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1、(10)申请公布号 CN 103820943 A (43)申请公布日 2014.05.28 CN 103820943 A (21)申请号 201410086635.8 (22)申请日 2014.03.11 D04H 1/4266(2012.01) D04H 1/76(2012.01) D01D 5/00(2006.01) D01F 4/02(2006.01) D01F 11/02(2006.01) A61L 27/22(2006.01) A61L 27/56(2006.01) (71)申请人 武汉大学 地址 430072 湖北省武汉市武昌区珞珈山武 汉大学 (72)发明人 王家伟 丁慧芬 (7。
2、4)专利代理机构 武汉科皓知识产权代理事务 所 ( 特殊普通合伙 ) 42222 代理人 张火春 (54) 发明名称 大孔三维有序取向性丝素蛋白纳米纤维支架 及其制备方法 (57) 摘要 本发明提供一种大孔三维有序取向性丝素蛋 白纳米纤维支架及其制备方法， 本发明主要运用 静电纺丝的方法， 通过乙醇浴滚筒收集的方法来 实现。所述的乙醇浴滚筒法的特点是导电性滚 筒一部分浸没在乙醇中， 因为乙醇具有低表面张 力， 可使所制备的丝素蛋白纳米纤维浸润分散其 中从而导致丝与丝之间的间隙扩大， 同时滚筒可 以旋转运动， 使得收集的丝可以朝一个方向有序 排布。利用本发明所制得的丝素蛋白三维纤维支 架的特点是。
3、纤维支架中纤维直径在10nm到10m 之间， 纤维呈有序取向性排列， 纤维之间平均角度 在 0-30， 纤维支架具有三维立体结构， 厚度为 0.05-5mm， 纤维间孔径为 0-30m。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103820943 A CN 103820943 A 1/1 页 2 1. 一种大孔三维有序取向性丝素蛋白纳米纤维支架的制备方法 , 其特征在于 ： 步骤如 下 ： （1） 以蚕茧为原料， 经过脱胶、 溶解、 透析。
4、、 干燥后获得再生丝素蛋白 ； （2） 以二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶液为溶剂， 配制质量分数为 6-20% 的再生丝素蛋 白溶液 ； （3） 将上步所得再生丝素蛋白溶液进行静电纺丝， 在乙醇溶液中用滚筒收集法收集， 得 到有序取向的丝素蛋白纳米纤维粗品 ； 所述滚筒收集法中滚筒筒体水平放置， 滚筒体积的 1/3-1/2 浸没在乙醇溶液中 ； （4） 将上步所得丝素蛋白纳米纤维， 浸泡在7%浓度的氨水中浸泡20-30分钟， 再在去离 子水中漂洗 3-6 遍， 最后进行冷冻干燥得到大孔三维有序取向性丝素蛋白纳米纤维支架。 2. 如权利要求 1 所述的大孔三维有序取向性丝素蛋白纳米纤维支架的制备方法。
5、， 其特 征在于 ： 所述步骤 3 中静电纺丝的电压为 16-30kv、 给液速度为 0.0005-0.003mm/s ； 收集距 离为 7-15cm ； 滚筒的直径为 2-10cm， 滚筒旋转频率为 6-30Hz。 3. 如权利要求 1 或 2 所述的大孔三维有序取向性丝素蛋白纳米纤维支架的制备方法， 其特征在于 ： 所述滚筒为空心圆筒， 其材料为铜或铁或铝， 或者是锡箔纸包裹的高分子空心 圆筒。 4. 如权利要求 1 所述的大孔三维有序取向性丝素蛋白纳米纤维支架的制备方法， 其特 征在于 ： 所述步骤 2 中二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶液质量比为二氯甲烷 ： 三氟乙酸等于 3:7。 5. 一。
