检测REGIVMRNA的方法.pdf

一种RNA扩增方法，包括以下步骤：用第一引物和第二引物，与逆转录酶制备含有启动子序列的双链DNA，其中至少一种引物在5’端具有启动子序列，用该双链DNA作为模板与RNA聚合酶制备RNA转录物，用该RNA转录物又作为DNA合成的模板与逆转录酶合成该双链DNA，用嵌入荧光染料标记的核酸探针来测量扩增的RNA产物的量。

1.  一种检测样品中存在再生胰岛衍生家族成员4(4型再生基因)mRNA(Reg IV mRNA)的方法，该方法的特征在于包括
(1)利用与所述RNA的特定核苷酸序列5’末端下游的至少一部分序列同源的第一引物和与所述特定核苷酸序列3’端上游的至少一部分序列互补的第二引物来制备含有启动子序列和所述启动子序列下游的所述特定核苷酸序列的双链DNA的步骤，其中所述第一引物和第二引物中的至少一条在5’端具有所述启动子序列，
(2)利用所述双链DNA作为模板以制备RNA转录物的步骤，
(3)利用所述RNA转录物又作为DNA合成的模板以在链式反应中扩增所述RNA转录物的步骤，以及
(4)检测所述RNA转录物的量的步骤。

2.  根据权利要求1的检测Reg IV mRNA的方法，其特征在于使用包括如SEQ ID NO：1所示的序列中的至少15个连续碱基的所述第一引物和包括如SEQ ID NO：2所示的序列中的至少15个碱基的所述第二引物的组合，包括如SEQ ID NO：3所示的序列中的至少15个连续碱基的所述第一引物和包括如SEQ ID NO：4所示的序列中的至少15个碱基的所述第二引物的组合，或者包括如SEQ ID NO：5所示的序列中的至少15个连续碱基的所述第一引物和包括如SEQ ID NO：6所示的序列中的至少15个碱基的所述第二引物的组合。

3.  根据权利要求1的检测Reg IV mRNA的方法，其特征在于所述RNA转录物的量的检测是通过测量核酸探针的荧光性质的变化完成的，该核酸探针用嵌入染料标记，并设计使其与目标核酸形成互补双链时，嵌入荧光染料部分通过嵌入到所述互补双链中而在荧光性质上发生变化。

4.  根据权利要求3的检测Reg IV mRNA的方法，其特征在于应用包括如SEQ ID NO：1所示的序列中的至少15个连续碱基的所述第一引物，包括如SEQ ID NO：2所示的序列中的至少15个碱基的所述第二引物，和包括如SEQ ID NO：7所示的序列或其互补序列中的至少15个碱基的序列的嵌入荧光染料标记的核酸探针的序列组合；包括如SEQ ID NO：3所示的序列中的至少15个连续碱基的所述第一引物，包括如SEQ ID NO：4所示的序列中的至少15个碱基的所述第二引物，和包括如SEQ ID NO：8所示的序列或其互补序列中的至少15个碱基的嵌入荧光染料标记的核酸探针的序列组合；或者包括如SEQ ID NO：5所示的序列中的至少15个连续碱基的所述第一引物，包括如SEQ ID NO：6所示的序列中的至少15个碱基的所述第二引物，和包括如SEQ ID NO：9所示的序列或其互补序列中的至少15个碱基的嵌入荧光染料标记的核酸探针的序列组合。

5.  Reg IV mRNA的检测试剂，其特征在于其基本组成成分是包含以下组合的寡核苷酸：包括如SEQ ID NO：1所示的序列中的至少15个连续碱基的第一引物和包括如SEQ ID NO：2所示的序列中的至少15个连续碱基的第二引物的序列组合，其中所述第一引物和第二引物的至少一种在5’末端具有启动子序列；包括如SEQ ID NO：3所示的序列中的至少15个连续碱基的第一引物和包括如SEQ ID NO：4所示的序列中的至少15个连续碱基的第二引物的序列组合，其中所述第一引物和第二引物的至少一种在5’末端具有启动子序列；或者包括如SEQ ID NO：5所示的序列中的至少15个连续碱基的第一引物和包括如SEQ ID NO：6所示的序列中的至少15个连续碱基的第二引物的序列组合，其中所述第一引物和第二引物的至少一种在5’末端具有启动子序列。

