生处理后获得的冬虫夏草菌种材料对钩蝠 蛾幼虫的侵染率可达 95.8 98.9。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 (10)申请公布号 CN 104304016 A CN 104304016 A 1/1 页 2 1. 一种利用栽培室制备具有高侵染。
3、活性的冬虫夏草菌种材料的方法， 该方法包括 ： 建 立自动化或手动控制气候条件的高寒植物组培苗栽培室， 模拟青藏高原的温度、 湿度及光 照的气候条件， 通过离体组织培养快速繁殖栽培技术， 获得冬虫夏草寄主钩蝠蛾幼虫取食 的高寒植物组培苗 ； 将制备的冬虫夏草菌源喷施接种到栽培室高寒植物组培苗上， 促进冬 虫夏草菌中国被毛孢与高寒植物组培苗共生， 形成菌物 - 植物共生体， 将菌丝检测结果为 中国被毛孢的菌物 - 植物共生体作为对寄主钩蝠蛾昆虫具有高侵染活性的冬虫夏草菌种 材料。 2. 按照权利要求 1 所述的方法， 其特征是所述的高寒植物组培苗栽培室是 ： 采用通常 植物离体组织培养栽培室建造。
4、方法， 建立自动化或手动控制气候条件的高寒植物组培苗栽 培室， 以长 10 20m 宽 10 20m 大小为建设单位， 设置 3 5 层用于放置植物苗培养瓶 或杀菌处理过的洁净土壤的培养架， 通过电制冷、 电加热设备调节栽培室内空气温度 ； 通过 喷雾式管路及除湿机调节栽培室内空气湿度 ； 培养架安装日光灯光照系统， 对栽培植物提 供光照 ； 利用活性炭及微滤膜空气过滤系统， 保持栽培室内无尘、 清洁状态 ； 栽培室内安装 紫外灯， 定期消毒。 3. 按照权利要求 1 所述的方法， 其特征是所述的高寒植物离体组织培养快速繁殖栽培 技术是 ： 在冬虫夏草主产区海拔25005200米的高寒草甸采集。
5、高寒植物苗或其种子， 应用 常规植物离体组织培养快速繁殖技术， 快速繁殖和栽培高寒植物组培苗， 控制栽培室的波 动温度保持在夜 2昼 22， 空气湿度保持在 65 95， 离体快繁高寒植物组培苗接受 的光照强度为5002000lx， 光照时间每天1016小时， 使组培苗旺盛生长获得高寒植物 苗。 4. 按照权利要求 1 所述的方法， 其特征是所述的冬虫夏草菌种的制备方法是 ； 从冬 虫夏草主产区的冬虫夏草适生地采集新鲜冬虫夏草或其子囊孢子， 采用合适嗜低温菌物 的工业微生物方法进行分离纯化， 经分子生物学方法或形态学方法鉴定为中国被毛孢 (Hirsutella sinensis)， 通过常规低。
6、温发酵法在 135条件下发酵为冬虫夏草菌中国被 毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子， 并进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子按发酵物与 水体积比 1 10 1 200 稀释成的悬浮液， 作为冬虫夏草菌源 ； 或者是直接采用洁净的 冬虫夏草新鲜子囊孢子稀释制成每毫升含有1001000个子囊孢子的悬浮液， 作为冬虫夏 草菌源。 5. 按照权利要求 1 所述的方法， 其特征是所述的将冬虫夏草菌种接种到植物组培苗组 织的方法是 ： 将制备的冬虫夏草菌源喷淋接种到栽培室栽培的高寒植物组培苗上， 每瓶喷 施12ml菌悬液， 或每平方米洁净土壤培育区喷施50100mL菌悬液， 在1天内喷施1 2 次， 喷施后利用。
7、 5 100lx 的低强度散射光进行光照， 控制栽培室内温度在 135， 空气 湿度保持在 70 90， 共生培育 3 15 天。 权 利 要 求 书 CN 104304016 A 2 1/10 页 3 一种利用栽培室制备冬虫夏草菌种材料的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种利用栽培室制备冬虫夏草菌种材料的方法。 背景技术 0002 冬虫夏草 Ophiocordyceps sinensis(Berk.)Sung， Sung， Hywel-Jones&Spatafora 是一种虫生子囊真菌， 寄生于鳞翅目Lepidoptera蝠蛾科Hepialidae钩蝠蛾属Thitarodes 昆虫的幼虫。