6、种利用权利要求 1 所述制备方法制备的纳米纤维支架， 其特征在于 ： 纤维支架中 纤维直径在10nm到10m之间， 纤维呈有序取向性排列， 纤维之间平均角度在0-30， 纤维 支架具有三维立体结构， 厚度为 0.05-5mm， 纤维间孔径为 0-30m。 权 利 要 求 书 CN 103820943 A 2 1/5 页 3 大孔三维有序取向性丝素蛋白纳米纤维支架及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于组织工程支架材料领域， 更具体地， 涉及一种大孔三维有序取向性丝 素蛋白纳米纤维支架及其制备方法。 背景技术 0002 由于疾病创伤导致组织和器官不同程度的损伤， 其中有一部分组织损伤通过机体。
7、 自我修复能力很难甚至无法完全恢复。 组织工程就是研究怎样促进损伤修复甚至达到组织 与器官的再生的目的。 其中， 支架作为细胞、 生长因子及药物的载体是组织工程中关键性因 素之一。最理想的支架材料是模仿组织的细胞外基质 （ECM） 成分和结构， 从而模拟细胞外 环境促进细胞的生长。 0003 天然细胞外基质成分被很多人用于组织工程支架的制作， 包括胶原蛋白、 透明质 酸等， 虽然具有良好的生物活性， 但机械和加工性能不如合成材料， 而且成本高、 来源不易。 无细胞毒性、 可降解的合成材料虽具有良好机械和加工性能， 但其生物活性较差 ； 为兼顾两 者的一些优点， 很多研究者将二者混合使用。 也有。
8、些学者开发了其他生物大分子材料， 这些 材料常具有广泛的来源， 制造成本低， 且具有良好的生物活性同时有较好的机械和加工性 能， 本发明中所用再生丝素蛋白即为其中一种， 被广泛运用于各种组织工程中。 0004 不同组织具有不同的细胞外基质结构， 支架材料的孔径、 孔隙率、 纤维直径及分 布和纤维走向应相应发生变化， 从而影响细胞的行为。Chen 等在有序或无序的二维或 三维共四种支架上培养细胞， 得到在不同结构形式的支架上细胞形态、 增殖、 迁移及分化 等方面有很明显区别。 （Chen,X.,X.Fu,et al.“Regulation of the osteogenesis of pre-o。
9、steoblasts by spatial arrangement of electrospunnanofibers in two-and three-dimensional environments.“Nanomedicine:Nanotechnology,Biology and Medicine） 。 0005 在间充质组织的 ECM 中， 胶原蛋白是最主要的蛋白成分， 占蛋白成分的 90%。这些 胶原蛋白主要是以纳米纤维的形式存在， 其排列在部分组织中是有序的， 如神经、 韧带、 肌 肉、 骨等， 在其他组织则无特定走向。胶原蛋白纤维不仅为不同组织提供了独特的机械性 能， 也极大的影响到。
10、细胞的行为。模仿胶原蛋白纤维制作的支架是一种很好的选择。 0006 研究者们用不同的方法得到了纤维支架， 并发现细胞在这些纤维尤其是纳米纤维 支架上可以很好的生长。目前， 得到纳米纤维的方法主要有相分离、 自组装和静电纺丝， 在这些方法中， 运用静电纺丝的方法， 可以得到 10nm 到微米级的纤维丝， 和其他方法比 较， 它具有操作简便、 效率高、 可用的原材料广泛， 纤维和支架性能可调、 可制作有序性结 构等优点 （K.Jayaraman,et al.,Recent advances in polymer nanofibers,Journal of Nanoscience and Nanot。