6.  一种检测Reg IV mRNA的方法，其特征在于其基本组成成分是包含以下组合的寡核苷酸：包括如SEQ ID NO：1所示的序列中的至少15个连续碱基的所述第一引物，包括如SEQ ID NO：2所示的序列中的至少15个碱基的所述第二引物，和包括如SEQ ID NO：7所示的序列或其互补序列中的至少15个碱基的嵌入荧光染料标记的核酸探针的序列组合，其中所述第一引物和第二引物的至少一种在5’末端具有启动子序列；包括如SEQ IDNO：3所示的序列中的至少15个连续碱基的所述第一引物，包括如SEQ IDNO：4所示的序列中的至少15个碱基的所述第二引物，和包括如SEQ IDNO：8所示的序列或其互补序列中的至少15个碱基的嵌入荧光染料标记的核酸探针的序列组合，其中所述第一引物和第二引物的至少一种在5’末端具有启动子序列；或者包括如SEQ ID NO：5所示的序列中的至少15个连续碱基的所述第一引物，包括如SEQ ID NO：6所示的序列中的至少15个碱基的所述第二引物，和包括如SEQ ID NO：9所示的序列或其互补序列中的至少15个碱基的嵌入荧光染料标记的核酸探针的序列组合，其中所述第一引物和第二引物的至少一种在5’末端具有启动子序列。

7.  一种用于扩增或检测Reg IV mRNA的寡核苷酸，其包含如SEQ IDNO：1至9所示的核苷酸序列或者与这些序列互补的序列中任一种的至少15个连续碱基。

检测REG IV mRNA的方法
技术领域
本发明涉及一种以简便、恒温、单阶段和快速的方式检测再生胰岛衍生家族成员4(4型再生基因)mRNA(Reg IV mRNA)的方法。本发明属于医药领域，特别是临床诊断或癌症研究的领域，其对癌细胞的检测有用。
背景技术
再生胰岛衍生家族成员4(4型再生基因)(下文记作“Reg IV”)是Reg基因家族成员，属于C型凝集素超家族的分泌蛋白。Reg基因家族蛋白的功能是作为凝集素、凋亡抑制因子以及胰腺β细胞、神经元、胃肠上皮细胞的生长因子等等。已经发现Reg IV在胃肠组织中表达，并且有报道它的表达水平在胃癌、结肠癌和其它癌中有增加(参见Zang YW.等，(2003)world J.Gastroenterol.，9，2635-2641)。
近年来，利用RT-PCR对Reg IV mRNA水平的测量已经揭示了Reg IVmRNA水平在如胃癌和结肠癌的胃肠癌中有增加(参见Oue N.等，(2004)Cancer Res.，64，2397-2405和violettes S.等，(2002)Int.J.Cancer，103，185-193)。换而言之，这些发现表明，对Reg IV mRNA的测定是胃癌和结肠癌的一个有效标记。
高灵敏度地测定Reg IV mRNA的一种方法是利用RT-PCR扩增RegIV mRNA并且测定扩增产物的量，但这通常需要两个阶段过程，包括逆转录过程(RT)和PCR过程，这不仅使程序复杂和降低再现性，而且增大了二次污染的风险。在绝大多数情况下，RT和PCR阶段的组合需要耗费2小时或更长时间，因而该方法不适于处理多个样品或者减少实验的成本。
检测目标RNA通常通过实时RT-PCR完成，其中PCR阶段是在嵌入荧光染料存在的情况下进行，检测增强的荧光，但问题是会检测到非特异性的扩增产物，例如引物二聚体。而且，由于DNA在RT-PCR中也会扩增，因此如果目的是只扩增mRNA，在核酸提取步骤中必须经DNA酶处理或其它方式完全除去染色体DNA，这导致了核酸提取过程更为复杂。另外，PCR需要反应温度的急剧上升/下降，这对于节省能源以及自动反应器的成本降低制造了障碍。
已报道NASBA法(参见日本专利No.2650159和日本专利No.3152927)和TMA法(参见日本专利No.3241717)作为以恒温方式只扩增RNA的方法。这些RNA扩增方法应用一种链式反应，其中，包含目标RNA的启动子序列的引物，逆转录酶以及如果需要，核糖核酸酶H(RNaseH)用于合成含有启动子序列的双链DNA，RNA聚合酶用于合成含有目标RNA的特异核苷酸序列的RNA，RNA又用作模板合成含有启动子序列的双链DNA。RNA扩增后，扩增的RNA通过电泳或者通过利用结合可检测标记的核酸探针的杂交方法进行检测。
这些RNA扩增方法适于简便的mRNA检测，因为它们以恒温、单阶段的方式只扩增RNA，但通过杂交方法等等进行检测需要复杂的程序，不适用于高再现性的定量。
Ishiguro等开发了一种扩增和检测mRNA的简便方法(参见日本未审查专利公布号No.2000-14400以及Ishiguro T.等，(2003)Anal.Biochem.，314，77-86)。在该方法中，RNA扩增是在一种核酸探针存在下进行的，该核酸探针用嵌入荧光染料标记，并设计使其与目标核酸形成互补双链时，嵌入荧光染料部分通过嵌入到互补双链中而在荧光性质上发生变化，然后对荧光性质的变化进行检测，由此就可能以简便、恒温、单阶段的方式在密闭容器中同时完成RNA的扩增和检测。
发明内容
