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1、(10)申请公布号 CN 103409437 A (43)申请公布日 2013.11.27 CN 103409437 A *CN103409437A* (21)申请号 201310365040.1 (22)申请日 2013.08.20 C12N 15/31(2006.01) C07K 14/38(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12P 7/54(2006.01) C09K 17/00(2006.01) C12R 1/685(2006.01) C09K 101/00(2006.01) (71。
2、)申请人 中国农业科学院农业资源与农业区 划研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12 号 (72)发明人 龚明波 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王朋飞 (54) 发明名称 一种促进乙酸分泌的溶磷基因 (57) 摘要 本发明提供了一种溶磷基因psa A， 其核苷酸 序列如SEQ ID No.1所示， 其编码的蛋白质的氨基 酸序列如 SEQ ID No.2 所示。本发明通过异源表 达克隆到的溶磷基因， 高效产生乙酸， 具有使难溶 磷转化为有效磷的作用， 为利用分子生物学手段 提高磷肥的利用率提供基本材料。 (51)Int.Cl. 权利要。
3、求书 1 页 说明书 4 页 序列表 3 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表3页 附图4页 (10)申请公布号 CN 103409437 A CN 103409437 A *CN103409437A* 1/1 页 2 1.一种溶磷基因psa A， 其特征在于， 所述溶磷基因psa A的核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示。 2.一种由权利要求1所述的溶磷基因psa A编码的蛋白， 其特征在于， 所述蛋白的氨基 酸序列如 SEQ ID No.2 所示。 3. 含有权利要求 1 所述基因的载体。 4. 如权利要求 3。
4、 所述的载体， 其特征在于， 所述载体为表达载体 pGEX-6P。 5. 含有权利要求 1 所述基因的工程菌。 6. 如权利要求 5 所述的工程菌， 其特征在于， 所述工程菌为 E.coliHST08。 7. 用于扩增溶磷基因 psa A 的开放阅读框序列的引物对， 其特征在于， 包括正向引物 F ： 5-TATTCGGAATTCATGTCTGCCAATCGAGCAAG-3 和反向引物 R ： 5-CAAGTACTCGAGCTACGGCTC GCCGAGGAGCCG-3 ； 其中， 溶磷基因 psa A 的开放阅读框序列为 ： SEQ ID No.3 所示的核苷酸序列。 8. 溶磷基因 psa。
5、 A 在促进乙酸分泌中的应用。 9. 溶磷基因 psa A 在溶解无机难溶磷中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103409437 A 2 1/4 页 3 一种促进乙酸分泌的溶磷基因 技术领域 0001 本发明涉及基因工程领域， 具体地说， 涉及一种促进乙酸分泌的溶磷基因。 背景技术 0002 产生有机酸是溶磷微生物释放土壤难溶磷的一种主要的方式， 有机酸与土壤中 铁、 铝、 钙等离子螯合， 从而使难溶磷转化为有效磷， 提高磷肥利用率。 溶磷微生物产生比较 常见的有机酸有琥珀酸、 柠檬酸、 - 酮戊二酸、 苹果酸、 丙酮酸、 乳酸、 乙酸、 甲酸、 丙酸、 富 马酸和草酸。 而溶磷微生物的应。
6、用受到如菌株的退化、 作物种类、 土壤特性、 气候条件、 溶磷 菌与其它微生物间的交互作用等影响而效果不稳定。 高效利用溶磷微生物产生有机酸或者 通过异源表达克隆到的溶磷相关基因产生有机酸是提高土壤磷素利用率最有效的一种方 式， 而其关键是溶磷相关基因的获得。 0003 关于溶磷相关基因研究以细菌为主， 其主要机制是将葡萄糖直接氧化产生葡萄糖 酸 (GA)， 其中葡萄糖酸的合成是由葡萄糖脱氢酶 (GDH) 和协同因子吡咯喹啉奎宁 （PQQ） 完 成 （Goldstein AH， 1999， FEMS Microbiology Ecology,30(4):295-300.） 。 目前关于真菌溶 。