11、echnology4(2004)5265.） 。 0007 运用传统静电纺丝得到的纳米纤维支架， 通常过于致密， 阻碍了细胞的扩散， 并且 随着丝的沉积， 改变了电场， 使得支架很难做厚。为了提高孔径， 目前研究者主要通过以 下方法来实现 ： 沥滤法、 光刻蚀法、 微 - 纳米纤维复合法和超声法等。但这些方法有些破 说 明 书 CN 103820943 A 3 2/5 页 4 坏了纤维原有结构， 有些使得材料内部结构不均匀。另外一些研究者用改变接收装置的 方法来提高孔径， 力求在不破坏纺丝结构的前提下达到目的。Blakeney 等将接收装置改 成一个插着不锈钢针的泡沫空心半球， 得到了一种集中。
12、的、 低密度、 不受挤压的静电纺丝 支架， 形似棉花团。细胞实验显示， 这种方法得到的纤维支架和传统方法比较， 孔径和厚 度都有所提高， 促进了细胞的生长和扩散。但这种方法只能得到无序的纤维， 对于有序取 向性组织则不能提供更合适的支架 （Blakeney,B.A.,A.Tambralli,et al.(2011).“Cell infiltration and growth in a low density,uncompressed three-dimensional electrospunnanofibrous scaffold.“Biomaterials32(6):1583-1590.） 。
13、。 0008 用静电纺丝法得到有序性纤维， 主要通过平行电极和滚筒两种方法。其中平行电 极得到的纤维材料纤维取向性好， 但尺寸小， 限制了其应用。而滚筒收集到的纤维材料尺 寸大， 但纤维取向性不够好， 而提高取向性需要提高拉丝力量， 机械性能差点的纤维容易被 拉断。另外和传统纺丝一样， 它只能做成致密的， 薄的纤维膜。Chen 等用一层细胞一层支 架累加的方法得到一种三维的， 细胞长入其中的有序支架， 但这种支架制作复杂， 操作需要 大量的时间， 而细胞的可操作时间有限， 进一步提高厚度较困难。另外， 这种支架是很薄的 单层支架的累加， 材料连贯性和均一性差， 必须借用外力才能维持形态， 限制。
14、了其体内运 用 （Chen,X.,X.Fu,et al.“Regulation of the osteogenesis of pre-osteoblasts by spatial arrangement of electrospunnanofibers in two-and three-dimensional envi ronments.“Nanomedicine:Nanotechnology,Biology and Medicine） 。 0009 综上所述， 本领域中存在着对制备大孔三维有序取向性纳米纤维支架的技术改进 要求。 发明内容 0010 针对现有技术的以上缺陷或技术需求， 本发明。
15、的目的是提供一种大孔三维有序取 向性丝素蛋白纳米纤维支架的制备方法， 具备操作简便、 可获得结构均匀、 三维立体、 疏松 多孔的有序取向性丝素蛋白纳米纤维支架的特点。 0011 其具体技术方案如下 ： 0012 一种大孔三维有序取向性丝素蛋白纳米纤维支架的制备方法 , 其特征在于 ： 步骤 如下 ： 0013 （1） 以蚕茧为原料， 经过脱胶、 溶解、 透析、 干燥后获得再生丝素蛋白 ； 0014 （2） 以二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶液为溶剂， 配制质量分数为 6-20% 的再生丝 素蛋白溶液 ； 0015 （3） 将上步所得再生丝素蛋白溶液进行静电纺丝， 然后在乙醇溶液中用滚筒收集 法收集，。
