用于抑制HIF1Α表达的SIRNA和含有其的抗癌组合物.pdf

本发明公开了一种小干扰RNA（siRNA），其互补地结合至Hif1αmRNA转录本的碱基序列，从而在不诱导免疫应答的情况下抑制Hif1α的表达，还公开一种siRNA在预防和/或治疗癌症中的应用。由于Hif1α通常在几乎所有的癌细胞中过表达，因此互补地结合至编码Hif1α的mRNA的siRNA可通过RNA介导的干扰（RNAi）来抑制Hif1α的表达，从而抑制癌细胞的增殖和转移，因此，siRNA可作为抗癌剂。

权利要求书
1.   一种15至30bp的双链siRNA（小干扰RNA），其靶向至与选自由下表16记载的SEQ ID NO.2、3和5‑14组成的组中的至少一个相对应的mRNA，
[表16]
SEQ ID NO序列(5'‑>3')2GTTTGAACTAACTGGACAC3TGATTTTACTCATCCATGT5GAGAAATGCTTACACACAG6CGAGGAAGAACTATGAACA7GAACATAAAGTCTGCAACA8TGATACCAACAGTAACCAA9TCAGTGTGGGTATAAGAAA10GCTGATTTGTGAACCCATT11GCCGCTCAATTTATGAATA12GCATTGTATGTGTGAATTA13TCAGGATCAGACACCTAGT14ATTTAGACTTGGAGATGTT
。

2.   根据权利要求1所述的siRNA，其中所述siRNA靶向至与选自由SEQ ID NO6、10和12所组成的组中的至少一个碱基序列相对应的mRNA。

3.   根据权利要求1所述的siRNA，其中所述siRNA包括在3'端或5'端或这两端的由1至5个核苷酸（nt）组成的突出端。

4.   根据权利要求1所述的siRNA，其中所述siRNA包括选自由下表17记载的siRNA1、siRNA2、siRNA 4‑13和18‑20所组成的组的核苷酸序列，
表17


。

5.   根据权利要求4所述的siRNA，其中所述siRNA选自由下列组成的组：
siRNA5，其包括正义序列SEQ ID NO27和反义序列SEQ ID NO28；
siRNA9，其包括正义序列SEQ ID NO35和反义序列SEQ ID NO36；
siRNA11，其包括正义序列SEQ ID NO39和反义序列SEQ ID NO40；
siRNA18，其包括正义序列SEQ ID NO53和反义序列SEQ ID NO28；
siRNA19，其包括正义序列SEQ ID NO54和反义序列SEQ ID NO36；以及
siRNA20，其包括正义序列SEQ ID NO55和反义序列SEQ ID NO40。

6.   根据权利要求1所述的siRNA，其中至少一个核糖核酸的糖基或碱基结构或者所述核糖核酸之间的键被化学修饰。

7.   根据权利要求6所述的siRNA，其中所述化学修饰选自由下列所组成的组：
将主链中的磷酸二酯键取代为硼烷磷酸酯或硫代磷酸酯；以及
在核糖环的2'‑OH位置引入甲基（2'‑O'‑甲基）或氟基（2'‑氟）。

8.   根据权利要求7所述的siRNA，其中所述硼烷磷酸酯或硫代磷酸酯在3'端或5'端或这两端被引入。

9.   根据权利要求6所述的siRNA，其中所述siRNA包括选自由下表10记载的siRNA21‑50所组成的组的核苷酸序列，
表10



在上表10中，化学修饰的符号如下：
符号引入的化学修饰*磷酸二酯键→硫代磷酸键下划线2'‑OH→2'‑O‑Me小写字母2'‑OH→2'‑F
黑体字母ENA(2'‑O,4'‑C乙烯桥接核苷酸)
修饰的内容如下，设定mod1‑mod7不修饰反义链的第10和第11个碱基，并且在mod1‑mod10的所有siRNA正义链和反义链的3'端的dTdT（磷酸二酯键）都被硫代磷酸键（3'‑dT*dT,*：硫代磷酸键）取代，则：


