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1、(10)申请公布号 CN 103819488 A (43)申请公布日 2014.05.28 CN 103819488 A (21)申请号 201410057153.X (22)申请日 2014.02.20 C07D 498/18(2006.01) (71)申请人 浙江万马药业有限公司 地址 311305 浙江省杭州市临安市青山湖街 道王家山路 1 号 (72)发明人 桂盼 单瑞平 孙克 李永和 鲍毅 李倩 (74)专利代理机构 浙江杭州金通专利事务所有 限公司 33100 代理人 向庆宁 (54) 发明名称 一种他克莫司已知杂质他克莫司位置异构体 的制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种他。
2、克莫司已知杂质他克莫 司位置异构体的制备方法， 包括以他克莫司为原 料药， 通过异构化反应、 纯化、 重结晶等反应， 制备 他克莫司位置异构体。通过对他克莫司杂质的合 成， 为他克莫司杂质的定性及定量分析提供对照 品， 从而建立他克莫司的质量标准， 为他克莫司的 质量研究、 安全用药等提供重要的指导意义。且 本发明具有合成路线短， 操作简单， 所的产品纯度 高， 可应用于质量标准、 对照品研究等特点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 10 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图10页 (10)申请公布号。
3、 CN 103819488 A CN 103819488 A 1/1 页 2 1. 已知杂质他克莫司位置异构体的制备方法， 其特征在于经过以下步骤 ： (1) 以他克莫司为起始原料， 于一种有机溶剂中发生异构化反应生成他克莫司位置异构体， 反 应体系的温度为 130140C;（2） 用柱层析层析步骤 （1） 的产物获得粗品他克莫司位置异 构体， 其中洗脱剂为正己烷和丙酮的混合溶剂 ;（3） 步骤 （2） 中的粗品杂质用乙酸乙酯和 正己烷的混合溶剂重结晶数次， 获得纯品杂质。 2. 根据权利要求 1 的所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 （1） 中， 所述的异构化反应在 惰性气体保护下进行。 。
4、3. 根据权利要求 1 的所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 （1） 中， 所述的有机溶剂为无 水二甲苯、 甲苯中的一种或几种。 4. 根据权利要求 1 的所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 （2） 中， 所述的正己烷与丙酮 混合溶剂体积比为 1:18:1。 5. 根据权利要求 1 的所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 （3） 中， 所述的乙酸乙酯与丙 酮混合溶剂体积比为 1:18:1。 权 利 要 求 书 CN 103819488 A 2 1/7 页 3 一种他克莫司已知杂质他克莫司位置异构体的制备方法 技术领域 0001 本发明属于药物化学领域， 具体涉及他克莫司已知杂质的制备方法。。
5、 背景技术 0002 他克莫司 （tacrolimus） 即 FK506， 是由日本藤泽制药公司于 1982 年提取的一种真 菌代谢产物， 是 1985 年从链球菌的发酵液中提取的大环类代谢产物。他克莫司是全球首个 获批准的非皮质类固醇类外用免疫调节剂， 所谓局部免疫调节剂， 是通过刺激皮肤局部的 免疫因子而产生治疗作用的一类药物。由于这类药物为局部外用， 不具有系统性的免疫抑 制作用， 因此不良反应小。 0003 他克莫司对 T 细胞具有选择性的抑制作用， 主要是通过抑制 TH 细胞释放 IL-2、 IL-3、 IFN-， 以及抑制 IL-2R 的表达而发挥其强大的免疫抑制作用。是世界上非激。
6、素治疗 特异性皮炎 （AD） 的第一种外用免疫调节剂。适用于防治器官移植后的排斥反应， 其临床疗 效是环孢菌素 A（CsA） 的 100 倍。 0004 1993 年首次在日本上市， 1994 年获 FDA 批准， 现已在 50 多个国家和地区上市销 售。在中国上市的有胶囊、 注射液、 软膏以及滴眼液。目前他克莫司软膏获批 (FDA、 CFDA 批 准 ) 的适应症是因潜在危险而不宜使用传统疗法 , 或对传统疗法反应不充分， 或无法耐受 传统疗法的中至重度特应性皮炎患者， 作为短期或间歇性长期治疗。其中 0.03% 他克莫司 软膏被批准用于2岁的儿童及成人AD患者， 0.1%他克莫司软膏被批准。
7、用于成人AD患者 ； 他克莫司胶囊、 注射液的适应症为 （1） 预防肝脏或肾脏移植术后的移植物排斥反应 （2） 治 疗肝脏或肾脏移植术后应用其他免疫抑制药物无法控制的移植物排斥反应。 0005 对他克莫司杂质的相关研究意义非常重大， 他可以用于他克莫司研发生产中杂质 的定性及定量分析， 从而建立他克莫司的质量标准， 为他克莫司的质量研究、 对照品研究、 安全用药等提供重要的指导意义。 0006 美国药典 USP37 版他克莫司胶囊标准收载了他克莫司已知杂质他克莫司位置 异 构 体， 其 化 学 名 称 为 ： -7,8,10,13,14,15,16,17,18,19,20,21,26,22,2。