7、磷相关基因的克隆也有报道， 主要是以黑曲霉和草酸青霉为主， 但其数量非常少， 主要机制 也不是很明确， 也有报道从草酸青霉中克隆到的基因编码合成苹果酸脱氢酶在大肠杆菌中 表达， 分泌苹果酸、 乳酸、 醋酸、 柠檬酸、 草酸等有机酸从而使难溶磷溶解 （LJ2011,Annals of Microbiology,1-8） 。 0004 目 前，在 ncbi 数 据 库 中 发 布 了 真 菌 Aspergillus niger CBS513.88 （XM_001398218.2） 和 Aspergillus niger contig An17c0020（AM270384.1） 的全基因组序 列， 。
8、与本发明序列同源性都为 98%， 但未对基因的功能进行预测与分析。与其他序列与本发 明同源性较低， 可能不为同一类。 0005 在 ncbi 数据库中， Mikael R.Andersen 等发布了 Aspergillus niger ATCC1015 的全基因组序列 （2011， Genome Res.21(6):885897.） ， 与本发明基因编码的蛋白同源性 为 99%， 对其功能也未进行预测。Futagami,T 等报道从 Aspergillus kawachii IFO4308 克 隆到的基因编码蛋白与本发明的蛋白同源性为 99%， 其为 ubiquitin conjugating。
9、 enzyme （泛素结合酶） ， 但未报到其具有产生乙酸的功能。其它报道的都为假定蛋白， 没有进行功能 分析。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种溶磷基因， 促进乙酸分泌， 具有将难溶磷转化为有效磷 提高磷肥利用率的效果。 0007 为了实现本发明目的， 本发明首先提供一种溶磷基因 psa A， 所述溶磷基因 psa A 的核苷酸序列如 SEQ ID No.1 所示。 0008 本发明还提供了一种由所述溶磷基因 psa A 编码的蛋白， 其氨基酸序列如 SEQ ID No.2 所示。 说 明 书 CN 103409437 A 3 2/4 页 4 0009 本发明还提供了含有所述溶磷基。
10、因的载体。 0010 作为优选， 所述载体为表达载体 pGEX-6P。 0011 本发明还提供了含有所述溶磷基因的工程菌。 0012 作为优选， 所述工程菌为 E.coli HST08。 0013 本发明还提供了用于扩增溶磷基因 psa A 的开放阅读框序列的引物对， 包括正向 引物F ： 5-TATTCGGAATTCATGTCTGCCAATCGAGCAAG-3和反向引物R ： 5-CAAGTACTCGAGCTACG GCTCGCCGAGGAGCCG-3 ； 0014 其中， 溶磷基因 psa A 的开放阅读框序列为 ： 0015 SEQ ID No.3 所示的核苷酸序列。 0016 本发明还。
11、提供了溶磷基因 psa A 在促进乙酸分泌中的应用。 0017 本发明从黑曲霉菌H1(Aspergillus niger H1)基因组中克隆获得， 其氨基酸序列 通过 DNAMAN 分析后获得。 0018 具体地， 本发明利用 SMART 技术构建黑曲霉 H1 的初级 cDNA 文库， 通过难溶磷培 养基筛选具有溶磷透明圈的转化子， 对筛选出的转化子进行测序分析， 获得其 cDNA 序列。 利用软件 DNAMAN 对 cDNA 序列结构进行分析， 获得其开放阅读框， 其序列如序列表 SEQ ID NO.3 所示， 根据序列， 设计并合成上下游寡核苷酸引物， 以筛选的转化子携带的质粒为模 板， 。