。

10.   一种表达载体，包括根据权利要求1至9中任一项所述的siRNA。

11.   根据权利要求10所述的表达载体，其中所述表达载体选自由质粒、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘病毒载体和溶瘤腺病毒载体所组成的组。

12.   一种抗癌组合物，包括作为活性成分的根据权利要求1至9中任一项所述的siRNA。

13.   根据权利要求12所述的抗癌组合物，包括复合体形式的所述siRNA以及核酸递送系统。

14.   根据权利要求13所述的抗癌组合物，其中所述核酸递送系统选自由病毒载体、非病毒载体、脂质体、阳离子聚合物、微胶粒、乳剂和固体脂质纳米粒所组成的组。

15.   根据权利要求12所述的抗癌组合物，进一步包括用于抑制选自由下列所组成的组中的一种的表达的抗癌化疗药物或siRNA：生长因子、生长因子受体、下游信号转导蛋白、病毒致癌基因和抗癌剂抗性基因。

16.   一种抑制Hif1α的合成或表达的方法，包括：
提供从动物体分离的表达Hif1α的细胞；以及
使根据权利要求1至9中任一项所述的siRNA与所述从动物体分离的表达Hif1α的细胞接触。

17.   一种抑制癌细胞生长的方法，包括：
提供从动物体分离的表达Hif1α的癌细胞；以及
使根据权利要求1至9中任一项所述的siRNA与所述从动物体分离的表达Hif1α的癌细胞接触。