尽管前面提到了Reg IV mRNA检测对于诊断如胃癌或结肠癌的胃肠癌是有用的，但是利用RT-PCR需要两个阶段的过程，复杂的程序和反应温度的急剧上升/下降，这些条件不但必然伴随有二次污染的风险和再现性差，而且阻碍了更简便的测量和自动操作的开发。本发明的目的之一是通过提供一种以简便、快速、恒温、单阶段的方式测量Reg IV mRNA的方法而克服前述的问题。
为了解决前述的问题，作为辛勤研究的结果，本发明人构建了一种以简便、快速、恒温、单阶段的方式用于前面说明的RNA扩增方法的测量Reg IV mRNA的方法。特别地，通过测量扩增的RNA产物的水平已经使得一种以便利、恒温、单阶段的方式检测Reg IV mRNA成为可能，而RNA产物是通过RNA扩增过程获得的，其中第一引物和第二引物(至少其中的一种在5’端具有启动子序列)用于产生含有启动子序列的双链DNA，双链DNA用作制备RNA转录物的模板，RNA转录物再用作DNA合成的模板以制备双链DNA。
根据本发明，使得以恒温、单阶段、便利和快速的方式高灵敏地测量Reg IV mRNA成为可能。因此本发明可用于诊断胃癌、结肠癌和其它癌症，因而它还可以用作肿瘤标记。由于本发明可在封闭的容器中单阶段完成，所以它可以把由扩增产物作为二次污染物而导致的环境污染的风险减至最小。另外，由于该方法是以单阶段、简便和快速的方式进行的，所以可以处理多个样品并且使得潜在降低再现性的程序数目减至最小。此外，由于本发明的RNA扩增方法只扩增RNA，所以它可以达到严紧扩增和检测mRNA而不需要RT-PCR中所需要的完全除去双链DNA的步骤。换而言之，本发明的方法对于高灵敏和快速的表达分析是很理想的。另外，由于它能够以恒温和单阶段的方式进行，因此不需要提供PCR中的热循环装置，而且便于自动操作。

附图简述
图1显示实施例2中制备的嵌入荧光染料标记的核酸探针的结构。B1，B2，B3和B4代表碱基。(A)具有嵌入荧光染料(唑黄)的探针，其根据Ishiguro等的方法(Ishiguro T.等，(1996)Nucleic Acids Res.，24，4992-4997)通过接头与磷酸二酯部分连接。为了防止3’端-OH基延伸反应，将3’端-OH基用羟基乙酸修饰。(B)具有用商业途径可获得的Label-ON试剂(Clontech)引入的氨基基团，以及根据Ishiguro等的方法(Ishiguro T.等，(1996)Nucleic Acids Res.，24，4992-4997)结合有唑黄的探针。此处，氨基基团引入到引入位点中核苷缺失部分(图中B3)。为了防止3’端-OH基延伸反应，将3’端-OH基用生物素修饰。
图2显示实施例3测量结果所获得的荧光概图。根据本发明的RNA扩增同时定期测量荧光强度的结果(激发波长：470nm，荧光波长：520nm)。水平轴代表反应时间，纵向轴代表荧光强度比值(反应混合物的荧光强度/背景荧光)。图中拷贝数目代表所用的Reg IV RNA拷贝的起始数目(包括碱基数目1-1275)(由260nm吸光率计算)。图2A显示用反应混合组合物(A)的结果，图2B显示用反应混合组合物(B)的结果。
图3显示实施例4测量结果所获得的荧光概图。根据本发明的RNA扩增同时定期测量荧光强度的结果(激发波长：470nm，荧光波长：520nm)。水平轴代表反应时间，纵向轴代表荧光强度比值(反应混合物的荧光强度/背景荧光)。图中拷贝数目代表所用的Reg IV RNA拷贝的起始数目(包括碱基数目1-1275)(由260nm吸光率计算)。图3A显示用反应混合组合物(A)的结果，图3B显示用反应混合组合物(B)的结果。
图4是由图3的结果得到的一对校准曲线。检测时间定义为图3的结果中荧光强度比值达到1.2的时间，以检测时间相对于标准RNA拷贝的起始数目的对数作图。图中的公式代表一次回归方程以及相关系数。未知样品拷贝的起始数目根据该校准曲线计算得到，未知样品的检测时间利用本发明方法得到。图4A显示用反应混合组合物(A)的结果，图4B显示用反应混合组合物(B)的结果。
实现本发明的最佳方式
下面将对本发明进行详细地说明。
本发明是一种检测样品中存在的Reg IV mRNA的方法，该方法包括：利用与RNA的特异核苷酸序列5’末端下游的至少一部分序列同源的第一引物和与该特异核苷酸序列3’末端上游的至少一部分互补的第二引物(其中第一引物和第二引物中的至少一条在5’端具有启动子序列)来制备含有启动子序列和启动子序列下游的特异核苷酸序列的双链DNA的步骤；利用双链DNA作为模板以制备RNA转录物的步骤；利用RNA转录物又作为DNA合成的模板来制备双链DNA的步骤；核酸扩增的步骤，在该步骤中前面所提到的步骤在同时促进每一步骤的条件下重复；以及检测RNA转录物的量的步骤。