8、， 其无性型为中国被毛孢Hirsutella sinensis Liu， Guo， Yu&Zeng。 冬虫夏草寄 主钩蝠蛾属 Thitarodes 昆虫的一个世代包括卵、 幼虫、 蛹和成虫四个发育阶段， 幼虫营地 下隧道式穴居生活， 杂食性， 喜食圆穗蓼、 头花蓼、 小大黄和珠芽蓼等高寒植物的幼嫩根茎。 0003 冬虫夏草分布于青藏高原高海拔区域， 其生长范围局限， 产量也极为有限。 它是青 藏高原特色名贵滋补中药材， 具有重要的药用和经济价值。由于冬虫夏草的形成过程中仍 有许多关键问题尚不清楚， 冬虫夏草菌侵染钩蝠蛾昆虫的侵染活性较弱， 原生态冬虫夏草 道地药材的产业化迄今仍存在许多障碍难题。
9、。 冬虫夏草寄主昆虫的饲料高寒植物生长在青 藏高原， 其具有生长速度慢， 繁殖系数不高等特点， 在栽培室内利用离体组织培养快速繁殖 技术可以解决高寒植物苗的来源问题， 该技术是生产上应用最广泛、 产生较大经济效益的 一项技术， 其特点是繁殖速度快、 系数大， 周年生产、 生长整齐， 利用这项技术可以使一个单 株一年繁殖几万到几百万个植株。 0004 目前采用常规冬虫夏草菌侵染寄主钩蝠蛾昆虫幼虫仍存在侵染率低、 耗费时间长 等问题。 中国发明专利申请(公开号 ： CN102696555A)公开了一种半野生人工培殖冬虫夏草 的方法， 中国发明专利申请 ( 公开号 ： CN102405763A) 公。
10、开了一种冬虫夏草的培育方法， 上 述 2 个专利申请均采用含有中国被毛孢的菌液连续喷洒寄主幼虫体表的方法进行接种侵 染 ； 中国发明专利申请 ( 公开号 ： CN102696392A) 公开了天然冬虫夏草的增产方法， 其中采 用诱集液诱集蝙蝠蛾幼虫后， 向幼虫喷洒蝙蝠蛾被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉两种菌种液体种 ； 中国发明专利申请 ( 公开号 ： CN102106235A) 公开了一种全人工培养冬虫夏草的方法， 其中 采用一端直径小于 0.2mm 的不锈钢实心针或空心针的针状器具， 沾取中国被毛孢菌体和孢 子混悬液刺伤寄主幼虫的方法进行接种侵染 ； 中国发明专利申请 ( 公开号 ： CN102792。
11、855A) 公开了一种用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料及寄主感染方法， 采用冬虫夏草菌皮作为菌 种材料灌注、 或拌入饲料喂食、 或注射、 或喷淋侵染寄主幼虫。 但上述方法存在侵染活性低、 或损伤后存活率低、 或耗费时间过长、 或菌种材料产量有限等问题， 是制约原生态冬虫夏草 道地药材产业化的关键问题之一。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种利用栽培室制备冬虫夏草菌种材料的方法。 该方法利用 自动化或手动控制气候条件的高寒植物组培苗栽培室， 通过构建冬虫夏草菌的无性阶段中 国被毛孢与活体高寒植物组培苗组织的共生体， 激活中国被毛孢的侵染活性， 得到对寄主 钩蝠蛾幼虫具有高侵染活性的冬虫夏草。
12、菌种材料， 达到高效侵染寄主钩蝠蛾幼虫的目的。 说 明 书 CN 104304016 A 3 2/10 页 4 0006 发明人研究发现冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢在自然界中与其适生地中的 多种高寒植物的根、 茎、 叶等组织存在共生现象。进一步的研究发现， 经高寒植物组织根、 茎、 叶等组织共生， 共生后要比未共生的中国被毛孢的侵染活性高数十至数百倍， 基于这一 原理发明本方法。 0007 本发明制备具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料的方法包括 ： 建立自动化或手 动控制气候条件的高寒植物组培苗栽培室， 模拟青藏高原的温度、 湿度及光照等气候条件， 通过离体组织培养快速繁殖栽培技术， 获得冬虫。
13、夏草寄主钩蝠蛾幼虫取食的高寒植物组培 苗 ； 将制备的冬虫夏草菌源喷施接种到栽培室高寒植物组培苗上， 促进冬虫夏草菌的无性 阶段中国被毛孢与高寒植物组培苗共生， 形成菌物 - 植物共生体， 将菌丝检测结果为中国 被毛孢的菌物 - 植物共生体作为对寄主钩蝠蛾幼虫具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料。 0008 本发明的具体步骤包括 ： 0009 1. 采用通常植物离体组织培养栽培室建造方法， 建立自动化或手动控制气候条件 的高寒植物组培苗栽培室， 以长 10 20m 宽 10 20m 大小为建设单位， 设置 3 10 层 用于放置植物苗培养瓶或杀菌处理过的洁净土壤的培养架， 通过电制冷、 电加热设备。