18.   一种药物组合物，含有作为活性成分的根据权利要求1至9中任一项所述的siRNA或根据权利要求10所述的表达载体。

说明书用于抑制Hif1α表达的siRNA和含有其的抗癌组合物
技术领域
本发明涉及一种小干扰RNA（siRNA），其互补地结合至Hif1αmRNA转录本的碱基序列，从而在不激发免疫应答的情况下抑制Hif1α的表达，还涉及一种siRNA在预防和/或治疗癌症中的应用。
背景技术
Hif1（低氧诱导因子1）是一种含有Hif1α亚单位和Hif‑1β亚单位的异质二聚体转录因子，其中Hif1α亚单位控制Hif1的实质活性，Hif‑1β亚单位起到核转运体的作用。两种亚单位都是碱性螺旋‑环螺旋‑PAS（PER‑ARNT‑SIM）超级家族的成员。在常氧下，Hif1α迅速降解。当VHL（希佩尔‑林道（von Hippel Lindau），一种E3泛素连接酶体系的识别组分）结合至ODD（氧降解域）的羟基脯氨酸（Pro594和Pro402）残基时，发生降解。然而，缺氧（含氧率5%或更少）是通常在各种实体癌中产生的现象，在缺氧时，这样的羟基化被抑制，从而Hif1α不降解，并且以二聚体的形式从细胞质向细胞核移动，且结合至HRE（缺氧反应元件），从而诱导有关血管生成、酶酵解、细胞生长和分化的基因的表达（Veronica A.等,Cancer Research,66(12),6264‑70,2006;Semenza GL.等,Nature Review Cancer3,721‑32,2003）。HIF‑1活性的调控在多级水平上发生。
由于Hif1α活性的调控在多级水平上发生，因此使用靶向至Hif1αmRNA的siRNA而不是靶向至这些机制的途径来从根本上抑制Hif1α的表达被认为是最好的方法。
最近，研究显示核糖核酸介导的干扰（RNAi）通过用现有技术呈现序列特异基因沉默，甚至对不然不可药物控制靶基因，从而对候选先导药物的发展做出贡献。因此，RNAi被认为是能够为合成药物中有限的靶和非特异性问题提供解决方法、并且克服化学合成药物的限制的技术，因此，积极进行了很多使用RNAi开发各种疾病药物的研究，这些疾病使用现有技术难以治疗，特别是癌症。
核糖核酸介导的干扰（RNAi）是由21‑25个碱基组成且具有双螺旋结构的核糖核酸互补地结合至靶基因的mRNA转录本并且降解转录本，从而抑制靶基因表达的一种现象（Novina&Sharp,Nature,430:161‑164,2004）。
然而，发现siRNA（小干扰RNA）触发固有免疫应答，并且比期望更频繁地诱导非特异性RNAi效应。
据报道，在哺乳动物细胞中，长双链siRNA可能诱导有害干扰素应答，短双链siRNA可能诱导对人体或细胞有害的初始干扰素应答；已知许多siRNA比期望更高地诱导非特异性RNAi（Kleirman等人，Nature,452:591‑7,2008）。
虽然已经尝试开发靶向至在癌症发展中起到重要作用的Hif1α的siRNA抗癌药物，但是目前为止收效甚微。不曾提出siRNA单个序列的基因抑制效果，尤其是不曾考虑过免疫活性。
虽然siRNA由于具有诸如高活性、优异的靶向特异性等优点而作为新型药物显示出极大的前景，但是在药物开发中需要克服几个障碍，例如：血液中的稳定性低，因为siRNA可能被血液中的核酸酶降解；通过细胞膜的能力低，因为带有负电；在血液中的半衰期短，因为排泄迅速由此组织分布有限；以及诱导能够影响其他基因的调控途径的脱靶效应。
发明内容
因此，本发明人开发了一种siRNA，其具有高序列特异性，因此特异性地结合至靶基因的转录本而提高RNAi活性并且不会诱导任何免疫毒性，从而完成了本发明。
一个实施方式提供了一种siRNA，其互补地结合至Hif1αmRNA转录本，从而特异性地抑制Hif1α的合成和/或表达。
另一个实施方式提供了抑制用于表达siRNA的表达载体。
另一个实施方式提供了一种用于抑制Hif1α的合成和/或表达的药物组合物，其包括作为活性成分的siRNA或siRNA表达载体。
另一个实施方式提供了一种抗癌组合物，其包括作为活性成分的siRNA或siRNA表达载体。
另一个实施方式提供了一种抑制Hif1α的合成和/或表达的方法，包括使siRNA或siRNA表达载体与Hif1α表达细胞接触的步骤；以及siRNA或siRNA表达载体在Hif1α表达细胞中抑制Hif1α合成和/或表达中的应用。
另一个实施方式提供了一种抑制癌细胞生长的方法，其包括使siRNA或siRNA表达载体与表达Hif1α癌细胞接触；以及siRNA或siRNA表达载体在抑制Hif1α表达细胞中的癌细胞生长中的应用。
再一个实施方式提供了一种预防和/或治疗癌症的方法，其包括对有需要的患者给予治疗有效量的siRNA或siRNA表达载体的步骤；以及siRNA或siRNA表达载体在预防和/或治疗癌症中的应用。
具体实施方式
本发明提供一种siRNA、包含其的药物组合物及其用途，该siRNA互补地结合至Hif1αmRNA转录本的碱基序列，从而抑制细胞中Hif1α的合成和/或表达。
根据本发明的一个方面，提供一种用于特异性地抑制Hif1α的合成和/或表达的siRNA。根据另一方面，提供一种用于抑制Hif1α的合成和/或表达的药物组合物，所述药物组合物包括作为活性成分的特异性地抑制Hif1α的合成和/或表达的siRNA。根据再一方面，提供一种用于抑制癌细胞生长的药剂或用于预防和/或治疗癌症的药物组合物（抗癌组合物），其包括作为活性成分的特异性地抑制Hif1α的合成和/或表达的siRNA。
本发明涉及一种抑制包括人类在内的哺乳动物的Hif1αmRNA、其可变间接形式、和/或同一系的Hif1α基因的表达的技术，其可通过给患者施用特定量的本发明的siRNA来降低靶mRNA的表达而实现。
以下，对本发明进行详细描述。
Hif1α可能来源于哺乳动物，优选是人类，或者Hif1α可以是与人类同一系的Hif1α或其可变剪接形式。术语“与人类同一系”是指具有与人类Hif1α基因或来自人类Hif1α基因的mRNA80%或更高的序列同源性的基因或mRNA的哺乳动物，具体地，可包括人类、灵长类、啮齿类等。
根据一个实施方式，与编码Hif1α的mRNA相对应的正义链的cDNA序列可如SEQ ID NO1所示。
根据本发明的siRNA可靶向至由Hif1α的mRNA或cDNA（例如SEQ ID NO1）中连续的15‑25bp、优选连续的18‑22bp所组成的区域，特别是靶向至与选自由SEQ ID NO：2、3和5‑14（cDNA的碱基序列）所组成的组的至少一个碱基序列相对应的mRNA区域。cDNA上优选的靶向区域总结于下表1中。因此，根据本发明的一个实施方式，提供了靶向至mRNA区域的siRNA，该mRNA区域与选自由SEQ ID NO：1的Hif1αcDNA中的SEQ ID NO2、3和5‑14所组成的组中的至少一个碱基序列相对应。例如，提供了靶向至mRNA区域的siRNA，该mRNA区域与选自由SEQ ID NO6、10和12所组成的组中的碱基序列相对应。
[表1]
Hif1α cDNA（SEQ ID NO:1）上的17个靶区域