根据本发明的样品包括用现有方法从样品中，例如从血液、血清、血浆、组织或怀疑含有癌细胞的灌洗液中提取的核酸。
根据本发明，特异的核酸序列由至少一部分Reg IV mRNA的序列或者其互补序列组成，它是定义为第一引物和第二引物之间的区域的序列。根据本发明，特异核苷酸序列的RNA转录物被扩增。当启动子序列加到第一引物上时，Reg IV mRNA在作为cDNA合成的模板之前，优选在特异核酸序列的5’端剪切。剪切方法没有特别限制，但优选用有核糖核酸酶H(RNaseH)活性的酶方法剪切RNA-DNA杂合分子的RNA部分，该RNA-DNA杂合分子是通过添加具有与Reg IV mRNA的特异性核苷酸序列的5’端重叠和临近区域互补的序列的寡聚核苷酸(剪切寡核苷酸)而形成的，优选地，所用的剪切寡核苷酸的3’末端-OH进行适当的修饰，例如，氨基化，以防止延伸反应。
根据本发明的目标核酸具有特异性的碱基序列区域，其不与第一或第二引物同源或互补，但是又具有与嵌入荧光染料标记的核酸探针互补结合的序列。因此，嵌入荧光染料标记的核酸探针是与本发明的特异性核苷酸序列的一部分互补的序列。所以，根据本发明的一种实施方式，当特异性核苷酸序列是与Reg IV mRNA同源的序列时，嵌入荧光染料标记的核酸探针具有含有SEQ ID NO：7所示的序列中的至少15个连续碱基的序列，当特异性核苷酸序列是与Reg IV mRNA互补的序列时，嵌入荧光染料标记的核酸探针具有含有SEQ ID NO：7所示的序列的互补序列的至少15个连续碱基的序列。
本发明的第一引物和第二引物中的至少一个在5’末端具有启动子序列，并且，对于第一引物来说，它是与Reg IV mRNA互补的序列具有足够互补性的寡核苷酸序列，对于第二引物来说，它是与Reg IV mRNA序列具有足够互补性的寡核苷酸序列。“足够互补性”指的是在本发明的核酸扩增步骤中，特异性核苷酸序列或其互补序列在反应条件(反应温度和盐的组成等)下发生互补结合。反应条件可以是，例如，43℃，在60mM Tris，18mM氯化镁，100mM氯化钾，1mM DTT存在下的杂交条件，如下面的实施例中所述。
为了给第一引物提供对与Reg IV mRNA互补的序列足够的互补性，给第二引物提供对Reg IV mRNA足够的互补性，给目标核酸提供对嵌入荧光染料标记的核酸探针足够的互补性，第一引物优选包括SEQ ID NO：1、3或5所示的序列中的至少15个连续碱基，第二引物优选包括SEQ IDNO：2、4或6所示的序列中的至少15个连续碱基，嵌入荧光染料标记的核酸探针优选包括SEQ ID NO：7、8或9所示的序列或其互补序列中的至少15个连续碱基。
优选地，利用其中第一引物包括SEQ ID NO：1所示的序列中的至少15个连续碱基，第二引物包括SEQ ID NO：2所示的序列中的至少15个碱基，嵌入荧光染料标记的核酸探针包括SEQ ID NO：7所示的序列或其互补序列中的至少15个碱基的序列组合；其中第一引物包括SEQ ID NO：3所示的序列中的至少15个连续碱基，第二引物包括SEQ ID NO：4所示的序列中的至少15个碱基，其中嵌入荧光染料标记的核酸探针包括SEQ ID NO：8所示的序列或其互补序列中的至少15个碱基的序列组合；或者其中第一引物包括SEQ ID NO：5所示的序列中的至少15个连续碱基，第二引物包括SEQ ID NO：6所示的序列中的至少15个碱基，嵌入荧光染料标记的核酸探针包括SEQ ID NO：9所示的序列或其互补序列中的至少15个碱基的序列组合。由于以互补方式与Reg IV mRNA结合的序列的位置关系，这些组合是优选的方式，但其它的组合也可以扩增和检测Reg IV mRNA。
第一引物可以是由SEQ ID NO：1、3或5所示的序列的至少15个连续碱基组成，具有一个或多个核苷酸的缺失，替换或添加且能和指定序列的互补序列特异性结合的寡核苷酸；或者是与SEQ ID NO：1、3或5所示的序列的至少15个连续碱基组成的寡核苷酸在高度严紧条件下能够杂交且能和指定序列的互补序列特异性结合的寡核苷酸；第二引物可以是由SEQID NO：2、4或6所示的序列的至少15个连续碱基组成，具有一个或多个核苷酸的缺失，替换或添加且能和指定序列特异性结合的寡核苷酸；或者是与SEQ ID NO：2、4或6所示的序列的至少15个连续碱基组成的寡核苷酸在高度严紧条件下能够杂交且能和指定序列特异性结合的寡核苷酸。
当检测的对象是与Reg IV的RNA互补的RNA时，第一引物和第二引物可以是互补的引物，它们的5’端和3’端颠倒。