14、 ( 例 如制冷压缩机、 电热丝加热设备等 ) 调节栽培室内空气温度 ； 通过喷雾式管路及除湿机调 节栽培室内空气湿度 ； 培养架安装日光灯等光照系统， 对栽培植物提供光照 ； 利用活性炭 微滤膜空气过滤系统， 保持栽培室内无尘、 清洁状态 ； 栽培室内安装紫外灯， 定期消毒 ； 工 作人员进入栽培室前， 在更衣室更换消毒过的工作服、 鞋、 帽等。 0010 2.在青海玉树或西藏那曲等冬虫夏草主产区海拔25005200米的高寒草甸采集 高寒植物苗或其种子， 通过常规植物离体组织培养快速繁殖技术， 在栽培室内用通常植物 组培培养基及常规植物生长激素， 快速繁殖和栽培高寒植物组培苗， 通过人工或自。
15、动化控 制栽培室的波动温度保持在夜 2昼 22， 空气湿度保持在 65 95， 离体快繁高寒植 物组培苗接受的光照强度为500-2000lx， 光照时间每天1016小时， 使高寒植物组培苗旺 盛生长。 0011 3. 从青海玉树或西藏那曲等冬虫夏草主产区的冬虫夏草适生地采集新鲜冬虫 夏草或其子囊孢子， 采用合适嗜低温菌物的工业微生物方法进行分离纯化， 经分子生物学 方法或形态学方法鉴定为中国被毛孢 (Hirsutella sinensis)， 通过常规低温发酵法在 135条件下发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子， 并进一步将 菌丝体及分生孢子或芽生孢子按发酵物与水体积比 1 。
16、10 1 200 稀释成的悬浮液， 或 直接采用栽培室内的洁净的冬虫夏草新鲜子囊孢子稀释制成每毫升含有 100 1000 个子 囊孢子的悬浮液， 作为冬虫夏草菌源。 0012 4. 将制备的冬虫夏草菌源喷淋接种到栽培室栽培的高寒植物组培苗上， 每瓶喷施 1 5ml 菌悬液， 或每平方米洁净土壤培育区喷施 50 100mL 菌悬液， 在 1 天内喷施 1 2 次， 喷施后利用 10 100lx 的低强度散射光进行光照， 通过人工或自动化控制栽培室内温 度在 135， 空气湿度保持在 70 90， 共生培育 3 15 天， 激活冬虫夏草菌中国被毛 孢的侵染活性 ； 采用显微镜检查共培养的冬虫夏草菌。
17、中国被毛孢菌丝与高寒植物组培苗的 根、 叶、 茎组织缠绕形成共生体， 经分子检验为中国被毛孢后， 可直接作为具有高侵染活性 的菌种材料 ； 或是将获得的共生体组织切成 5 20mm 小段， 制备成具有高侵染活性的菌种 材料， 用遮阴保水保鲜方法存放于 2 4， 保存备用。 说 明 书 CN 104304016 A 4 3/10 页 5 0013 本发明方法获得的具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料可用于高效侵染钩蝠蛾 幼虫， 使用时可直接冬虫夏草寄主钩蝠蛾幼虫投置到冬虫夏草菌中国被毛孢与高寒植物组 培苗形成共生体的培育瓶或洁净土壤培育区内， 亦可将制备的高侵染活性菌种材料投喂冬 虫夏草寄主钩蝠蛾幼。
18、虫， 使寄主幼虫取食并充分接触菌种材料， 从而被高效侵染。在寄主 钩蝠蛾幼虫取食接触菌种材料 7 15 天后， 采用显微镜检查及分子生物方法检测钩蝠蛾 幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体， 经统计， 钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率约为 95.8 98.9。 0014 本发明所述的植物组培培养基根据高寒植物对无机元素、 有机营养元素需求的不 同， 可以是 MS 培养基 (Murashige and Skoog， 1962)、 LS 培养基 (Linsmairer and Skoog， 1965)、 BL 培养基 (Brown and Lawrence， 1968)、 ER 培养基 (Eriksson，。
19、 1965)、 B5培养基 (Gamborg et al.， 1968)、 N6培养基(朱至清等， 1975)、 SH培养基(Sckenk and Hidebrandt， 1972)、 Nitsch 培养基 (1969)、 Miller 培养基 (1963)、 H 培养基 (Bourgin and Nitsch， 1967)、 White 培养基 (White， 1943)、 WS 培养基 (Wolter and Skoog， 1966)、 HE 培养基 (Heller， 1953) 中的一种。 0015 本发明所述的植物激素可以是植物生长素包括 ： 吲哚乙酸 (indole-3-acetic。