如本文中使用的那样，术语“靶mRNA”是指人类Hif1αmRNA、与人类同一系的Hif1αmRNA及其可变剪接形式。特别地，可包括人类:NM_001530,NM_181054(NM_001530中从2203到2248位置的碱基被删除的剪接形式),小家鼠:NM_0010431,食蟹猴:AB169332等。因此，本发明的siRNA可靶向至人类或与人类同一系的Hif1αmRNA或其可变剪接形式。
如本文中使用的那样，词语“靶mRNA（或cDNA）区域”意思是siRNA具有与mRNA（或cDNA）区域的全部或部分碱基序列、例如全部碱基序列的85～100%互补的碱基序列，从而能够特异性结合至mRNA（或cDNA）区域。
如本文中使用的那样，术语“互补的”或“互补地”意思是聚核苷酸的两条链可形成碱基对。互补的聚核苷酸的两条链形成沃森·克里克(Watson‑Crick)碱基对，从而形成双链。当本文中提到碱基U时，其可以被碱基T取代，除非另有说明。
由于对Hif1α合成和/或表达的抑制效果和本发明的药物组合物的癌症治疗效果是通过对Hif1α合成和/或表达的有效抑制来实现，药物组合物中作为有效成分含有的siRNA可以是15‑30bp的双链siRNA，该双链siRNA靶向至上述特定mRNA区域中的至少一个。siRNA可具有带有平末端而不带有突出端的对称结构，或可具有在3'端、5'端或两端具有突出端的非对称结构。突出端的核苷酸可以是任意序列，例如，2‑4dT（脱氧胸苷），如2dT可以连接于此。
根据优选的实施方式，siRNA可包括选自由SEQ ID NO19‑22、25‑44和55‑115所组成的组中的至少一个。更特别地，siRNA可以是选自由如下表2记载的siRNA1、siRNA2、siRNA4‑siRNA13和siRNA18‑siRNA50所组成的组的至少一个。
[表2]





[表3]
符号引入的化学修饰*磷酸二酯键→硫代磷酸键下划线2'‑OH→2'‑O‑Me小写字母2'‑OH→2'‑F黑体字母ENA(2'‑O,4'‑C乙烯桥接核苷酸)
[表4]