高严紧性条件可以是，例如，43℃，在60mM Tris，18mM氯化镁，100mM氯化钾，1mM DTT存在下的杂交条件，如下面的实施例中所述。
根据本发明的启动子序列是RNA聚合酶结合以起始转录的序列，不同的RNA聚合酶的特异性序列是已知的。RNA聚合酶没有特别限制，但优选普通的，例如T7噬菌体RNA聚合酶、T3噬菌体RNA聚合酶，以及SP6噬菌体RNA聚合酶，也可使用它们相应的启动子序列。
根据本发明的检测Reg IV mRNA的方法需要特定的酶(对于单链RNA模板需要具有依赖RNA的DNA聚合酶活性的酶(逆转录酶)；具有RNaseH活性的酶；对单链DNA模板是具有依赖DNA的DNA聚合酶活性的酶；以及具有RNA聚合酶活性的酶)。这些酶中的任一种可以是具有不同活性的酶，或者使用具有单一活性的多种酶。例如，一种具有RNA聚合酶活性的酶可以加到一种逆转录酶中，该酶对于单链RNA模板具有依赖RNA的DNA聚合酶活性，还具有RNaseH活性以及对于单链DNA模板具有依赖DNA的DNA聚合酶活性，或者另外添加具有RNaseH活性的酶作为补充。出于可灵活应用的考虑，优选的逆转录酶是AMV逆转录酶、M-MLV逆转录酶和它们的衍生物。
当在第一引物和第二引物存在下进行逆转录反应时，第二引物与RegIV mRNA的特异碱基序列结合并由具有依赖RNA的DNA聚合酶活性的酶进行cDNA合成。获得的RNA-DNA杂合分子的RNA部分利用具有RNaseH活性的酶降解，并且使之分离以便第一引物与cDNA结合。
接下来，衍生自特异碱基序列且在5’端含有启动子序列的双链DNA由具有依赖DNA的DNA聚合酶活性的酶产生。该双链DNA含有启动子序列下游的特异性碱基序列，来源于该特异性碱基序列的RNA转录物由具有RNA聚合酶活性的酶产生。该RNA转录物作为模板通过第一引物和第二引物进行双链DNA合成，使得在链式反应中发生一系列反应并导致RNA转录物的扩增。
为了促进链式反应，当然有必要至少加入作为各种酶的必要的已知成分的至少一种缓冲液、镁盐、钾盐、核苷三磷酸和核糖核苷三磷酸。另外，可加入如二甲亚砜(DMSO)、二硫苏糖醇(DTT)、牛血清白蛋白(BSA)，糖类等等的添加剂以控制反应效率。
例如，当使用AMV逆转录酶和T7RNA聚合酶时，反应温度优选设定在35℃-65℃的范围内，最优选设定在40℃-44℃的范围内。RNA扩增步骤在恒温条件下进行，反应温度可设定为逆转录酶和RNA聚合酶表现其活性的任何期望温度。
扩增的RNA转录物的量可用已知的核酸检测方法进行测量。对于这样的检测方法来说，可以是利用电泳或液相色谱的方法，或者利用可检测标记物标记的核酸探针的杂交方法。但是这些方法包括复杂的步骤，并且由于扩增产物从系统中移出用于分析，存在很大的风险使得扩增产物泄露到环境中而造成二次污染。为了解决这个问题，优选使用一种经过设计的核酸探针使其互补结合目标核酸后荧光性质发生改变。作为更加优选的方法，可以提及一种方法，其中核酸的扩增步骤是在一种核酸探针存在下进行，该探针用一种嵌入荧光染料标记，并设计使其与目标核酸形成互补双链时，嵌入荧光染料部分通过嵌入到互补双链中而发生荧光性质变化，然后测量荧光性质的变化(参见日本未审查专利公布No.2000-14400和Ishiguro T.等，(2003)Anal.Biochem.，314，77-86)。
对于嵌入荧光染料没有特别限制，可以是如唑黄、噻唑橙、溴化乙锭及其衍生物的普通染料。荧光性质的变化可以是荧光强度的变化。例如，已知唑黄嵌入到双链DNA中会导致510nm的荧光(490nm的激发波长)有显著的增加。嵌入荧光染料标记的核酸探针是与RNA转录物具有足够互补性的寡核苷酸，它具有嵌入荧光染料通过合适的接头结合在末端、磷酸二酯部分或者碱基部分，并且3’-末端-OH基团经过适当的修饰以防止从3’-末端-OH延伸的结构(参见日本未审查专利公布HEI No.8-211050以及Ishiguro T.等，(1996)Nucleic Acids Res.，24，4992-4997)。
用嵌入荧光染料对寡核苷酸进行标记可通过利用已知方法向寡核苷酸中导入官能团并在那里结合嵌入荧光染料而实现(参见日本未审查专利公布No.2001-13147以及Ishiguro T.等，(1996)Nucleic Acids Res.，24，4992-4997)。导入官能团的方法可以使用常用的Label-ON试剂(ClontechLaboratories公司)。