20、 acid， IAA)、 吲哚丁酸(indole-3-butyric acid， IBA)、 萘乙酸(naphthalene acetic acid， NAA)、 2， 4- 二氯苯氧乙酸 (2， 4-dichloro phenoxyacetic acid， 2， 4-D) ； 细胞分裂素包括 ： 激动素(kinetin， KT)、 玉米素(zeatin， ZT)、 6-苄氨基腺嘌呤(6-Benzyladenine， 6-BA)、 噻 重氮苯基脲 (thidiazuron， TDZ)、 异戊烯腺嘌呤 (2-isopentenyladenine， 2-ip) ； 或赤霉酸 (gibberelli。
21、ns3， GA3) ； 或脱落酸 (abscisic acid， ABA) 中的一种或多种。 0016 本发明所述的采用合适嗜低温菌物的工业微生物方法进行分离纯化所用的分离 培养基可以是察氏培养基、 或马铃薯培养基、 或肉汤培养基、 或酵母浸出粉葡萄糖培养基、 或高氏一号培养基中的一种。 所述的通常发酵方法可以是固体发酵， 或是液体发酵， 或是固 液双相发酵。所述固体发酵可以是大麦、 小麦、 大米、 玉米等常规农作谷物中的一种或多种 作为固体培养基。 所述液体发酵可以是普通肉汤、 或蛋白胨水、 或酵母提取物等常规底料中 的一种或多种作为液体培养基。 所述固液双相发酵可采用深层发酵产生菌丝和分生。
22、孢子或 芽生孢子后， 在固体培养基上再继续发酵的方法， 其培养基可以是上述固体发酵培养基和 液体发酵培养基中的各一种。 0017 本发明所述的高寒植物的种类包括柔软点地梅 (Androsace mollis)、 东俄洛 紫菀 (Aster tongolensis)、 川滇苔草 (Carex schneideri)、 膨囊苔草 (C.lehmanii)、 青绿苔草 (C.breviculmis)、 黑褐苔草 (C.atrofusca)、 一岁苔草 (C.heterostachya)、 萨 嘎 苔 草 (C.sagaensis)、 舌 叶 垂 头 菊 (Cremanthodium linguiat。
23、um)、 裂 叶 蓝 钟 花 (Cyananthus lobatus)、 丽江蓝钟花 (C.lichiangensis)、 大萼蓝钟花 (C.macrocalyx)、 发 草 (Deschampsia caespitosa)、 锡 金 柳 叶 菜 (Epilobium sikkimense)、 高 山 嵩 草 (Kobresia pygmaea)、 大 花 嵩 草 (K.macrantha)、 西 藏 嵩 草 (K.Schoenoides)、 矮 生 嵩 草 (K.humilis)、 线叶嵩草 (K.capollifolia)、 林芝橐吾 (Ligularia nyingchiensis)、 。
24、聂拉木厚棱芹 (Pachypleurum nyalamense)、 西藏厚棱芹 (P.xizangense)、 斑唇马先蒿 (Pedicularis longifora)、 昌都马先蒿 (P.sherriffi i)、 草甸马先蒿 (P.roylei)、 西藏糙 苏 (Phlomis tibetica)、 长果车前 (Plantago asiatica)、 细茎蓼 (Polygonum fi licaule)、 说 明 书 CN 104304016 A 5 4/10 页 6 叉枝蓼 (P.tortuonum)、 珠芽蓼 (P.viviparum)、 圆穗蓼 (P.macrophyllum)、 。
25、狭叶圆穗蓼 (P.macrophyllum)、 头花蓼 (P.capitatum)、 穆坪耳蕨 (Polystichum moupinense)、 楔叶委 陵菜 (Potentilla cuneata)、 纤细委陵菜 (P.gracillima)、 多头委陵菜 (P.multiceps)、 大萼委陵菜 (P.conferta)、 多裂委陵菜 (P.multifi da)、 西藏委陵菜 (P.xizangensis)、 杂 色 钟 报 春 (Primula alpicola)、 高 原 毛 茛 (Ranunculus tanguticus)、 云 生 毛 茛 (R.nephelogens)、 西。