12、进行扩增， 将开放阅读框部分序列连接到 pGEX 载体上， 导入大肠杆菌， 在大肠杆菌中表 达， 分泌乙酸。 0019 本发明还提供了溶磷基因 psa A 在溶解无机难溶磷中的应用。 0020 本发明从黑曲霉 H1 中克隆溶磷基因， 其编码的蛋白导入大肠杆菌中， 在难溶磷无 机盐培养基中培养 36h 时， 促进大肠杆菌分泌乙酸， 含量分别为 445 544g/m， 溶液中 pH 值从 6.18 降到 4.12 3.52， 释放的可溶磷含量为 0.10 0.12mg/mL。 0021 本发明的有益效果在于 ： 0022 1、 本发明首先提供了溶磷基因 psa A 的核苷酸序列 ； 0023 2、。
13、 本发明通过异源表达克隆到的溶磷基因， 利用大肠杆菌高效产生乙酸 ； 0024 3、 本发明通过异源表达克隆到的溶磷基因具有将难溶磷转化为有效磷的效果。 附图说明 0025 图 1 为本发明黑曲霉菌 H1 在难溶磷无机盐培养基上培养 3d 的形态。 0026 图 2 为本发明文库的插入片段电泳检测。 0027 图 3 为本发明文库中携带溶磷基因的克隆子二次转接。 0028 图 4 为本发明质粒酶切位点图。 0029 图 5 为本发明 pGEX-6P 表达载体图谱。 0030 图 6 为本发明构建表达载体后的阳性克隆筛选。 0031 图 7 为本发明表达载体上目的片段扩增。 具体实施方式 003。
14、2 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 0033 实施例 1 黑曲霉菌的 cDNA 全长文库构建 说 明 书 CN 103409437 A 4 3/4 页 5 0034 实验所用菌株黑曲霉菌株 H1 为中国农业科学院农业资源与农业区划研究所农业 菌种保藏中心从土壤样品中筛选， 在难溶磷无机盐培养基上培养 3d， 取 0.2g 左右新鲜菌 丝 （如图 1） ， 液氮研磨， 利用 RNAisoplus 试剂盒提取总 RNA， 取 1g RNA 作为合成 cDNA 第 一链的模板， 在 3 SMART CDS Primer IIA 和 SMARTer IIA 寡核苷酸引物的引导下。
15、， 通过 SMARTscriptTM 逆转录酶 70 2min 逆转录合成第一链 cDNA ； 以 2L 第一链 cDNA 产物为 模板， 通过 LD-PCR 合成双链 cDNA。利用 CHROMA SPIN+TE-1000 纯化 cDNA， 去除小于 500bp 的片段， 沉淀回收 cDNA 片段。用 T4DNA 聚合酶补平 cDNA 的末端后， 在其两端连接 EcoRI/ XhoI 定向接头， 并用 EcoRI/XhoI 对接头进行酶切， 得到 5 端为 EcoRI、 3 端为 HindIII 酶 切位点的双黏性末端 cDNA。纯化后的 cDNA 片段通过 T4DNA 连接酶连接到经过 E。
16、coRI/XhoI 双酶切的 pBluescript SK(+) 载体上， 将连接产物电转化到宿主菌 E.coliHST08。随机挑 取转化后的克隆子， 在 LB 培养液中培养过夜， 提取质粒， 将质粒用 EcoR I 和 Xho I 酶切质 粒， 检测连接片段的大小， 结果显示插入大小为 600bp 3kb（图 2） 。将转化后的宿主菌接 种在 2mL LB 液体培养基中 37温浴 2h， 得到初级 cDNA 文库， 4保存备用。 0035 实施例 2 溶磷基因的筛选及生物信息学分析 0036 将含有文库细菌的培养液稀释涂布到含有氨苄青霉素 （100g/mL） 难溶磷培养 基上， 37培养 。
17、3-4d， 观察是否有溶磷透明圈产生， 将产生透明圈的转化子转接培养， 如图 3 所示， 筛选的克隆子转接后仍能在难溶磷无机培养基上产生透明圈， 说明其功能稳定， 将 功能稳定的菌落提质粒测序得到 DNA 的序列， 在 NCBI 上通过 Blast 进行比对分析， 并利用 DNAMAN6.0 进行开放阅读框分析， 并将翻译蛋白在 PDB 数据库上比对分析。 0037 实施例 3 表达载体的构建、 转化宿主、 阳性克隆鉴定 0038 引物设计 （Forward ： 5 -TATTCGGAATTCATGTCTGCCAATCGAGCAAG-3 ； Reverse ： 5 -C AAGTACTCGAG。
