《ΑB晶状体蛋白的用途.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《ΑB晶状体蛋白的用途.pdf（15页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410584604.5 (22)申请日 2014.10.27 A61K 38/17(2006.01) A61P 9/10(2006.01) (71)申请人 中国人民武装警察部队总医院 地址 100039 北京市海淀区永定路 69 号 (72)发明人 吴志鸿 侯世科 樊毫军 马艳 (74)专利代理机构 北京中誉威圣知识产权代理 有限公司 11279 代理人 丛芳 (54) 发明名称 B- 晶状体蛋白的用途 (57) 摘要 本发明公开了 B- 晶状体蛋白在制备抑制 视网膜神经节细胞中钾离子通道药物中的用途。 本发明给予急性高眼压大鼠模型。
2、注射 B- 晶状 体蛋白， 与未注射组相比， 注射组大鼠视网膜上 kv1.1 和 kv1.3 的表达量降低， 表明 B- 晶状体 蛋白具有抑制视网膜神经节细胞中钾离子通道的 功能。本发明为临床上通过抑制视网膜神经节细 胞中钾离子通道的功能治疗相关疾病提供了新的 候选药物。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104383521 A (43)申请公布日 2015.03.04 CN 104383521 A 1/1 页 2 1.B- 晶状体蛋白在制备抑制视网膜神经节细胞中钾离子。
3、通道药物中的用途。 2. 根据权利要求 1 所述的用途， 其特征在于， 所述抑制视网膜神经节细胞中钾离子通 道是抑制视网膜神经节细胞中钾离子通道蛋白的表达。 3. 根据权利要求 2 所述的用途， 其特征在于， 所述钾离子通道蛋白是 kv1.1。 4. 根据权利要求 1 所述的用途， 其特征在于， 所述钾离子通道蛋白是 kv1.3。 5. 根据权利要求 1 所述的用途， 其特征在于， 所述钾离子通道蛋白是 kv1.1 和 kv1.3。 6.B- 晶状体蛋白在制备促进视网膜神经节细胞中 Bcl-xL 蛋白表达升高的药物中的 用途。 7.B- 晶状体蛋白在制备抑制视网膜神经节细胞中 caspase-。
4、3 蛋白表达的药物中的 用途。 8. 根据权利要求 1-7 中任一项所述的用途， 其特征在于， 所述视网膜神经节细胞来自 于大鼠。 权 利 要 求 书 CN 104383521 A 2 1/8 页 3 B- 晶状体蛋白的用途 技术领域 0001 本发明属于生物医药技术领域， 涉及B-晶状体蛋白的新用途， 具体涉及B-晶 状体蛋白在制备抑制视网膜神经节细胞中钾离子通道药物中的用途。 背景技术 0002 视网膜神经节细胞 (RGCs) 是视网膜内信息传递的最后一站， 其轴突先组成视网 膜的神经纤维层， 然后汇聚成视神经， 在视觉通路中起着重要的传导作用。 视神经损伤能够 引起视神经病变， 从而引起。
5、视觉缺失， 这种情况在许多眼科病重都能见到， 如视神经炎、 视 路占位性病变、 青光眼、 缺血性视神经病变和糖尿病视网膜病变等。近年来， 关于视神经保 护的研究受到国内外众多学者的关注。研究显示， 外伤性视神经病变视神经损害的主要病 理学基础是 RGCs 的过度凋亡及神经节细胞的再生障碍。视神经损伤后对 RGCs 的保护主要 是停止或防止其发生凋亡。阻断或降低 RGCs 的凋亡途径和增加 RGCs 的存活能力， 已成为 防止视神经病变、 保存患者视功能的研究方向。 0003 研究表明在RGCs上许多种钾离子通道存在， 这些钾离子通道在RGCs的发育、 神经 轴再生、 轴突导向、 动作电位和反复。
6、放电调解中起到了很重要的作用。Kv1 通道家族属于电 压门控钾离子通道。研究证明大鼠的 RGCs 表达 kv1.1、 kv1.2、 kv1.3， 但是不表达 kv1.5， 并 且通过在大鼠玻璃体腔内注射钾离子通道阻滞剂， 发现阻断 kv1.1、 kv1.3、 可减少 RGCs 的 凋亡， 只阻断 kv1.2 只起很小的作用， 阻断 kv1.5 不起作用。Kv1.1 和 kv1.3 通过凋亡机制 中的不同通路促进RGCs细胞的自发性凋亡， kv1.1的衰竭增加了抗凋亡因子Bcl-xL等的表 达， 而 kv1.3 的衰竭减少了 caspase-3、 caspase-9 和 Bad 等的表达。最终，。