26、藏大黄 (Rheum tibeticum)、 小大黄 (R.pumilum)、 尼泊尔酸模 (Rumex nepalensis)、 双齿风毛菊(Saussurea lavrenkoana)、 禾叶风毛菊(S.graminea)、 星状凤毛 菊 (S.stella)、 卵叶风毛菊 (S.ovatifolia)、 钩柱唐松草 (Thalictrum uncatum)、 高山唐 松草 (T.alpinun) 和长果婆婆娜 (Veronica chayuensis) 中的一种或多种。 0018 本发明所述的冬虫夏草寄主钩蝠蛾包括曲线钩蝠蛾 T.fusconebulosa(De Geer， 1778)(。
27、Hepialus)comb.n.、 赭褐钩蝠蛾 T.gallicus(Lederer， 1852)(Hepialus)comb.n.、 白 线钩蝠蛾 T.nubifer(Lederer， 1853)(Hepialus)comb.n.、 德氏钩蝠蛾 T.davidi(Poujade， 1886)(Hepialus)comb.n.、虫 草 钩 蝠 蛾 Thitarodes armoricanus(Oberthur， 1909) (Hepialus)、 斜 脉 钩 蝠 蛾 T.oblifurcus(Chu et Wang， 1985)(Hepialus)、 樟 木 钩 蝠 蛾 T.zhangmoen。
28、sis(Chu et Wang， 1985)(Hepialus)、 康姬钩蝠蛾 T.kangdingroides(Chu et Wang， 1985)(Hepialus)、 康定钩蝠蛾 T.kangdingensis(Chu et Wang， 1985)(Hepialus)、 德钦钩蝠蛾 T.deqingensis(Liang， 1988)(Hepialus)、 白马钩蝠蛾 T.baimaensis(Liang， 1988)(Hepialus)、 梅 里 钩 蝠 蛾 T.meiliensis(Liang， 1988)(Hepialus)、 贡 嘎 钩 蝠 蛾 T.gonggaensis(Fu 。
29、et Huang， 1991)(Hepialus)、人 支 钩 蝠 蛾 T.renzhiensis(Yang， 1991)(Hepialus)、 芒康钩蝠蛾 T.markamensis(Yang et al.， 1992)(Hepialus)、 草地钩 蝠 蛾 T.pratensis(Yang et al.， 1992)(Hepialus)、 锈 色 钩 蝠 蛾 T.ferrugineus(Yang et al.， 1993)(Hepialus)、金 沙 钩 蝠 蛾 T.jinshaensis(Yang， 1993)(Hepialus)、白 纹 钩 蝠 蛾 T.albipictus(Yang，。
30、 1993)(Hepialus)、甲 郎 钩 蝠 蛾 T.jialangensis(Yang， 1994)(Hepialus)、察 里 钩 蝠 蛾 T.zaliensis(Yang， 1994)(Hepialus)、中 支 钩 蝠 蛾 T.zhongzhiensis(Liang， 1995)(Hepialus)、叶 日 钩 蝠 蛾 T.yeriensis(Liang， 1995) (Hepialus)、美 丽 钩 蝠 蛾 T.callinivalis(Liang， 1995)(Hepialus)、里 塘 钩 蝠 蛾 T.litangensis(Liang， 1995)(Hepialus)、循 。
31、化 钩 蝠 蛾 T.xunhuaensis(Yang et Yang， 1995)(Hepialus)、 白带钩蝠蛾 T.cingulatus(Yang et Zhang， 1995)(Hepialus)、 巴青钩蝠 蛾 T.baqingensis(Yang et Jiang， 1995)(Hepialus)、 当雄钩蝠蛾 T.damxungensis(Yang， 1995)(Hepialus)、玉 树 钩 蝠 蛾 T.yushuensis(Wang et al.， 1995)(Hepialus)、宽 兜 钩 蝠 蛾 T.latitegumenus(Shen et al.， 1997)(Hep。