8、8,28a- 十 六 氢 -7,21- 二羟基 -3-(4- 羟基 -3- 甲氧环己基 )-16,18- 二甲氧基 -4,6,12,14,20- 五甲 基 -17,21- 环氧 -3H- 吡啶 2,1-c1,4 氧杂氮杂环二十五碳烯 -1,9,22,23(6H,25H)- 四 酮， 其结构式分别如下 ： 0007 说 明 书 CN 103819488 A 3 2/7 页 4 发明内容 0008 本发明的目的是提供上述他克莫司已知杂质的制备方法。 0009 本发明的目的可以通过以下措施达到 ： 0010 已知杂质他克莫司位置异构体 （Tacrolimus regioisomer） 的制备方法， 。
9、其特征在 于经过以下步骤 ： 0011 0012 （1） 以他克莫司为起始原料， 于一种有机溶剂中发生异构化反应生成他克莫司位 置异构体， 反应体系的温度为 130 140 ; 0013 （2） 用柱层析获得粗品他克莫司位置异构体， 洗脱剂为正己烷和丙酮的混合溶剂 ; 0014 （3） 粗品杂质用乙酸乙酯和正己烷的混合溶剂重结晶数次， 获得纯品杂质。 0015 在一些优选的方式中， 步骤 （1） 中， 所述的消除反应在惰性气体保护下进行。惰性 气体优选为氮气。 0016 在一些优选的方式中， 步骤 （1） 中， 所述的一种有机溶剂为无水二甲苯、 甲苯中的 一种或几种。优选无水二甲苯。 0017。
10、 在一些优选的方式中， 在步骤 （2）中， 所述的正己烷与丙酮混合溶剂体积比为 1:1 8:1。优选体积比为 4:1。 0018 在一些优选的方式中， 在步骤 （3）中， 所述乙酸乙酯与丙酮混合溶剂体积比为 1:1 8:1。优选体积比为 5:1。 0019 本发明以他克莫司为原料， 通过异构化反应、 纯化、 重结晶等反应， 制备他克莫司 位置异构体 （Tacrolimus regioisomer） 。通过对他克莫司杂质的合成， 为他克莫司杂质的 说 明 书 CN 103819488 A 4 3/7 页 5 定性及定量分析提供对照品， 从而建立他克莫司的质量标准， 为他克莫司的质量研究、 安全 。
11、用药等提供重要的指导意义。 附图说明 0020 图 1.Tacrolimus regioisomer（他克莫司位置异构体） 红外光谱图。 0021 图 2.Tacrolimus regioisomer（他克莫司位置异构体） 紫外光谱图。 0022 图 3.Tacrolimus regioisomer（他克莫司位置异构体） 核磁共振氢谱。 0023 图 4.Tacrolimus regioisomer（他克莫司位置异构体） 核磁共振碳谱。 0024 图 5.Tacrolimus regioisomer（他克莫司位置异构体） 核磁共振 1H-1H COSY 谱。 0025 图 6.Tacrolim。
12、us regioisomer（他克莫司位置异构体） 核磁共振 NOESY 谱。 0026 图 7.Tacrolimus regioisomer（他克莫司位置异构体） 核磁共振 HSQC 谱。 0027 图 8.Tacrolimus regioisomer（他克莫司位置异构体） 核磁共振 HMBC 谱。 0028 图 9.Tacrolimus regioisomer（他克莫司位置异构体） ESI 图。 0029 图 10.Tacrolimus regioisomer（他克莫司位置异构体） HPLC 图。 0030 有益效果 0031 本发明具有合成路线短， 操作简单， 所的产品纯度高， 可应该用。
13、于质量标准、 对照 品研究等特点。 具体实施方式 0032 实施例 1 ： Tacrolimus regioisomer（他克莫司位置异构体） 的制备 0033 1、 他克莫司位置异构体 (Tacrolimus regioisomer) 的制备方法 0034 （1） 将原料他克莫司 （40g,49.6mmol） 溶于无水二甲苯 （800ml） ， 氮气保护下， 将反 应液加热到 130 140回流 24 小时， TLC（薄层色谱） 监控反应进行， 点板显示原料点消 失， 停止反应。 0035 （2） 当原料消失后， 将反应液冷却到室温， 控制水浴 70时旋蒸除去溶剂， 得到的 粘稠油状物用柱层。
14、析 （洗脱剂正己烷 ： 丙酮 4 ： 1） 纯化， 得到白色的发泡状固体粗品。 0036 （3） 粗品再用乙酸乙酯/正己烷 （5 ： 1） 重结晶两次， 得到Tacrolimus regioisomer （他克莫司位置异构体） 的白色固体 （5.8g， HPLC 纯度 ： 98.54） ， 收率 ： 14.5。 0037 2. 结构确证 0038 2.1 红外光谱 0039 测试条件 ： KBr 压片法 0040 测试结果 ： 主要的吸收峰及归属列于表 1， 谱图见图 1。 0041 表 1、 红外光谱数据列表 0042 说 明 书 CN 103819488 A 5 4/7 页 6 0043 。
15、0044 2.2 紫外光谱 0045 测试条件 ： 溶剂为乙腈， 扫描范围 （200nm-800nm） 。 0046 测试结果 ： 紫外光谱显示在 200nm 处有最大吸收。紫外吸收光谱见图 2。 0047 2.3 核磁共振谱 0048 测试条件 ： 溶剂为 CDCl3 0049 测试项目 ： 1H-NMR,13C-NMR,1H-1H COSY,HSQC,HMBC,NOESY 0050 测试结果 ： 样品 NMR 谱图见图 3-8， 归属情况列于表 2。 0051 表 2、 核磁共振氢谱、 碳谱数据列表 0052 说 明 书 CN 103819488 A 6 5/7 页 7 0053 说 明 。
