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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410503816.6 (22)申请日 2014.09.26 A61K 36/06(2006.01) A61P 1/04(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (71)申请人 上海市农业科学院 地址 201106 上海市闵行区北翟路 2901 号 (72)发明人 李亮 尚晓冬 谭琦 (74)专利代理机构 上海泰能知识产权代理事务 所 31233 代理人 黄志达 (54) 发明名称 一种猴头菌乙醇提取物的制备方法 (57) 摘要 本发明涉及一种猴头菌乙醇提取物的制备方 法， 包括 ： (1) 取猴头菌子实体粉碎成颗。
2、粒， 然后 溶于水中沸腾搅拌 1 3h， 静置冷却至室温后进 行超声提取， 然后进行离心， 静置后取上清液， 得 猴头菌水提取液 ； (2) 将猴头菌水提取液加入预 处理过的大孔树脂， 室温下吸附， 然后使用乙醇进 行洗脱， 干燥后得到猴头菌乙醇提取物。 本发明具 有良好的分离效果、 稳定性能和可循环重复利用 的特点， 适合于规模化生产 ； 而且大孔吸附树脂 吸附分离法具有有机溶剂用量少可回收、 可重复 性使用、 再生简单， 降低成本等诸多优点， 可用于 猴头菌中有效成分的富集分离和大工业生产。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页。
3、 说明书4页 (10)申请公布号 CN 104398539 A (43)申请公布日 2015.03.11 CN 104398539 A 1/1 页 2 1. 一种猴头菌乙醇提取物的制备方法， 包括 ： (1)取猴头菌子实体粉碎成颗粒， 然后溶于水中沸腾搅拌13h， 静置冷却至室温后进 行超声提取， 然后进行离心， 静置后取上清液， 得猴头菌水提取液 ； 其中猴头菌颗粒与水的 重量比为 1:5 10 ； (2) 将猴头菌水提取液加入预处理过的大孔树脂 HPD-100， 室温下吸附， 然后使用 70 100乙醇进行洗脱， 干燥后得到猴头菌乙醇提取物。 2. 根据权利要求 1 所述的一种猴头菌乙醇提。
4、取物的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 (1) 中的离心速度为 8000rpm， 离心时间为 10min。 3. 根据权利要求 1 所述的一种猴头菌乙醇提取物的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 (2)中的大孔树脂HPD-100预处理步骤如下 ： 在树脂柱内加入高于树脂层10厘米的90乙 醇浸泡 4 小时， 放出浸液， 用蒸馏水洗涤至流出液在试管中加水稀释不浑浊并且洗脱液用 紫外光谱扫描不得检出吸收峰为止， 再用水洗涤至乙醇含量小于 1， 即可。 4. 根据权利要求 1 所述的一种猴头菌乙醇提取物的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 (2) 中的吸附为静态吸附， 具体步骤如下 ： 猴头。
5、菌水提取液浓度为 100mg/ml， 溶液与大孔树 脂的体积比为 10 ： 1， 摇床 110rpm， 吸附 12h。 5. 根据权利要求 1 所述的一种猴头菌乙醇提取物的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 (2) 中的洗脱为静态洗脱或动态洗脱。 6. 根据权利要求 5 所述的一种猴头菌乙醇提取物的制备方法， 其特征在于 ： 所述静态 洗脱具体为 ： 将已吸附的大孔树脂 HPD-100， 经 3 倍柱床体积的蒸馏水洗脱后， 用 95乙醇 溶液 4 倍柱床体积置恒温摇床 110rpm、 25、 2h 的条件下进行洗脱， 颜色由深至浅， 洗至无 色 ； 动态洗脱具体为 ： 采用湿法或干法装柱的方。
6、式装柱， 层析柱规格为径高比 1 ： 8， 猴头菌 水提取液上样浓度为 0.1kg/L， 树脂上样量为 1kg/1L， 流速为 1.5mL/min， 用 95乙醇溶液 进行洗脱。 7. 根据权利要求 1 所述的一种猴头菌乙醇提取物的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 (2) 中的干燥为冷冻干燥。 权 利 要 求 书 CN 104398539 A 2 1/4 页 3 一种猴头菌乙醇提取物的制备方法 技术领域 0001 本发明属于食用菌提取领域， 特别涉及一种猴头菌乙醇提取物的制备方法。 背景技术 0002 目前我国以猴头菌为原料用于治疗胃病药品大约有 100 多种， 幽门螺旋杆菌 (Helic。