7、 kv1.1 和 kv1.3 的衰竭均可增加视神经横断伤后 RGCs 的存活率。 0004 B- 晶状体蛋白是晶状体主要的蛋白成分之一， 随着研究的深入， 发现其在角 膜、 虹膜、 视网膜、 睫状体、 视神经都有一定的存在且与眼部疾病的发病机制有着重要联系。 B- 晶状体蛋白是一类普通存在的小分子热休克蛋白， 有强大的分子伴侣作用。发明人 所在的课题组已经证明 B- 晶状体蛋白对大鼠视网膜无毒性作用， 可促进急性高眼压后 RGCs 的存活， 并且通过增加 RGCs 中 GAP-43 表达促进 RGCs 的轴突再生。 0005 虽然许多研究证明 B- 晶状体蛋白对 RGCs 具有保护作用， 但是。
8、其作用机制尚不 明确。 发明内容 0006 本发明是基于以下实验发现提出的 ： 给予大鼠急性高眼压模型以 B- 晶状体蛋 白注射， 与未注射相比， 注射 B- 晶状体蛋白后， RGCs 细胞中 kv1.1、 kv1.3 表达降低， 同时 Bcl-xL升高、 caspase-3降低， 表明B-晶状体蛋白是通过控制钾离子通道kv1.1和kv1.3 来调控 RGCs 细胞的凋亡。 0007 本发明提供了 B- 晶状体蛋白在制备抑制视网膜神经节细胞中钾离子通道药物 中的用途。 所述钾离子通道可以是kv1.1、 可以是kv1.3、 或是kv1.1和kv1.3的组合。 kv1.1 说 明 书 CN 104。
9、383521 A 3 2/8 页 4 和 kv1.3 通过不同的通路控制细胞的凋亡过程， 单独抑制上述两种钾离子通道中的一种就 可以达到控制细胞凋亡的目的。在本发明的具体实施方案中， 给予大鼠急性高眼压模型以 B- 晶状体蛋白注射， 与未注射相比， 注射 B- 晶状体蛋白后， RGCs 细胞中的 kv1.1 和 kv1.3 两种通道蛋白的表达均受到抑制。 0008 本发明还提供了 B- 晶状体蛋白在制备促进视网膜神经节细胞中 Bcl-xL 蛋白 表达升高的药物中的用途。在本发明的具体的实施方案中， 给予大鼠急性高眼压模型以 B- 晶状体蛋白注射， 与未注射相比， 注射 B- 晶状体蛋白后， R。
10、GCs 细胞中 Bcl-xL 表达升 高。 0009 本发明还提供乐 B- 晶状体蛋白在制备抑制视网膜神经节细胞中 caspase-3 蛋白表达的药物中的用途。在本发明的具体的实施方案中， 给予大鼠急性高眼压模型以 B- 晶状体蛋白注射， 与未注射相比， 注射 B- 晶状体蛋白后， RGCs 细胞中 caspase-3 表 达降低。 0010 本发明还提供了 B- 晶状体蛋白在制备抑制视网膜神经节细胞凋亡的药物中的 用途。在本发明的具体的实施方案中， 给予大鼠急性高眼压模型以 B- 晶状体蛋白注射， 与未注射相比， 注射 B- 晶状体蛋白后， RGCs 细胞中 Bcl-xL 表达升高， 同时 。
11、caspase-3 表 达降低， 表明 RGCs 细胞凋亡的进程受到抑制。 0011 本发明还提供了 B- 晶状体蛋白在制备治疗视神经损伤的药物中的用途。视神 经损伤的主要病理学基础是 RGCs 的过度凋亡及神经节细胞的再生障碍。视神经损伤后对 RGCs 的保护主要是停止或防止其发生凋亡。 0012 通过建立视神经损伤的动物模型并进行实验研究， 以寻求有效的治疗方法， 对于 研究视神经损伤机制及治疗具有重要意义。 现在国内外视神经损伤模型分为机械性视神经 损伤的动物模型、 缺血性视神经损伤的动物模型、 高眼压性视神经损伤的动物模型。 高眼压 性视神经损伤的动物模型包括急性暂时性高眼压和慢性持续。