32、ialus)comb.n.、双 带 钩 蝠 蛾 T.bibelteus(Shen et al.， 1997)(Hepialus)comb.n.、拉 脊 蝠 蛾 T.lagii(Yan， 2001) (Hepialus)comb.n.、 比如钩蝠蛾 T.biruens(Fu， 2002)(Hepialus)comb.n.、 海南钩蝠蛾 T.hainanensis(Chu et Wang， 2004)(Hepialus)comb.n.、纳 木 钩 蝠 蛾 T.namensis(Chu et al.， 2004)(Hepialus)comb.n.、日 喀 则 钩 蝠 蛾 T.xigazeensis(。
33、Chu et al.， 2004) (Hepialus)comb.n.、 永胜钩蝠蛾 T.yongshengensis(Chu et al.， 2004)(Hepialus)comb. n.、 定结钩蝠蛾 T.dinggyeensis(Chu et al.， 2004)(Hepialus)comb.n.、 南木林钩蝠蛾 T.nanmlinensis(Chu et al.， 2004)(Hepialus)comb.n.、 亚东钩蝠蛾 T.yadongensis(Chu et al.， 2004)(Hepialus)comb.n.、 蒲氏钩蝠蛾 T.pui(Zhang et al.， 2007)(。
34、Hepialus) 说 明 书 CN 104304016 A 6 5/10 页 7 comb.n.、 小金钩蝠蛾 T.xiaojinensis(Tu et al.， 2009)(Hepialus)comb.n.、 色季拉钩蝠 蛾T.sejilaensis(Zou et al.， 2011)、 加查钩蝠蛾T.jiachaensis(Zou et al.， 2011)中的 一种或多种。 具体实施方式 0019 实施例一 0020 1. 选择交通便利、 电能便宜的地区， 以 10m10m 为一个房间单位， 建造自动化控 制气候条件的高寒植物栽培室， 栽培室内设置 5 层培养架用于放置植物苗培养瓶 ；。
35、 栽培室 内安装常规工业冷库用中央空调系统调节栽培室内空气温度 ； 安装喷雾式管路与中央空调 系统共同调节栽培室内空气湿度 ； 培养架安装日光灯光照系统， 对栽培植物提供光照 ； 利 用活性炭微滤膜空气过滤系统， 保持栽培室内无尘、 清洁状态 ； 栽培室内安装紫外灯， 定期 消毒， 工作人员进入栽培室前， 在更衣室更换消毒过的工作服、 鞋、 帽等。 0021 2. 在青海玉树冬虫夏草主产区海拔 4700 米的高寒草甸采集高山嵩草 (Kobresia pygmaea)、 一岁苔草 (Carex heterostachya)、 禾叶风毛菊 (Saussurea graminea)、 多裂委 陵菜 。
36、(Potentilla multifi da)、 高山唐松草 (Thalictrum alpinum)、 火绒草 (Leontopodium hastioides)、 头花蓼 (Polygonum macrophytum) 的嫩苗或种子， 通过常规植物离体组织培 养快速繁殖技术， 在栽培室内用 MS 培养基及植物激素 IAA(0.4mg/L)、 6-BA(0.5mg/L) 及 GA3(0.4mg/L) 快速繁殖和栽培高寒植物组培苗， 通过自动化控制栽培室的波动温度保持 在夜 5昼 20， 空气湿度保持在 65 95， 离体组培快繁植物苗接受的光照强度为 500 1200lx， 光照时间 10 。
37、16 小时， 使组培苗旺盛生长并获得高寒植物苗。 0022 3. 从青海玉树地区冬虫夏草主产区采集新鲜冬虫夏草， 采用常规察氏培养基分离 纯化菌种， 经分子生物学方法或形态学方法鉴定为中国被毛孢 (Hirsutella sinensis)， 经 通常蛋白胨水液体培养基在 135发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽 生孢子， 并将发酵获得的菌球用搅拌器均匀打碎， 最后按发酵液与水体积比 1 10 进一步 将菌丝体及分生孢子或芽生孢子稀释搅匀成的悬浮液， 作为冬虫夏草菌源。 0023 4. 将制备的冬虫夏草菌源， 用灭菌的注射器均匀喷淋接种到栽培室的高寒植物组 培苗上， 每瓶组培苗喷入 。