作为本发明的一种实施方式，提供了一种方法：向样品中加入扩增试剂，该扩增试剂中至少含有在5’端含有T7启动子序列的第一引物(包括SEQ ID NO：1所示序列的15个连续碱基)、第二引物(包括SEQ ID NO：2所示序列的15个连续碱基)、嵌入荧光染料标记的核酸探针(包括SEQ IDNO：7所示序列的15个连续碱基)、剪切寡核苷酸(包括选自SEQ ID NOS：49-58的序列的15个连续碱基，并且具有与特定核苷酸序列的5’端重叠和临近区域互补的序列)、AMV逆转录酶、T7RNA聚合酶、缓冲液、镁盐、钾盐，核苷三磷酸、核糖核苷三磷酸和二甲亚砜(DMSO)，优选地向样品中加入扩增试剂，该扩增试剂中至少含有：在5’端含有T7启动子序列的第一引物(SEQ ID NO：10所示序列)、第二引物(SEQ ID NO：11所示序列)、嵌入荧光染料标记的核酸探针(SEQ ID NO：42所示序列)、剪切寡核苷酸(SEQ ID NO：50所示序列)、AMV逆转录酶、T7RNA聚合酶、缓冲液、镁盐、钾盐、核苷三磷酸、核糖核苷三磷酸和二甲亚砜(DMSO)，或者该扩增试剂中至少含有：在5’端含有T7启动子序列的第一引物(SEQ ID NO：18所示序列)、第二引物(SEQ ID NO：33所示序列)、嵌入荧光染料标记的核酸探针(SEQ ID NO：42所示序列)、剪切寡核苷酸(SEQ ID NO：54所示序列)、AMV逆转录酶、T7RNA聚合酶、缓冲液、镁盐、钾盐、核苷三磷酸、核糖核苷三磷酸和二甲亚砜(DMSO)]然后在恒定的反应温度35-65℃(优选40-44℃)下进行反应，期间定期测量反应混合物的荧光强度。
作为另一种实施方式，本发明提供了一种方法：向样品中加入扩增试剂，该扩增试剂中至少含有：在5’端含有T7启动子序列的第一引物(包括SEQ ID NO：3所示序列的15个连续碱基)、第二引物(包括SEQ ID NO：4所示序列的15个连续碱基)、嵌入荧光染料标记的核酸探针(包括SEQ IDNO：8所示序列的15个连续碱基)、剪切寡核苷酸(包括SEQ ID NO：59所示序列的15个连续碱基，并且具有与特定核苷酸序列的5’端重叠和临近区域互补的序列)、AMV逆转录酶、T7RNA聚合酶、缓冲液、镁盐、钾盐、核苷三磷酸、核糖核苷三磷酸和二甲亚砜(DMSO)，然后在恒定的反应温度35-65℃(优选40-44℃)下进行反应，期间定期测量反应混合物的荧光强度。
作为另一种实施方式，本发明提供了一种方法：向样品中加入扩增试剂，扩增试剂中至少含有：在5’端含有T7启动子序列的第一引物(包括SEQID NO：5所示序列的15个连续碱基)、第二引物(包括SEQ ID NO：6所示序列的15个连续碱基)、嵌入荧光染料标记的核酸探针(包括SEQ ID NO：9所示序列的15个连续碱基)、剪切寡核苷酸(包括选自SEQ ID NOS：60-64的序列的15个连续碱基，并且具有与特定核苷酸序列的5’端重叠和临近区域互补的序列)、AMV逆转录酶、T7RNA聚合酶、缓冲液、镁盐、钾盐、核苷三磷酸、核糖核苷三磷酸和二甲亚砜(DMSO)，然后在恒定的反应温度35-65℃(优选40-44℃)下进行反应，期间定期测量反应混合物的荧光强度。
在以上提到的所有方式中，荧光强度从起始RNA量开始表现为上升曲线，因此通过利用已知浓度的标准RNA绘制校准曲线，就可以对未知样品中的RNA起始量进行定量。另外，由于荧光强度是定期测量的，所以可在检测到荧光发生显著上升的任何预期时间点推算测量值，而且从核酸扩增和检测得到的测量结果通常可在一小时内获得，或者利用优化系统在30分钟内完成。
特别值得一提的是检测试剂中的所有试验原料都可包括在同一个容器中。就是说，通过将试验原料按指定的量分配到单个容器中这一简单程序可以进行自动扩增和随后的Reg IV mRNA检测。例如，容器可用一种部分透明的材料制成，以便从外部对荧光染料发射的信号进行测量，优选容器可以在分配完试验原料后进行封闭以防污染。
根据上述实施方式的RNA扩增和检测方法可以单阶段和恒温的方式进行，因此它比RT-PCR更方便，适于自动操作。然而，由于该反应是在相对低的恒定温度35-65℃下进行的，不象RT-PCR那样变性和退火，因此易导致如引物二聚体的非特异性扩增产物和目标RNA的更高级结构的效果，因此需要比RT-PCR更加精心地设计以构建检测系统，因此，以前还没有可能用前述的RNA扩增和检测方法以快速、简便、恒温和单阶段的方式检测Reg IV mRNA。根据本发明，有可能首次以快速、简便、恒温和单阶段的方式高特异性和高灵敏性地检测Reg IV mRNA。
实施例
现在用实施例进一步地解释本发明，应理解本发明不限于实施例。
实施例1