12、性高眼压。 急性暂时性高眼压 可以通过下列方法实现 ： (1)前房灌注法 ； (2)玻璃体腔灌注法 ； (3)药物诱导法。 上述所提 到的构建视神经损伤模型的方法均可用于本发明。 0013 在本发明的具体的实施方案中， 选用的是前房灌注生理盐水法制备的急性高眼压 视神经损伤模型， 具体的构建过程如下 ： 用 10水合氯醛 (0.4ml/100g) 行大鼠左下腹腔注 射麻醉。全身麻醉成功后用左氧氟沙星滴眼液冲洗右眼结膜囊， 再滴复方托吡卡胺滴眼液 和盐酸奥布卡因滴眼液各一滴， 两种滴眼液使用时间间隔 5min。在解剖显微镜下将连有生 理盐水输液器的 33G 针头于角膜缘做隧道切口刺入前房， 注意。
13、勿伤虹膜和晶状体， 打开输 液调节器至最大。保持液体液平面与鼠眼垂直距离 156cm( 产生 15.22kPa， 相当于 120mmHg 的眼内压 )。当莫非氏管中无液体滴注并且球结膜、 虹膜、 视网膜苍白时说明急性高眼压模 型成功。间断滴诺氟沙星滴眼液以预防感染并防止角膜干燥。持续灌注 60min， 拔出针头， 可见球结膜及虹膜恢复正常颜色， 涂抹红霉素眼膏。 前房穿刺过程中伤及晶状体、 虹膜以及 穿刺后发生眼部感染的大鼠予以剔除。 0014 本发明的优点和有益效果 ： 首次发现了 B- 晶状体蛋白与 kv1.1 和 kv1.3 两种 通道蛋白的相关性， 即 B- 晶状体蛋白可以抑制 kv1。
14、.1 和 kv1.3 两种钾离子通道蛋白的表 达， 从而阻断钾离子通道的功能。根据上述发现， 可以开发 B- 晶状体蛋白作为治疗跟钾 离子通道功能相关的疾病的候选药物。 说 明 书 CN 104383521 A 4 3/8 页 5 附图说明 0015 图 1 显示术后 7d QRT-PCR 检测结果 ； 0016 图 2 显示术后 14d QRT-PCR 检测结果 ； 0017 图 3 显示术后 7d 和 14d 蛋白表达量的 Western blot 结果 ； 0018 图 4 显示术后 7d 蛋白表达量的统计结果 ； 0019 图 5 显示术后 14d 蛋白表达量的统计结果。 具体实施方式。
15、 0020 下面结合具体的实施例进一步说明本发明， 本发明的实施例仅用于解释本发明， 并不意味着限制本发明的保护范围。 0021 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0022 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0023 实验动物与分组 ： 0024 3月龄雄性清洁级SD大鼠60只， 体重220g左右， 由中国人民解放军军事医学科学 院实验动物中心提供， 许可证号 SCXK-( 军 )2012-0004， 饲养于武警总医院总医院中心实验 室， 经裂隙灯及眼底镜检查无眼部病变。随机分成以下三组 ： 0025 (1) 急性高眼压组 (A。
16、 组 ) ： 急性高眼压模型成功构建后， 不做其他处理。 0026 (2)急性高眼压+玻璃体腔注射生理盐水组(B组) ： 急性高眼压模型成功建立后， 行玻璃体注射生理盐水 5l。 0027 (3) 急性高眼压 + 玻璃体腔注射 B- 晶状体蛋白组 (C 组 ) ： 急性高眼压模型建立 后， 行玻璃体腔注射 B- 晶状体蛋白 ( 浓度 1*10-5g/L)5l。 0028 每组 20 只， 右眼为实验眼。分别于术后 7d 和 14d， 每组取 5 只大鼠视网膜， 使用 QRT-PCR 法检测 kv1.1、 kv1.3、 Bcl-xL、 和 caspase-3mRNA 的表达水平 ； 分别于术后 。
17、7d 和 14d 时， 每组取 5 只大鼠视网膜， 使用 western blot 检测视网膜 kv1.1、 kv1.3、 Bcl-xL、 和 caspase-3 的蛋白表达水平。 0029 实施例 1 大鼠急性高眼压模型的建立 0030 方法 ： 用 10水合氯醛 (0.4ml/100g) 行大鼠左下腹腔注射麻醉。全身麻醉成功 后用左氧氟沙星滴眼液冲洗右眼结膜囊， 再滴复方托吡卡胺滴眼液和盐酸奥布卡因滴眼液 各一滴， 两种滴眼液使用时间间隔 5min。在解剖显微镜下将连有生理盐水输液器的 33G 针 头于角膜缘做隧道切口刺入前房， 注意勿伤虹膜和晶状体， 打开输液调节器至最大。 保持液 体液。