16、书 CN 103819488 A 7 6/7 页 8 0054 2.4ESI-MS 0055 测试条件 ： 离子源模式 ： ESI 正离子模式， 干燥气体流速 8.0L/min, 干燥气体温度 350， 毛细管电压 3000V, 碰撞诱导解离 70V, 雾化室压力 35Psi. 0056 结果分析 ： 样品的 ESI-MS 报告见图 9， ESI-MS 观测到的主要离子归属为 m/ z=827(M+Na+),m/z=787(M-OH+)。 0057 2.5 纯度测定 0058 测试条件 ： 0059 流动相 :A: 乙腈 (0.05%TFA)B: 水 (0.05%TFA) 0060 梯度 :A。
17、 from5%to100%for5.0min and hold100%for1.0min; 0061 流速 :2.0ml/min 0062 色谱柱 :Waters XBridge-C18,4.650mm,3.5um 0063 柱温 :40 0064 测试结果 ： HPLC 报告见图 10， 样品平均纯度 98.54%。 0065 3. 结论 说 明 书 CN 103819488 A 8 7/7 页 9 0066 样品质谱 ESI-MS m/z827M+Na+， 推出它的分子式为 C44H69NO12； 氢谱显示， 25 号碳上氢的化学位移为 2.6 和 26 号碳上氢的化学位移为 5.25 跟。
18、文献 （Tetrahedron Letters,1990,131,6477-6480）中数据一致， 可以说明 C26-C28 处发生重排。结合核磁 共振、 质谱等数据结果以及文献报道 （Tetrahedron Letters,1990,131,6477-6480）可 以确定本发明的方法合成的结构就是预期的结构 ： -7,8,10,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,26,22,28,28a- 十六氢 -7,21- 二羟基 -3-(4- 羟基 -3- 甲氧环己基 )-16,18- 二甲氧 基 -4,6,12,14,20- 五甲基 -17,21- 环氧 -3H- 吡啶 2,1-。
19、c1,4 氧杂氮杂环二十五碳 烯 -1,9,22,23(6H,25H)- 四酮， 而且其纯度很高为 98.54%。其光谱数据为 ： 0067 IR(KBr)max cm-1： 3534.84,2938.12,1716.68,1645.16,1147.17;1H-NMR(400MH z,CDCl3):1.68(1H,m,H-17);1.88-1.97(1H,m,H-18);5.10(1H,d,J=10.0Hz,H-20); 3.30(1H,m,H-21);2.22-2.67(1H,dd,J=18.6,1.6Hz,H-23);3.89(1H,m,H-24);2. 58(1H,m,H-25);5.2。
20、5(1H,d,J=9.6Hz,H-26);4.98(1H,m,H-28);1.83(1H,m,H-29); 1.03(1H,d,J=6.5Hz,H-35);1.02(1H,d,J=6.5Hz,H-36);1.73(1H,s,H-37);2.19- 2.48(1H,m,H-38);5.69(1H,m,H-39);4.99-5.03(1H,m,H-40);0.78(1H,d,J=6.5Hz, H-41);1.67(1H,s,H-42);13C-NMR(400MHz,CDCl3):25.7(C-17);49.39(C-18);123 .35(C-20);52.14(C-21);44.89(C-23)。
21、;71.33(C-24);37.88(C-25);127.92(C- 26);80.57(C-28);39.03(C-29);16.17(C-35);18.30(C-36);15.39(C-37); 34.65(C-38);135.58(C-39);116.54(C-40);17.64(C-41);17.31(C-42); 正 离 子 ESIMS:m/z827M+Na+,m/z787M-OH+,ESIMS:m/z827C44H69NO12Na+。 说 明 书 CN 103819488 A 9 1/10 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 103819488 A 10 2/10 页 11。
22、 图 2 说 明 书 附 图 CN 103819488 A 11 3/10 页 12 图 3 说 明 书 附 图 CN 103819488 A 12 4/10 页 13 图 4 说 明 书 附 图 CN 103819488 A 13 5/10 页 14 图 5 说 明 书 附 图 CN 103819488 A 14 6/10 页 15 图 6 说 明 书 附 图 CN 103819488 A 15 7/10 页 16 图 7 说 明 书 附 图 CN 103819488 A 16 8/10 页 17 图 8 说 明 书 附 图 CN 103819488 A 17 9/10 页 18 图 9 说 明 书 附 图 CN 103819488 A 18 10/10 页 19 图 10 说 明 书 附 图 CN 103819488 A 19 。