38、1ml 菌悬液， 在 1 天内喷施接种 2 次， 喷施后利用 20 50lx 的低 强度散射光进行光照， 通过人工或自动化控制栽培室内温度在 135， 空气湿度保持在 7090， 共生培育3天， 激活冬虫夏草菌中国被毛孢的侵染活性 ； 经显微镜检查冬虫夏草 菌中国被毛孢菌丝与高寒植物根、 叶、 茎组织缠绕形成共生体， 经分子检验菌丝为中国被毛 孢后， 将获得的共生体组织切成 5 20mm 小段， 制备成对寄主钩蝠蛾幼虫具有高侵染活性 的菌种材料， 用遮阴保水保鲜方法存放于 4， 保存备用。 0024 5. 将制备的高侵染活性菌种材料投喂冬虫夏草寄主玉树钩蝠蛾 Thitarodes yushue。
39、nsi 幼虫， 每头幼虫投放 5 10 克， 使寄主幼虫取食并充分接触菌种材料， 10 天后采 用显微镜检查及分子生物方法检测玉树钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统 计， 玉树钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率约为 98.4。 0025 实施例二 0026 1. 在青藏高原海拔 4500 米的铁路运输便利的地区， 以 20m20m 为一个单位建造 自动化控制气候条件的高寒植物栽培室， 栽培室内设置 10 层培养架用于放置植物苗培养 说 明 书 CN 104304016 A 7 6/10 页 8 瓶 ； 栽培室内安装常规工业冷库用中央空调通风系统调节栽培室内空气温度 ； 安装喷雾式 管路与中央。
40、空调系统共同调节栽培室内空气湿度 ； 培养架安装日光灯光照系统， 对栽培植 物提供光照 ； 利用活性炭微滤膜空气过滤系统， 保持栽培室内无尘、 清洁状态 ； 栽培室内安 装紫外灯， 定期消毒， 工作人员进入栽培室前， 在更衣室更换消毒过的工作服、 鞋、 帽等。 0027 2. 在西藏那曲冬虫夏草主产区海拔 5200 米的高寒草甸采集高山嵩草 (Kobrasia pygmaea)、 矮生嵩草 (Kobrasia humilis)、 苔草 (Carex moorcroftii)、 风毛菊 (Saussurea superba)、 圆穗蓼 (Polygonum macrophytum)、 叉枝蓼 (。
41、Polygonum tortuonum)、 珠芽蓼 (Polygonum viviparum)、 高山唐松草 (Thactriun alpinun)、 矮火绒草 (Leontopodium alpinum)、委 陵 菜 (Potentilla anserine)、火 绒 草 (Leonlopodium)、斑 唇 马 先 蒿 (Pedicularis longifora)、 黑褐苔草 (Carex atrofusca) 高寒植物的嫩苗或种子， 通过常 规植物离体组织培养快速繁殖技术， 在栽培室内用 LS 培养基及植物激素 NAA(0.02mg/L)、 IBA(0.4mg/L)、 TDZ(0.2m。
42、g/L) 及 GA3(0.4mg/L) 快速繁殖和栽培高寒植物组培苗， 通过自动 化控制栽培室的波动温度保持在夜 2昼 18， 空气湿度保持在 65 95， 离体组培快 繁植物苗接受的光照强度为 1000 2000lx， 光照时间 10 16 小时， 使组培苗旺盛生长并 获得高寒植物苗。 0028 3. 从西藏冬虫夏草产区采集新鲜冬虫夏草， 采用常规马铃薯培养基分离纯化菌 种， 经分子生物学方法及形态学方法鉴定为中国被毛孢 (Hirsutella sinensis)， 进一步经 通常的大麦固态培养基在 135发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生 孢子， 将发酵获得的菌团用搅拌器均匀。
43、打碎， 并按发酵物重量与水体积比1100进一步将 菌丝体及分生孢子或芽生孢子稀释搅匀成的悬浮液， 将培养基颗粒物用孔径 2mm 的纱布粗 过滤后， 作为冬虫夏草菌源。 0029 4. 将制备的冬虫夏草菌源用灭菌的注射器均匀喷淋接种到栽培室的高寒植物组 培苗上， 每瓶喷入5ml菌悬液， 在1天内喷施接种2次， 喷施后利用2080lx的低强度散射 光进行光照， 通过人工或自动化控制栽培室内温度在135， 空气湿度保持在7090， 共生培育 5 天后， 激活冬虫夏草菌中国被毛孢的侵染活性 ； 经显微镜检查共培养的冬虫夏 草菌中国被毛孢菌丝与高寒植物根、 叶、 茎组织缠绕形成大量共生体， 经分子检验为。