18、平面与鼠眼垂直距离 156cm( 产生 15.22kPa， 相当于 120mmHg 的眼内压 )。当莫非氏管 中无液体滴注并且球结膜、 虹膜、 视网膜苍白时说明急性高眼压模型成功。 间断滴诺氟沙星 滴眼液以预防感染并防止角膜干燥。持续灌注 60min， 拔出针头， 可见球结膜及虹膜恢复正 常颜色， 涂抹红霉素眼膏。 前房穿刺过程中伤及晶状体、 虹膜以及穿刺后发生眼部感染的大 鼠予以剔除。 0031 实施例 2 大鼠急性高眼压模型玻璃体腔药物注射 0032 B- 晶状体蛋白溶液的配制 ： 将商品 B- 晶状体蛋白干粉 ( 购自 sigma) 溶于生 理盐水中， 使其终浓度为 1*10-5g/L。。
19、 说 明 书 CN 104383521 A 5 4/8 页 6 0033 方法 ： 大鼠急性高眼压模型建立后， 使用微量进样器， 在显微镜下于大鼠右眼角膜 缘后刺入玻璃体腔， 从角膜中央可见放大的针头， 缓慢注射， 拔出针头， 结膜囊内涂红霉素 眼膏。其中 B 组大鼠玻璃体腔内注入等渗盐水 5l， C 组大鼠玻璃体腔内注入 1*10-5g/L 的 B- 晶状体蛋白溶液 5l。用盖玻片轻压角膜， 观察玻璃体腔注射部位有无出血及渗漏， 眼底视网膜反光是否正常， 眼底血管走行及充盈是否正常。显微镜下观察确认玻璃体腔无 出血、 无晶状体及虹膜损伤者纳入实验。 诺氟沙星滴眼液点术眼一滴， 然后用红霉素眼。
20、膏涂 抹术眼。 0034 实施例 3 QRT-PCR 法检测 kv1.1、 kv1.3、 Bcl-xL 和 caspase-3 的 mRNA 水平 0035 步骤 ： 0036 1. 视网膜总 RNA 提取 0037 分别于术后 7d 和 14d 时， 每组取 5 只大鼠， 10水合氯醛腹腔麻醉。取出术眼置 冰浴生理盐水中漂洗 3min*2 次。显微镜下， 去除眼前节， 取出视网膜组织。按超纯 RNA 提 取试剂盒 ( 购自北京康为世纪生物科技有限公司 ) 的说明提取视网膜组织中的总 RNA。 0038 2.RNA 定量 0039 吸取 2l RNA， 以空气作空白对照， 用 ABI 核酸定量。
21、分析仪检测 RNA 纯度， 纯 RNA 的 OD260/280 比值接近 2.0， DNA 的 OD260/280 的比值接近 1.8。用 ABI 核算定量分析仪测 定 OD260 值进行准确定量。 0040 3. 反转录 0041 用 HiFi-MMLV cDNA 第一链合成试剂盒 ( 购自北京康为世纪生物科技有限公司 ) 进行反转录， 实验操作按产品说明书进行， 步骤如下 ： 0042 (1) 将 RNA 模板、 引物、 5*RT mix 和无 RNase 的水溶解并置于冰上备用。按下表向 反应管中加入 20l 反应体系的第一部分， 混匀。( 见表 1) 0043 表 1 反应体系的第一部。
22、分 0044 试剂名称使用量终浓度 引物混合物2l50M RNA 模板2l10ng 无 RNase 的水 至 15l 0045 (2)65孵育5min， 冰浴2-10min， 短暂离心。 加入反应体系的第二部分(见表2)。 轻轻吸打混匀， 37孵育 40min。反应结束后 70保温 10min。 0046 表 2 反应体系的第一部分 0047 试剂名称使用量终浓度 RT mix4l1* HiFi-MMLV 酶混合物1l10ng 说 明 书 CN 104383521 A 6 5/8 页 7 0048 4.QPT-PCR 反应 0049 (1)PCR 引物设计及合成 ： IDT primer Qu。
23、est 网站在线自行设计， 由上海生物工程 技术有限公司合成 ( 见表 3)。 0050 表 3 引物序列 0051 0052 (2)QRT-PCR 反应体系 ( 见表 4)。 0053 表 4 QRT-PCR 反应体系 0054 试剂名称使用量 CDNA2l 2*SYBR Green Supermix10l 正向引物 (10M)1l 反向引物1l 无 RNase 的水6l 总体积20l 说 明 书 CN 104383521 A 7 6/8 页 8 0055 (3)QRT-PCR 反应条件 0056 反应条件 ： 95预变性 10min ； 95变性 15s ； 58退火延伸 60s ； 45。