通过用SP6噬菌体RNA聚合酶/启动子下游的包含Reg IV cDNA(根据美国国立生物技术信息中心登记号No.NM032044指定的碱基号1-1275)的双链DNA作为模板用于体外转录来制备Reg IV RNA，然后用DNaseI处理以完全消化双链DNA，并将RNA纯化。通过测量260nm吸光率对RNA进行定量。
下面的实施例将该RNA作为测量目标，但根据本发明，它们完全可适用于以Reg IV mRNA作为测量目标的检测上。
实施例2
制备嵌入荧光染料标记的寡核苷酸探针。利用Label-ON试剂(ClontechLaboratories公司)将氨基基团引入到SEQ ID NO：43自5’端的第12位G上、SEQ ID NO：44自5’端的第10位A上、SEQ ID NO：45自5’端的第12位A上、SEQ ID NO：46自5’端的第11位C上、SEQ ID NO：47自5’端的第10位A上、SEQ ID NO：48自5’端的第14位C上，并将3’端用生物素修饰。利用Ishiguro T.等(1996)Nucleic Acids Res.，24，4992-4997所描述的方法将唑黄连接到氨基基团上(图1B)。同样，按照Ishiguro T.等(1996)Nucleic Acids Res.，4992-4997所描述的方法制备唑黄标记的核酸探针，其中唑黄通过接头连接到SEQ ID NO：42所示的序列5’末端第9位C和第10位A之间的磷酸二酯部分(图1A)。
实施例3
本发明的方法用于检测Reg IV RNA的不同原始拷贝数目。
(1)将前述的Reg IV RNA(包括碱基号1-1275)用RNA稀释剂(10mMTris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA，0.25U/μl核糖核酸酶抑制剂，5mM DTT)稀释到50，10²，10³，10⁴，10⁵和10⁶拷贝/5μl，用作RNA样品。RNA稀释剂用作阴性标准(0个拷贝)。
(2)将20μl反应混合物与下面的反应组合物分配在体积为0.5ml的PCR管(GeneAmp薄壁反应管，Perkin-Elmer)后，加入5μl的RNA样品。
反应混合组合物(A)：浓度为加入酶溶液后(在30μl中)的终浓度。
60mM Tris-HCl(pH 8.6)
18mM氯化镁
100mM氯化钾
1mM DTT
dATP，dCTP，dGTP，dTTP各0.25mM
ATP，CTP，UTP，GTP各3mM
3.6mM ITP
0.2μM第一引物(SEQ ID NO：10)：第一引物包括加到指定的核苷酸序列的5’末端的T7聚合酶启动子序列(SEQ ID NO：65)。
0.2μM第二引物(SEQ ID NO：11)
50nM嵌入荧光染料标记的核酸探针(SEQ ID NO：42)
0.16μM剪切寡核苷酸(SEQ ID NO：50)：该寡核苷酸用氨基基团修饰3-末端-OH。
6U/30μl核糖核酸酶抑制剂(Takara Bio公司)
11.7％DMSO
反应混合组合物(B)：浓度为加入酶溶液后(在30μl中)的终浓度。
60mM Tris-HCl(pH 8.6)
18mM氯化镁
100mM氯化钾
1mM DTT
dATP，dCTP，dGTP，dTTP各0.25mM
ATP，CTP，UTP，GTP各3mM
3.6mM ITP
0.2μM第一引物(SEQ ID NO：18)：第一引物包括加到指定的核苷酸序列的5’末端的T7聚合酶启动子序列(SEQ ID NO：65)。
0.2μM第二引物(SEQ ID NO：33)
50nM嵌入荧光染料标记的核酸探针(SEQ ID NO：42)
0.16μM剪切寡核苷酸(SEQ ID NO：54)：该寡核苷酸用氨基基团修饰3-末端-OH。
6U/30μl核糖核酸酶抑制剂(Takara Bio公司)
13％DMSO
(3)将这些反应混合物(A，B)在43℃下保温5分钟，然后把5μl的酶溶液与下面的组合物在43℃下保温2分钟后加入。
酶溶液组合物：(在30μl中)反应时的终浓度
2％山梨醇
6.4U/30μl AMV逆转录酶(Life Science公司)
142U/30μl T7RNA聚合酶(Invitrogen公司)
3.6μg/30μl牛血清白蛋白
(4)然后，将具有热控功能并且可直接对PCR管进行测量的荧光分光光度计用于43℃反应，同时定期测量反应混合物的荧光强度(激发波长：470nm，荧光波长：520nm)。