7、obacter pylori) 是一种需氧型革兰氏阴性菌， 大量临床研究表明 H.pylori 能够引 起慢性胃炎、 消化性溃疡、 胃癌、 胃粘膜等胃病。 0003 猴头菌(Hericium erinaceus)应用于胃肠疾病治疗具有鲜明的中国特色， 在临床 上广泛用来治疗慢性胃炎、 胃十二指肠溃疡等疾病， 积累了大量的临床经验和数据。 上世纪 60 年代， 上海市农科院食用菌所在我国首先驯化猴头菇人工栽培成功。70 年代从民间了解 到猴头菇有补胃功能， 开始制作猴头糖浆对十二指肠溃疡患者作疗效试验， 获得良好的治 疗效果。 0004 目前常用的提取猴头菌的方法主要是常规的水提醇沉， 但是这样。
8、得到的猴头菌提 取物抑制幽门螺旋杆菌活性成分少， 并不能投入实际应用。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是提供一种猴头菌乙醇提取物的制备方法， 该方法具 有良好的分离效果、 稳定性能和可循环重复利用的特点， 适合于规模化生产 ； 而且大孔吸附 树脂吸附分离法具有有机溶剂用量少可回收、 可重复性使用、 再生简单， 降低成本等诸多优 点， 可用于猴头菌中有效成分的富集分离和大工业生产。 0006 本发明的一种猴头菌乙醇提取物的制备方法， 包括 ： 0007 (1)取猴头菌子实体粉碎成颗粒， 然后溶于水中沸腾搅拌13h， 静置冷却至室温 后进行超声提取， 然后进行离心， 静置后取上清液，。
9、 得猴头菌水提取液 ； 其中猴头菌颗粒与 水的重量比为 1:5 10 ； 0008 (2) 将猴头菌水提取液加入预处理过的大孔树脂 HPD-100( 河北沧州宝恩化工有 限公司 )， 室温下吸附， 然后使用 70 100乙醇进行洗脱， 干燥后得到猴头菌乙醇提取 物。 0009 所述步骤 (1) 中的离心速度为 8000rpm， 离心时间为 10min。 0010 所述步骤 (2) 中的大孔树脂 HPD-100 预处理步骤如下 ： 在树脂柱内加入高于树脂 层 10 厘米的 90乙醇浸泡 4 小时， 放出浸液， 用蒸馏水洗涤至流出液在试管中加水稀释不 浑浊并且洗脱液用紫外光谱扫描不得检出吸收峰为止。
10、， 再用水洗涤至乙醇含量小于 1， 即 可。 0011 所述步骤 (2) 中的吸附为静态吸附， 具体步骤如下 ： 猴头菌水提取液浓度为 100mg/ml， 溶液与大孔树脂的体积比为 10 ： 1， 摇床 110rpm， 吸附 12h。 0012 所述步骤 (2) 中的洗脱为静态洗脱或动态洗脱。 0013 所述静态洗脱具体为 ： 将已吸附的大孔树脂 HPD-100， 经 3 倍柱床体积的蒸馏水洗 说 明 书 CN 104398539 A 3 2/4 页 4 脱后， 用 95乙醇溶液 4 倍柱床体积置恒温摇床 110rpm、 25、 2h 的条件下进行洗脱， 颜色 由深至浅， 洗至无色 ； 动态洗。
11、脱具体为 ： 采用湿法或干法装柱的方式装柱， 层析柱规格为径 高比 1 ： 8， 猴头菌水提取液上样浓度为 0.1kg/L， 树脂上样量为 1kg/1L， 流速为 1.5mL/min， 用 95乙醇溶液进行洗脱。 0014 所述步骤 (2) 中的干燥为冷冻干燥， 最终得到颜色为黑褐色的猴头菌提取物产 品。 0015 有益效果 0016 (1) 本发明具有良好的分离效果、 稳定性能和可循环重复利用的特点， 适合于规模 化生产 ； 而且大孔吸附树脂吸附分离法具有有机溶剂用量少可回收、 可重复性使用、 再生简 单， 降低成本等诸多优点， 可用于猴头菌中有效成分的富集分离和大工业生产 ； 0017 (。
12、2) 本发明与未使用大孔树脂吸附前相比， 该猴头菌醇提物抑菌活性提高了 20 倍， 优于未处理的猴头菌醇提物。 具体实施方式 0018 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 此外应理解， 在阅读了本发明讲授的内容之后， 本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。 0019 实施例 1 0020 水提法制备猴头菌粗活性物质 ： 0021 称取粉碎机粉碎成颗粒的猴头菌子实体干粉0.2kg， 溶于水中沸腾搅拌13h， 之 后静置冷却至室温后用超声波进行超声 2h 提取，。