在表4中，从mod1‑mod7的修饰不修饰反义链的第10个和第11个碱基，并且在mod1‑mod10的修饰中所有siRNA的正义链和反义链的3'端的dTdT（磷酸二酯键）被硫代磷酸键（3'‑dT*dT,*:硫代磷酸键）取代。
由于siRNA对于Hif1αmRNA转录本的特定靶区域具有高度特异性，因此能够特异性地互补地结合至靶基因的转录本，从而提高RNA干扰活性，因此具有抑制细胞中的Hif1α表达和/或合成的优异效果。并且，siRNA具有最小的免疫诱导活性。
如上所述，本发明的siRNA可以是靶向至选自由SEQ ID NO.1的Hif1α cDNA区域中的SEQ ID NO2、3和5‑14所组成的组中的mRNA的至少一个区域的siRNA。优选地，siRNA可包括选自由SEQ ID NO19‑22、25‑44和53‑115所组成的组中的至少一个核苷酸序列，更优选地，可包括选自由SEQ ID NO19‑22、25‑44和53‑115的45个siRNA所组成的组中的至少一个。siRNA包括核糖核酸序列本身，以及表达核糖核酸序列的重组载体（表达载体）。该表达载体可以是选自由质粒或腺相关病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、溶瘤腺病毒等组成的组中的病毒载体。
本发明的药物组合物可包括作为活性成分的siRNA以及药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可包括任何通常使用的载体，例如，可以是选自由水、盐溶液、磷酸盐缓冲盐溶液、糊精、丙三醇、乙醇等所组成的组中的至少一种，但不限于此。
siRNA可施用给动物，优选地施用给人类、猴子或啮齿类（小鼠、大鼠），特别地施用给任何哺乳动物，例如患有与Hif1α表达相关的疾病或病症、或需要抑制Hif1α表达的人类。
为了得到Hif1α抑制效果同时使不需要的副作用如免疫应答等最小化，组合物中的siRNA浓度或siRNA的剂量可以为0.001至1000nM，优选为0.01至100nM，更优选为0.1至10nM，但不限于此。
siRNA或含有siRNA的药物组合物可以治疗选自由各种实体癌症（例如肺癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、甲状腺癌、食道癌、前列腺癌、脑癌等）、皮肤癌、骨肉瘤、软组织肉瘤、神经胶质瘤、淋巴瘤等所组成的组中的至少一种癌症。
本文中，将详细描述siRNA的结构和设计过程，以及含有siRNA的药物组合物。
siRNA可具有通过RNAi途径降解Hif1αmRNA从而不诱导而是降低蛋白的表达的作用。
根据一个实施方式，siRNA是指小的抑制型RNA双链体，其诱导RNA干扰（RNAi）途径。特别地，siRNA是包括正义链和与其互补的反义链的RNA双链体，其中两条链都包括15‑30bp，特别是15‑25bp，更特别地是15‑22bp。siRNA可包括双链区域以及单链形成发卡结构或茎环结构的区域，或者siRNA可以是两条独立的链的双链体。正义链可具有与靶基因mRNA序列的核苷酸序列一致的序列。在正义链和与其互补的反义链之间通过沃森·克里克碱基配对形成双链体。siRNA的反义链被RISC（RNA诱导的沉默复合体）捕获，RISC识别与反义链互补的靶mRNA，然后诱导靶mRNA的裂解或翻译抑制。
根据一个实施方式，双链siRNA可在3'端、5'端或两端具有1至5个核苷酸的突出端。或者，可具有在两端被截断的平末端。特别地，可以是US20020086356和US7056704中记载的siRNA，这些专利以引用方式并入本文中。
根据一个实施方式，siRNA包括正义链和反义链，其中正义链和反义链形成15‑30bp的双链体，并且该双链体可具有带有平末端而不带有突出端的对称结构，或带有至少一个核苷酸、例如1‑5个核苷酸的突出端的非对称结构。所述突出端的核苷酸可以是任意序列，仅仅2至4dT（脱氧胸苷）例如2dT可以连接于此。
在生理条件下，使反义链与SEQ ID NO.1的mRNA的靶区域杂交。“在生理条件下杂交”意思是siRNA的反义链与mRNA的特定靶区域在体内杂交。特别地，反义链可具有85%或更多的与靶mRNA区域互补的序列，其中靶mRNA区域优选为选自表1所示的SEQ ID NO2、3和5‑14的至少一个碱基序列，更特别地，反义链包括与SEQ ID NO.1的碱基序列中的连续的15至30bp、优选地连续的15至25bp、更优选地连续的15至22bp完全互补的序列。更加优选地，siRNA的反义链可包括与选自表1所示的SEQ ID NO2、3和5‑14的至少一个碱基序列完全互补的序列。