16、 得到有序取向的丝素蛋白纳米纤维粗品 ； 0016 所述滚筒收集法中滚筒筒体水平放置， 滚筒体积的 1/3-1/2 浸没在乙醇溶液中 ； 0017 所述的乙醇以圆形平底玻璃皿盛放。 0018 （4） 将上步所得丝素蛋白纳米纤维粗品， 浸泡在7%浓度的氨水中浸泡20-30分钟， 再在去离子水中漂洗 3-6 遍， 最后进行冷冻干燥得到大孔三维有序取向性丝素蛋白纳米纤 维支架。 0019 所述步骤3中静电纺丝的电压为16-30kv、 给液速度为0.0005-0.003mm/s ； 收集距 说 明 书 CN 103820943 A 4 3/5 页 5 离为 7-15cm ； 滚筒的直径为 2-10cm。
17、， 高度为 5-15cm ； 滚筒旋转频率为 6-30Hz ； 玻璃皿的直 径为 10-20cm， 高为 2-5cm。 0020 所述滚筒为空心圆筒， 其材料为铜或铁或铝， 或者是锡箔纸包裹的高分子空心圆 筒。 0021 所述步骤 2 中二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶液质量比为二氯甲烷 ： 三氟乙酸等于 3:7。 0022 本发明主要依赖现有的静电纺丝技术， 该技术主要是可挥发的溶剂溶解高分子材 料形成静电纺丝所用溶液， 通过高压电场对溶液的作用在喷射装置的尖端形成泰勒锥， 在 一个合适的电压下， 溶液中分子最终突破液体表面张力形成射流， 在空中发生旋转鞭动等 变化， 伴随着溶剂挥发， 最后剩下高。
18、分子纤维乘积在收集装置上。 形成的高分子纤维网络可 以运用到物理、 化学、 医学等多个领域。 0023 本发明选用的原材料再生丝素蛋白具有广泛的来源， 制造成本低、 良好的生物活 性及较好的机械和加工性能。常被用于组织工程支架的研究。 0024 本发明主要通过一种乙醇浴滚筒收集法来实现。所述的乙醇浴滚筒法的特点是 导电性滚筒一部分浸没在乙醇中， 因为乙醇具有低表面张力， 可使所制备的丝素蛋白纳米 纤维浸润扩散其中从而导致丝与丝之间的间隙扩大， 同时滚筒可以在马达的带动下旋转运 动， 使得收集的丝可以朝一个方向有序排布。 0025 喷向收集装置的丝素蛋白纤维一部分沉积在滚筒上， 然后被迅速的带到。
19、乙醇中 ； 一部分浸没到滚筒附近的乙醇溶液中， 被滚动的滚筒卷上滚筒表面。这些被打湿的丝素蛋 白纤维会因为粘带了乙醇变重， 和干燥状况下比较， 滚筒需要更大的力量去牵拉它， 这种力 量更大的牵拉比同条件干燥状况下滚筒收集更容易形成有序结构， 一些纤维在相互靠近时 被吸附形成一束， 束与束之间让出了更大间隙， 从而形成了大孔的结构。 0026 对于传统静电纺丝过程， 纤维突破表面张力而喷出发射装置的行为常因已经沉积 的纤维形成的屏障消弱了电场而终止， 最终导致收集的纤维膜很薄。而浸泡在乙醇中的纤 维被滚筒卷起以后， 聚集在较窄的范围内， 而对整体电场不造成较大影响， 使得纤维能连续 喷出， 而纤。
20、维的堆积也借助了乙醇的分子间作用力而能达到较大的厚度。 0027 对于传统的滚筒收集， 为了取得更有序的纤维， 通常需要提高滚筒速度来提高牵 拉力， 达到拉得更直的目的， 但对于很多生物大分子来说， 交联变成更稳定牢固的结构之 前， 其机械性能通常非常差， 而普通静电纺丝喷出的纤维常常由未交联的分子形成， 当速度 提高到一定的时候， 这些纤维很容易被拉断。我们所选用的再生丝素蛋白溶解在二氯甲烷 / 三氟乙酸溶液中的时候主要以有无规卷曲和 - 螺旋结构的形式存在， 这是一种不稳定 结构， 静电纺丝是个物理力学的作用的过程， 所以在被喷出形成丝素蛋白纤维的时候仍然 是不稳定结构， 也就是说进入到乙。