13、 然后进行离心 8000rpm， 10min， 静置后取 上清液， 得猴头菌水提取物 ； 其中猴头菌颗粒与水的重量比为 1:5 10。 0022 实施例 2 0023 大孔树脂性能的筛选 0024 (1) 大孔树脂的预处理 0025 取 HPD-100， HPD-400， D101， AB-8( 购自河北沧州宝恩化工有限公司 )， 在树脂柱 内加入高于树脂层 10 厘米的 90乙醇浸泡 4 小时， 放出浸液， 用蒸馏水洗涤至流出液在试 管中加水稀释不浑浊并且洗脱液用紫外光谱扫描不得检出吸收峰为止， 再用水洗涤至乙醇 含量小于 1， 即可使用。 0026 (2) 树脂的吸附 0027 量取已预处。
14、理的HPD-100、 HPD-400、 D101、 AB-8大孔树脂各3份， 每份10mL， 分别置 于250mL的三角瓶中， 加入实施例1的样液100mL， 即样液 ： 树脂10 ： 1。 置在摇床110rpm， 25， 12h， 使充分吸附。 0028 (3) 树脂的洗脱 0029 已吸附饱和的树脂， 用 3 倍柱体积 (BV) 蒸馏水进行冲洗， 以洗去杂质及不吸附成 分， 然后加入 50mL 的 95乙醇置恒温摇床 110rpm， 25， 2h 的条件下进行洗脱， 收集洗脱 液， 浓缩， 回收乙醇， 得浓缩膏， 稀释一定的倍数。 0030 实施例 3 说 明 书 CN 104398539。
15、 A 4 3/4 页 5 0031 抑制幽门螺杆菌的最低抑菌浓度测定 0032 (1) 供试样品的配制 0033 精确称取实施例1制备的猴头菌水提物和实施例2制备得到的乙醇提取物样品于 灭过菌的 eppendorf 管中， 用 75乙醇配制成一定浓度的溶液。在超声下超声 15min。空 白对照为 75乙醇， 阳性对照组甲硝唑配置成 2mg/mL。 0034 (2) 幽门螺旋杆菌菌悬液的制备 0035 挑取适量培养 72h 的菌落于 1mL 布氏肉汤培养基中， 超声约 10s， 制成相当于 2.0McFarland standard( 含菌 1107至 1108c.f.u./L) 菌悬液， 该菌。
16、悬液现用现配。 0036 (3) 羊血布式培养基的制备 0037 称量Brucella培养基28.g并添加1000mL蒸馏水中， 调节pH值为7.00.2， 分装 为每瓶 100mL， 另加琼脂 2g 在 121 灭菌 15min， 临用前加 7无菌羊血。 0038 (4) 最低抑菌浓度测定 (MIC) 0039 取 40L 的 75乙醇加到 96 孔板 A1-A12 中作为阴性对照， 于 B12-H12 加甲硝唑 作为阳性对照。取等体积的供试样品加到 B1-B11 中， 以移液枪按列对各样液进行 2 倍连续 稀释， 盖上板盖， 紫外下挥干后， 用移液枪吸 100L 羊血布氏培养基于 96 孔。
17、平板中， 于 4 冰箱放置24h后紫外线照射约15min。 接下来用无菌棉棒蘸取幽门螺旋杆菌菌悬液， 依次接 种于各孔中的培养基表面， 放入培养箱中 (O2： 5； CO2： 15； N2： 80 )， 37恒温培养 72h。 以体视显微镜下观察各孔培养基表面， 无细菌生长的为最低药物稀释浓度即 MIC。 0040 (5) 实验结果 0041 实施例 1 制备的猴头菌水提物对幽门螺旋杆菌的 MIC10mg/mL， 实施例 2 得 到的猴头菌乙醇提取物对幽门螺旋杆菌的 MIC 分别为 0.5-1mg/mL(HPD-100)、 1-2mg/ mL(HPD-400)、 0.75-1.5mg/mL(D。
18、101) 和 0.6-1.2mg/mL(AB-8)， 结 果 表 明 使 用 大 孔 树 脂 HPD-100 吸附洗脱后得到的猴头菌乙醇提取物对 H.pylori ATCC 的最低抑制浓度小于使用 大孔树脂 HPD-400、 AB-8 和 D101 得到的乙醇提取物的最低抑菌浓度， 并且与吸附前水提取 相比， 抑菌活性分别提高了 10 倍以上， 吸附活性效果较好。 0042 实施例 4 0043 不同体积分数乙醇的洗脱效果 0044 (1) 静态洗脱 0045 取已吸附的树脂 HPD-100、 AB-8， 经 3 倍柱床体积的蒸馏水洗脱后， 依次用 10、 30、 50、 70、 90和 10。