18、CTACGGCTCGCCGAGGAGCCG-3 ） ， 采用高保真 Taq 酶扩增上述基因的 ORF， 反应条 件 ： 94 5min ； 94 1min， 60 1min， 72 1min 循环 35 次 72 10min， 4 forever。用限 制性核酸内切酶 EcoRI 和 XhoI 双酶切后， 连接到表达载体 pGEX-6p 上， 酶切位点序列和表 达载体 pGEX-6p 图谱如图 4、 图 5 所示， 通过电击法转化 E.coli HST08， 在难溶磷无机盐培 养基上筛选能产生透明圈的克隆子 （图 6） ， 并通过 PCR 鉴定挑选出转化阳性的克隆的片段 大小， 扩增结果如图 。
19、7 所示， 其大小与目的基因大小一致， 进一步通过测序比对， 其序列与 目的基因序列完全一致， 说明其为阳性克隆。测序引物采用载体自身引物用 T3(5 -CCCAGT CACGACGTTGTAAAACG-3 ) 和 T7(5 -AGCGGATAATTTCACACAGG-3 ) 进行 PCR 扩增。 0039 实施例 4 溶磷基因 psa A 对难溶磷无机盐培养液 pH 及可溶磷含量的影响 0040 将上述筛选出的含有编码蛋白序列阳性克隆分别扩大培养， 在 150mL 的三 角瓶中装入 50mL 带抗性的难溶磷无机盐培养液， 培养基配方为 ： 葡萄糖或蔗糖 10g， (NH4)2SO40.5g，。
20、 NaCl0.3g， KCl0.3g， MgSO47H2O0.3g， FeSO47H2O0.03g， MnSO44H2O0.03g， Ca3(PO4)210.0g， 蒸馏水 1000mL。接种含有基因的转化子 1mL， 37， 200r/min 培养， 同时以 不含有该基因的菌作为对照， 设置三个重复， 分别在12h、 16h、 20h、 24h、 36h和40h测定溶液 的 pH 值， 并将溶液离心取上清， 105 110干燥后的磷酸二氢钾作为标样， 用钒钼黄比色 法测定可溶磷含量。随着时间的延长， 接种转化子的溶液 pH 值逐渐降低， 在 36h 时， 降到最 低值达到 3.52， 溶液中。
21、可溶磷含量升到最高， 达到 0.11mg/mL， 而不携带基因的大肠杆菌溶 液 pH 最终降到 5.6 左右时不再变化， 可溶磷含量没有变化。 说 明 书 CN 103409437 A 5 4/4 页 6 0041 实施例 5 溶磷基因 psa A 对大肠杆菌产酸的影响 0042 实验设计如同实施例 4， 在 36h 取出溶液上清， 20000rpm 离心， 离子色谱 Na 柱过 滤， 通过美国戴安公司 ICS-3000 离子色谱仪分析溶液中有机酸的种类和含量。保护住为 IonPac AG11-HC（450mm） ， 色谱柱为 IonPac AS11-HC（4250mm） ， 淋洗液梯度洗脱程。
22、序 为 0 5min， 1.0mmol/L KOH ； 5 45min， 36.00mmol/L KOH ； 45 50， 1.0mmol/L KOH。培 养 36h 后， 不含 psa A 的 E.coli HST08 只产生少量乙酸， 含量分别为 18.5g/mL， 而含 psa A 的 E.coli HST08 分泌大量乙酸， 含量为 445 544g/mL。 0043 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属。
23、于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 103409437 A 6 1/3 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 103409437 A 7 2/3 页 8 0003 序 列 表 CN 103409437 A 8 3/3 页 9 序 列 表 CN 103409437 A 9 1/4 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103409437 A 10 2/4 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103409437 A 11 3/4 页 12 图 5 说 明 书 附 图 CN 103409437 A 12 4/4 页 13 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 103409437 A 13 。