44、中国被 毛孢后， 可直接作为对寄主钩蝠蛾幼虫具有高侵染活性的菌种材料。 0030 5. 寄主蒲氏钩蝠蛾 (Thitarodes pui) 幼虫投置到冬虫夏草菌中国被毛孢与高寒 植物组培苗形成共生体的培育瓶内， 每瓶控释 5 10 头， 使蒲氏钩蝠蛾幼虫取食并充分接 触高侵染活性的共生体菌种材料， 14 天后将蒲氏钩蝠蛾幼虫从瓶中挖出采用显微镜检查及 分子生物方法检测蒲氏钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计， 蒲氏钩蝠蛾幼 虫被中国被毛孢侵染率为 98.9。 0031 实施例三 0032 1. 在工业配套设施齐全、 物资运输便捷的工业区， 以长 20m 宽 10m 为一个单位 建设， 建。
45、造自动化控制气候条件的高寒植物栽培室， 栽培室内设置 3 层灭菌土壤培养架 ； 栽 培室内安装常规工业冷库用中央空调通风系统调节栽培室内空气温度 ； 安装喷雾式管路与 中央空调系统共同调节栽培室内空气湿度 ； 培养架安装日光灯光照系统， 对栽培植物提供 光照 ； 利用活性炭微滤膜空气过滤系统， 保持栽培室内无尘、 清洁状态 ； 栽培室内安装紫外 灯， 定期消毒， 工作人员进入栽培室前， 在更衣室更换消毒过的工作服、 鞋、 帽等。 说 明 书 CN 104304016 A 8 7/10 页 9 0033 2. 在 海 拔 2900 4600m 的 冬 虫 夏 草 适 生 地 区 域 采 集 西 。
46、藏 大 黄 (Rheum tibeticum)、 小大黄 (R.pumilum)、 斑唇马先蒿 (Pedicularis longifora)、 昌都马先蒿 (P.sherriffi i)、 草甸马先蒿 (P.roylei)、 钩柱唐松草 (Thalictrum uncatum)、 高山唐松草 (T.alpinun) 植株或种子， 通过常规植物离体组织培养快速繁殖技术， 在栽培室培养瓶内用 BL 培养基及植物激素 IAA(0.1mg/L)、 2， 4-D(0.2mg/L)、 KT(0.2mg/L) 及 ABA(0.5mg/L) 快速 繁殖和栽培高寒植物组培苗， 然后将组培苗移栽到杀菌处理过的栽。
47、培室洁净土壤中， 通过 自动化控制栽培室的波动温度保持在夜 4昼 20， 空气湿度保持在 65 85， 离体组 培快繁植物苗接受的光照强度为6001500lx， 光照时间1012小时， 使组培苗旺盛生长 并获得高寒植物苗。 0034 3. 将室内栽培获得的洁净冬虫夏草喷发的子囊孢子套袋收集， 直接用无菌生理盐 水稀释制成子囊孢子悬浮液， 通过显微镜计数使每毫升悬浮液中含有 100 个子囊孢子， 作 为冬虫夏草菌源。 0035 4. 将制备的冬虫夏草菌源， 用消毒过的喷雾器均匀喷淋接种到栽培室灭菌土壤中 的高寒植物组培苗上， 每平方米喷 100ml 菌悬液， 在 1 天内喷施接种 2 次， 喷施。
48、后利用 50 100lx 的低强度散射光进行光照， 通过人工或自动化控制栽培室内温度在 135， 空气湿 度保持在 70 90， 共生培育 7 天后， 激活冬虫夏草菌中国被毛孢的侵染活性 ； 经显微镜 检查共培养的冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝与高寒植物根、 叶、 茎组织缠绕形成大量共生体， 经分子检验为中国被毛孢后， 可直接作为对寄主钩蝠蛾幼虫具有高侵染活性的菌种材料。 0036 5. 寄主虫草钩蝠蛾 (Thitarodes armoricanus) 幼虫投置到冬虫夏草菌中国被毛 孢与高寒植物组培苗形成共生体的灭菌土壤培育区， 每平方米约控释 100 头， 使虫草钩蝠 蛾幼虫取食并充分接触高侵染活。
49、性的共生体菌种材料， 15 天后将虫草钩蝠蛾幼虫从土壤中 挖出采用显微镜检查及分子生物方法检测虫草钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。 经统计， 虫草钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率约为 95.8。 0037 实施例四 0038 1.在电网及交通方便的高山平台区域， 以长20m宽15m为一个单位建设， 建造自 动化控制气候条件的高寒植物栽培室， 栽培室内设置 4 层灭菌土壤培养架 ； 栽培室内安装 常规工业冷库用中央空调通风系统调节栽培室内空气温度 ； 安装喷雾式管路与中央空调系 统共同调节栽培室内空气湿度 ； 培养架安装日光灯光照系统， 对栽培植物提供光照 ； 利用 活性炭微滤膜空气过滤系统， 保持栽培室内无尘、 清洁状态 ； 栽培室内安装紫外灯， 定期消 毒， 工作人员进入栽培室前， 在更衣室更换消毒过的工作服、 鞋、。