24、 个循环。 0057 5.QRT-PCR 结果分析方法 0058 结果以 Ct 值显示， Ct 值为每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的 循环数。所有样本检测均重复 3 次， 采用 2- ct方法进行数据的相对定量分析。 0059 统计分析 ： 数据采用平均值 标准差表示， 应用 spss17.0 统计软件， 采用单因素 方差分析， q 检验， P 0.05 为差异具有统计学意义。 0060 6. 结果 0061 各组kv1.1、 kv1.3、 Bcl-xL、 caspase-3mRNA相对表达量结果如表5和表6所示。 单 因素方差分析可得 ： 术后 7d 和 14d， C 组大鼠视。
25、网膜 kv1.1、 kv1.3、 Bcl-xL、 caspase-3mRNA 相对表达量分别与 A 组、 B 组进行比较， 差异有统计学意义 (P 0.05) ； A 组和 B 组进行比 较， 差异无统计学意义。C 组大鼠视网膜 kv1.1、 kv1.3、 caspase-3mRNA 的相对表达量较低， Bcl-xL mRNA 的相对表达量较高 ( 见图 1、 图 2)。 0062 表 5 术后 7d， 各组大鼠视网膜 kv1.1、 kv1.3、 Bcl-xL、 caspase-3mRNA 的相对表达 量 0063 基因名称A 组B 组C 组 kv1.11.1040.2381.0080.243。
26、0.5070.136* Kv1.31.1320.3011.1680.2150.6590.078* Bcl-xL1.0940.5790.9800.0722.0300.551* caspase-31.0170.2321.0650.2650.5660.067* 0064 注 ： * 表示 C 组分别与 A 组、 B 组进行比较， 差别具有统计学意义 (P 0.05)。 0065 表 6 术后 14d， 各组大鼠视网膜 kv1.1、 kv1.3、 Bcl-xL、 caspase-3mRNA 的相对表 达量 0066 基因名称A 组B 组C 组 kv1.11.0270.1920.9610.1850.50。
27、30.110* kv1.31.0210.2451.1020.2370.5110.201* Bcl-xL1.0540.3501.0730.3081.9100.246* caspase-31.0300.2971.0420.0300.5030.201* 0067 0068 注 ： * 表示 C 组分别与 A 组、 B 组进行比较， 差别具有统计学意义 (P 0.05)。 0069 实施例 4 Western blot 检测 kv1.1、 kv1.3、 Bcl-xL、 caspase-3 的蛋白表达水平 说 明 书 CN 104383521 A 8 7/8 页 9 0070 1. 视网膜总蛋白提取 0。
28、071 分别于术后 7d 和 14d 时， 每组取 5 只大鼠， 10水合氯醛腹腔麻醉。取出术眼置 冰浴生理盐水中漂洗 3min*2 次。显微镜下， 去除眼前节， 取出视网膜组织。去新鲜组织称 量 20mg， 加入预冷 RIPA 蛋白抽提试剂和蛋白酶抑制剂 Protease inhibitor cocktail( 购 自 Roche)， 匀浆， 冰上孵育 20min， 13000rpm 离心 20min， 取上清， 进行蛋白定量。 0072 2.BCA 蛋白定量按照 BCA 蛋白定量试剂盒中的操作说明进行 ( 购自 Pierce) 0073 3. 免疫印迹 0074 (1) 配制 10分离胶，。