反应混合物的荧光强度比(指定时间的荧光强度值÷背景荧光强度值)的时间相关的变化如图2所示，其中加入酶的时间点定为0分钟。在图2A和2B结果的基础上，可得到依赖于Reg IV RNA起始浓度的荧光概图，并且50拷贝/试验的Reg IV RNA可在约10分钟内检测到。这说明通过本发明的方法可高灵敏度并且陕速地检测Reg IV RNA。
实施例4
通过本发明的方法，用第一引物、第二引物、嵌入荧光染料标记的核酸探针和剪切寡核苷酸的不同组合检测Reg IV RNA。
(1)将前述的Reg IV RNA(包括碱基号1-1275)用RNA稀释剂(10mMTris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA，0.25U/μl核糖核酸酶抑制剂，5mM DTT)稀释到10⁴，10²，或50拷贝/5μl，用作RNA样品。
(2)将20μl反应混合物与下面的组合物配制在体积为0.5ml的PCR管(GeneAmp薄壁反应管，Perkin-Elmer)后，加入5μl的RNA样品。
反应混合组合物：浓度为加入酶溶液后(在30μl中)的终浓度。
60mM Tris-HCl(pH 8.6)
18mM氯化镁
100mM氯化钾
1mM DTT
dATP，dCTP，dGTP，dTTP各0.25mM
ATP，CTP，UTP，GTP各3mM
3.6mM ITP
1μM第一引物(表1至3所示的SEQ ID NO)：第一引物包括加到指定的核苷酸序列的5’末端的T7聚合酶启动子序列(SEQ ID NO：65)。
1μM第二引物(表1至3所示的SEQ ID NO)
20nM嵌入荧光染料标记的核酸探针(表1至3所示的SEQ ID NO)：实施例2中制备的核酸探针。
0.16μM剪切寡核苷酸(表1至3所示的SEQ ID NO)：该寡核苷酸用氨基基团修饰3-末端-OH。
6U/30μl核糖核酸酶抑制剂(Takara Bio公司)
13％DMSO
(3)反应混合物在43℃保温5分钟，然后将5μl的酶溶液与下面的组合物在43℃保温2分钟后加入。
酶溶液组合物：(在30μl中)反应时的终浓度
2％山梨醇
6.4U/30μl AMV逆转录酶(Life Science公司)
142U/30μl T7 RNA聚合酶(Invitrogen公司)
3.6μg/30μl牛血清白蛋白
(4)然后，将具有有热控功能并且可直接对PCR管进行测量的荧光分光光度计用于43℃反应同时定期测量反应混合物的荧光强度(激发波长：470nm，荧光波长：520nm)。表1和3显示其结果，其中(+)代表反应混合物的荧光强度比超过1.2，该点的时间列为检测时间，加入酶的时间点定义为0分钟。
在使用表1中所示的第一引物、第二引物、嵌入荧光染料标记的核酸探针和剪切寡核苷酸的组合时，10⁴、10²、和50拷贝/试验的Reg IV RNA可在30分钟内检测到。特别地，在使用包括选自SEQ ID NOS：10和12-23的序列作为第一引物，选自SEQ ID NOS：11和30-33的序列作为第二引物，选自SEQ ID NOS：42，43的序列作为嵌入荧光染料标记的核酸探针并且以选自SEQ ID NOS：49-58的序列作为剪切寡核苷酸的组合，在使用包括SEQ ID NO：3的序列作为第一引物，选自SEQ ID NOS：34，35的序列作为第二引物，选自SEQ ID NOS：44，45的序列作为嵌入荧光染料标记的核酸探针并且以SEQ ID NO：59的序列作为剪切寡核苷酸的组合，或者在使用包括选自SEQ ID NOS：24-29的序列作为第一引物，选自SEQ IDNOS：36-41的序列作为第二引物，选自SEQ ID NOS：46-48的序列作为嵌入荧光染料标记的核酸探针并且以选自SEQ ID NOS：60-64的序列作为剪切寡核苷酸的组合时，可对Reg IV RNA进行快速检测。这里，SEQ ID NOS：10和12-23分别是SEQ ID NO：1的部分序列，SEQ ID NOS：11和30-33分别是SEQ ID NO：2的部分序列，SEQ ID NOS：42，43分别是SEQ ID NO：7的部分序列，SEQ ID NOS：34，35分别是SEQ ID NO：4的部分序列，SEQ ID NOS：44，45分别是SEQ ID NO：8的部分序列，SEQ ID NOS：24-29分别是SEQ ID NO：5的部分序列，SEQ ID NOS：36-41分别是SEQID NO：5的部分序列，SEQ ID NOS：46-48分别是SEQ ID NO：9的部分序列。这说明利用本发明的第一引物、第二引物、嵌入荧光染料标记的核酸探针的RNA扩增和检测方法可以快速检测Reg IV RNA。
表1至3：利用不同寡核苷酸组合的检测结果
表1