21、醇之前的丝素蛋白纤维内部结构不牢固。然后， 包括乙 醇在内的醇溶液可对不稳定丝素蛋白进行交联， 使得无规卷曲和 - 螺旋结构变成稳定的 - 折叠结构， 从而使纤维内部分子形成稳定牢固的结合， 同时提高纤维的机械性能。在收 集的乙醇浴中， 丝素蛋白即发生构象改变， 形成的较为强韧的纤维在一定范围内， 即使提高 转速提高滚筒对其的牵拉力量， 也不容易被拉断。 0028 例外， 因为丝素蛋白纤维在收集过程中已经形成稳定结构， 不需要额外的交联步 骤， 也避免了额外交联导致的孔隙和支架整体的收缩。 说 明 书 CN 103820943 A 5 4/5 页 6 0029 综上所述， 所述的乙醇浴滚筒收集。
22、法可以得到具备大孔径， 三维立体结构且有序 的纳米纤维支架。通过本发明所制得的三维纤维支架的特点是纤维直径在 10nm 到 10m 之间， 纤维呈有序取向性排列， 纤维之间平均角度在 0-30， 并且具有三维立体结构， 厚度 为 0.05-5mm， 具备疏松大孔结构， 纤维间孔径为 0-30m。所述的纤维直径、 纤维之间平均 角度、 纤维之间孔径及支架厚度均与静电纺丝所用溶液浓度和粘滞度， 滚筒的速度， 喷头和 收集装置的距离等因素有关， 可调节这些因素以达到需要。 0030 通过本发明， 可得以到一种操作简便、 获得结构均匀、 三维立体、 疏松多孔的有序 取向性丝素蛋白纳米纤维支架的方法， 。
23、可被应用在骨、 神经、 肌腱、 肌肉、 纤维软骨、 血管等 组织工程中， 引导组织的修复再生。 附图说明 0031 图 1 静电纺丝以及收集过程示意图 ； 0032 图 2 纳米纤维支架实物图 ； 0033 图 3 纳米纤维支架扫描电镜图 ； 0034 在所有附图中， 相同的附图标记用来表示相同的元件或结构， 其中 ： 0035 1- 静电纺丝设备 2- 滚筒 3- 乙醇。 具体实施方式 0036 本发明中静电纺丝设备及技术均为现有技术。 0037 以下结合具体的实施例对本发明的技术方案进一步的说明。 0038 实施例一 ： 0039 1、 将蚕茧剪成 1cm2的小块， 用质量分数为 0.5%。
24、 的碳酸钠溶液 500mL 煮沸 1.5 小 时， 用去离子水清洗干净， 再在 500mL 去离子水中煮沸 0.5h， 用去离子水洗净后烘干。往 处理后的蚕丝中加入约 60mL 氯化钙 / 水 / 乙醇三相溶液 （三种物质的摩尔比为 1/8/2） ， 在 70水浴搅拌 1 小时使得蚕丝完全溶解， 再对所得的溶液透析 48 小时。透析完毕后的溶液 在 8000r/min 的条件下离心 30min 后过滤， 过滤得到的溶液进行液氮冷冻后干燥 48 小时， 最后得到再生丝素蛋白。 0040 2、 将再生丝素蛋白溶解在质量比为 3:7 的二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶液中， 配 制再生丝素蛋白质量分数为 。
25、6% 的静电纺丝所用溶液。 0041 3、 纺丝与收集 ： 0042 其中乙醇浴滚筒收集法的具体操作方法是 ： 将直径 10cm， 高 2cm 的玻璃皿盛满乙 醇， 并在其底部铺一层锡纸 ； 所用滚筒是直径为 2cm， 高 5cm 的滚筒， 其表面包裹一层锡箔 纸， 利用马达旋转带动滚筒进行转动。 将滚筒放置于盛满乙醇的培养皿中， 滚筒的浸没体积 为 1/2。 0043 静电纺丝使用电压为 16kv、 给液速度为 0.003mm/s、 收集距离为 7cm， 滚筒在乙醇 浴中以 30Hz 的频率转动。在上述条件下进行不同时间的静电纺丝， 可以在滚筒上收集不同 厚度的粗品。 0044 4、 静电纺。