29、 5浓缩胶。 0075 (2) 蛋白样品按 32g/ 孔的量上样。 0076 (3)电泳条件 ： 浓缩胶恒压70V， 约20min ； 分离胶恒压120V， 通过预染蛋白marker 来确定电泳停止时间。 0077 (4) 湿转法， 转膜条件 ： 300mA 恒流， 约 60min。 0078 (5) 封闭 ： 5脱脂奶 -TBST， 孵育 1h。 0079 (6) 一 抗 孵 育 ： 加 入 5 脱 脂 奶 -TBST 稀 释 的 一 抗 ( 鼠 源 的 kv1.1lgG 和 kv1.3lgG( 购自 Abcam)、 Bcl-xL lgG 和 caspase-3lgG( 购自 CST)， 4。
30、孵育过夜， 次日 TBST 洗涤 3 次， 每次 10min。 0080 (7) 二抗孵育 ： 加入 5脱脂奶 -TBST 稀释的二抗， 室温孵育 40min， TBST 洗膜 3 次， 每次 10min。 0081 (8) 曝光 ： ECL 滴加到膜蛋白面， 反应 3-5min， 然后曝光 ： 10s-30min， 显影， 定影。 0082 (9) 用 labworks 软件对蛋白条带进行灰度值分析， 以目的条带与内参 -actin 条带的比值代表目的蛋白的表达水平， 每条带均测定4次， 取平均值， 以平均值标准差表 示。 0083 4. 结果 0084 检测可得各组相关蛋白条带(如图3所示。
31、)， 进行灰度值分析(见表7和表8)。 单 因素方差分析可得 ： 术后 7d 和 14d， C 组大鼠视网膜 kv1.1、 kv1.3、 Bcl-xL、 caspase-3 蛋白 表达水平分别与 A 组、 B 组进行比较， 差异有统计学意义 (P 0.05) ； A 组和 B 组进行比较， 差异无统计学意义。C 组大鼠视网膜 kv1.1、 kv1.3、 caspase-3 蛋白表达水平较低， Bcl-xL 的蛋白表达水平较高 ( 见图 4、 图 5)。 0085 表 7 术后 7d， 各组目的条带与 -actin 条带灰度比值均数 0086 基因名称A 组B 组C 组 kv1.10.4850.。
32、0210.4700.0610.3880.030* kv1.30.5350.0690.5200.0640.4250.039* Bcl-xL0.3380.0360.3220.0280.4120.023* caspase-30.4750.0220.4670.0440.4130.042* 0087 注 ： * 表示 C 组分别与 A 组、 B 组进行比较， 差别具有统计学意义 (P 0.05)。 说 明 书 CN 104383521 A 9 8/8 页 10 0088 表 8 术后 14d， 各组目的条带与 -actin 条带灰度比值均数 0089 基因名称A 组B 组C 组 kv1.10.4680.。
33、0470.4520.0690.3780.028* kv1.30.5330.0740.5170.0620.4170.043* Bcl-xL0.3530.0450.3370.0370.4150.039* caspase-30.3620.0550.3450.0360.2750.029* 0090 注 ： * 表示 C 组分别与 A 组、 B 组进行比较， 差别具有统计学意义 (P 0.05)。 0091 尽管已经示出和描述了本发明的实施例， 本领域的普通技术人员可以理解 ： 在不 脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、 修改、 替换和变型， 本 发明的范围由权利要求及其等同物限定。 说 明 书 CN 104383521 A 10 1/3 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 104383521 A 11 2/3 页 12 0003 序 列 表 CN 104383521 A 12 3/3 页 13 序 列 表 CN 104383521 A 13 1/2 页 14 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 104383521 A 14 2/2 页 15 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 104383521 A 15 。