19、0乙醇溶液各 4 倍柱床体积置恒温摇床 110rpm， 25， 2h 的条 件下进行梯度洗脱， 颜色由深至浅， 分别洗至无色， 收集洗脱液， 浓缩至膏。 浓缩膏稀释一定 的倍数， 测对 H.pylori 的抑菌活性。 0046 (2) 动态洗脱 0047 孔树脂装柱子 ( 径高比 1 ： 8)， 经 3 倍柱床体积的蒸馏水洗脱后， 依次用 10、 30、 50、 70、 90和 100乙醇溶液各 4 倍柱床体积进行梯度洗脱， 猴头菌水提取液上 样浓度为 0.1kg/L， 树脂上样量为 1kg/1L， 流速为 1.5mL/min 分别洗至无色， 分段收集洗脱 液， 并浓缩成膏。用浓缩膏稀释一定的。
20、倍数测定对 H.pylori 的抑菌活性。 0048 (3) 实验结果 0049 结果表明， 两种洗脱条件对抑菌活性的效果相同， 使用蒸馏水洗脱时 MIC 均大于 说 明 书 CN 104398539 A 5 4/4 页 6 10mg/mL， 而使用 10、 30、 50乙醇洗脱时静态洗脱和动态洗脱液的 MIC 在 5-10mg/mL 之间 ； 使用 HPD-100 和 10 -50乙醇洗脱得到的洗脱液抑菌活性较差 MIC 均大于 2.5mg/ mL， 而 70、 90和 100洗脱后得到的洗脱液的 MIC 分别为 0.25-0.5mg/mL， 125-250mg/ mL， 0.25mg/mL。
21、， 其中 90乙醇洗脱后的提取物抑制 H.pylori ATCC 的最低抑菌浓度最小为 125-250mg/mL。结果显示抑制幽门螺旋杆菌的活性成分主要集中在 70， 90， 100乙醇 洗脱液中， 在 70， 90， 100三种体积分数的乙醇解吸液中， 90乙醇对 H.pylori 抑菌 活性最好， 并且 90乙醇、 100乙醇洗脱后得到的洗脱液抑菌效果差别不大。 0050 实施例 5 0051 体外抑制幽门螺旋杆菌验证实验 0052 将实施例1制备得到的猴头菌粗提物浸膏配制成100mg/ml的水提取物溶液， 然后 进行如下方法提取。 0053 (1)HPD-100 树脂提取 ： 加入 5L。
22、 已预处理的大孔树脂 HPD-100 到溶解液中吸附 24h， 期间需不时搅拌， 去上清， 得到吸附后的大孔树脂， 把吸附后的大孔树脂装柱子 ( 径高 比 1 ： 8)， 依次用蒸馏水、 50乙醇溶液各 4 倍柱床体积进行梯度解吸， 流速为 1.5mL/min 分 别洗至无色， 再用 95乙醇洗脱并浓缩成膏。 0054 (2) 实验结果 0055 使用 HPD-100 大孔树脂和 95乙醇提取得到的猴头菌乙醇提取物对五种幽门螺 旋杆菌的最低抑制浓度分别为 0.5-1mg/mL(Helicobacter pylori ATCC)、 0.125-0.25mg/ mL(Helicobacter py。
23、lori SS1)、 0.5-1mg/mL(Helicobacter pylori W2504)、 1mg/ mL(Helicobacter pylori DXF) 和 0.5mg/mL(Helicobacter pylori 78) ； 而水提取物对 五种幽门螺旋杆菌的最低抑菌浓度分别为 2.5-5mg/mL(Helicobacter pylori ATCC)、 5mg/mL(Helicobacter pylori SS1)、 5mg/mL(Helicobacter pylori W2504)、 2.5-5mg/ mL(Helicobacter pylori DXF) 和 5mg/mL(He。
24、licobacter pylori 78)。综合分析， 使用 HPD-100 和 95乙醇洗脱得到的猴头菌乙醇提取物的活性提高了 20 倍。 0056 (3) 讨论 0057 本实施例采取活性跟踪的方法对分离猴头固体发酵菌丝对 H.pylori 的抑菌组分 进行富集， 在选取的四种大孔树脂中， HPD-100 大孔树脂对猴头固体菌丝的活性吸附能力最 好， 并确定了活性物质主要集中在 50-95乙醇洗脱液中最小抑菌活性为 0.5-1mg/mL， 活 性比水提物提高了 20 倍。这对以后研究 HPD-100 大孔树脂对猴头固体菌丝吸附有效活性 物质的工艺研究中起到了基础性研究， 而且大孔吸附树脂吸附分离法具有有机溶剂用量少 可回收、 可重复性使用、 再生简单， 降低成本等诸多优点， 是一种高效低耗的分离纯化工艺， 可用于猴头菌中有效成分的富集分离和大工业生产。 说 明 书 CN 104398539 A 6 。