26、丝完成后， 取下粗品， 放入7%的氨水溶液中浸泡30min,再用去离子水漂 洗 3-6 遍， 最后进行冷冻干燥， 得到成品。 说 明 书 CN 103820943 A 6 5/5 页 7 0045 5、 将得到的有序三维材料用紫外光、 75%乙醇或环氧乙烷消毒。 培养基浸泡后接种 骨髓基质干细胞、 IPS 细胞、 骨细胞、 神经细胞、 肌腱细胞、 牙周膜干细胞、 肌细胞等， 进行诱 导、 培养数周。将长有细胞的支架植入骨、 神经、 肌腱、 牙周膜、 肌肉等缺损处。 0046 实施例二 0047 1、 将蚕茧剪成 1cm2的小块， 用质量分数为 0.5% 的碳酸钠溶液 500mL 煮沸 1.5 。
27、小 时， 用去离子水清洗干净， 再在 500mL 去离子水中煮沸 0.5h， 用去离子水洗净后烘干。往 处理后的蚕丝中加入约 60mL 氯化钙 / 水 / 乙醇三相溶液 （三种物质的摩尔比为 1/8/2） ， 在 70水浴搅拌 1 小时使得蚕丝完全溶解， 再对所得的溶液透析 48 小时。透析完毕后的溶液 在 8000r/min 的条件下离心 30min 后过滤， 过滤得到的溶液进行液氮冷冻后干燥 48 小时， 最后得到再生丝素蛋白。 0048 2、 将再生丝素蛋白溶解在质量比为 3:7 的二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶液中， 配 制再生丝素蛋白质量分数为 20% 的静电纺丝所用溶液。 0049 3。
28、、 纺丝与收集 ： 0050 其中乙醇浴滚筒收集法的具体操作方法是 ： 将直径 20cm， 高 5cm 的玻璃皿盛满乙 醇， 并在其底部铺一层锡纸 ； 所用滚筒是直径为 10cm， 高 15cm 的滚筒， 其表面包裹一层锡箔 纸， 利用马达旋转带动滚筒进行运动。 将滚筒放置于盛满乙醇的培养皿中， 滚筒的浸没体积 为 1/3。 0051 静电纺丝使用电压为 30kv、 给液速度为 0.0005mm/s、 收集距离为 15cm， 滚筒在乙 醇浴中以 6Hz 的速度转动。在上述条件下进行不同时间的静电纺丝， 可以在滚筒上收集不 同厚度的样品。 0052 4、 静电纺丝完成后， 取下样品， 放入7%的。
29、氨水溶液中浸泡30min,再用去离子水漂 洗 3-6 遍， 最后进行冷冻干燥。 0053 5、 将得到的有序三维材料用紫外光、 75%乙醇或环氧乙烷消毒。 培养基浸泡后接种 骨髓基质干细胞、 IPS 细胞、 骨细胞、 神经细胞、 肌腱细胞、 牙周膜干细胞、 肌细胞等， 进行诱 导、 培养数周。将长有细胞的支架植入骨、 神经、 肌腱、 牙周膜、 肌肉等缺损处。 0054 通过本发明所制得的三维纤维支架的特点是纤维直径在 10nm 到 10m 之间， 纤维呈取向性有序排列， 纤维之间平均角度在 0-30， 并且具有三维立体结构， 厚度为 0.05-5mm， 具备疏松大孔结构， 纤维间孔径为 0-30m。所述的纤维直径、 纤维之间平均角 度、 纤维之间孔径及支架厚度均与静电纺丝所用溶液浓度和粘滞度， 滚筒的速度， 喷头和收 集装置的距离等因素有关， 可调节这些因素以达到需要。 说 明 书 CN 103820943 A 7 1/2 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103820943 A 8 2/2 页 9 图 3 说 明 书 附 图 CN 103820943 A 9 。