根据一个实施方式，siRNA可具有非对称的双链结构，其中一条链比另一条链短。特别地，在双链的siRNA（小干扰RNA）分子由19至21个核苷酸（nt）的反义链和15至19nt的具有与反义链反义互补的序列的正义链（假设若反义链为19nt，则正义链不为19nt）构成的情况下，siRNA可以是在反义的5'端具有平末端以及在反义的3'端具有1‑5个核苷酸的突出端（例如，（dT）n，n=1‑5，优选为2‑4的整数）的siRNA。特别地，可以是WO09/078685中公开的siRNA。
在使用siRNA治疗时，需要在靶基因的碱基序列中选择具有最高活性的最优碱基序列。特别地，根据一个实施方式，为了提高临床前试验与临床试验的联系，优选地设计包括物种间保守序列的Hif1αsiRNA。以及，根据一个实施方式，优选地设计为结合至RISC的反义链具有与RISC的高结合活性。因此，可以设计为正义链和反义链之间的热动力学稳定性具有差异，从而提高作为引导链的反义链的RISC结合活性，同时正义链不结合至RISC。特别地，正义链的GC含量不超过60%；3个或更多个腺嘌呤/鸟嘌呤碱基可存在于正义链5'端的第15至19位置；并且G/C碱基在正义链的5'端的第1至7位置可以是高丰度的。
并且，由于重复的碱基序列，siRNA本身的内含序列可相互结合并降低互补结合至mRNA的活性，优选地设计为存在少于4个重复的碱基序列。并且，在由19个碱基组成的正义链结合至靶基因的mRNA从而适当地诱导转录本降解的情况下，正义链5'端的第3个、第10个和第19个碱基可以是腺嘌呤。
进一步，根据一个实施方式，siRNA使非特异性结合和免疫应答‑诱导活性最小化。通过siRNA的干扰素的免疫应答诱导等大多数通过存在于抗原提呈免疫细胞的核内体处的TLR7（Toll样受体）而发生，并且siRNA到TLR7的结合以序列特异性方式（比如富含GU序列）发生，因此，可能最好的是包括不被TLR7识别的序列。特别地，可以不具有像5'‑GUCCUUCAA‑3'和5'‑UGUGU‑3'这样的免疫应答诱导序列，可具有与Hif1α以外的基因的70%或更少的互补性。
Hif1αcDNA靶序列的例子包括上面的表1所记载的核苷酸序列。基于表1的靶序列，siRNA序列可以设计为siRNA长度可以长于或短于靶序列的长度，或可增加或删除与DNA序列互补的核苷酸。
根据本发明的实施方式，siRNA可包括正义链和反义链，其中正义链和反义链形成不带有突出端的15‑30bp的双链，或者至少一个末端可具有1‑5个核苷酸的突出端，并且反义链可在生理条件下杂交至与SEQ ID NO2、3和5‑14、优选SEQ ID NO6、10、12相对应的mRNA区域。也就是说，反义链包括与SEQ ID NO2、3和5‑14、优选SEQ ID NO6、10、12互补的序列。因此，本发明的Hif1αsiRNA和包含该Hif1αsiRNA的药物组合物不诱导有害的干扰素应答而抑制Hif1α基因的表达。
本发明通过互补结合至与选自由SEQ ID NO6(5'‑CGAGGAAGAACTA TGAACA‑3')，SEQ ID NO10(5'‑GCTGATTTGTGAACCCATT‑3')和SEQ ID NO12(5'‑GCATTGTATGTGTGAATTA‑3')所组成的组中的至少一个序列相对应的mRNA区域，从而抑制细胞中Hif1α的表达。
根据本发明特定实施方式的Hif1αsiRNA记载于上面的表2。
根据一个实施方式，Hif1αsiRNA可以是选自由下列所组成的组中的至少一个：包括正义序列SEQ ID NO27和反义序列SEQ ID NO28的siRNA5；包括正义序列SEQ ID NO35和反义序列SEQ ID NO36的siRNA9；包括正义序列SEQ ID NO39和反义序列SEQ ID NO40的siRNA11；包括正义序列SEQ ID NO53和反义序列SEQ ID NO28的siRNA18；包括正义序列SEQ ID NO54和反义序列SEQ ID NO36的siRNA19，以及包括正义序列SEQ ID NO55和反义序列SEQ ID NO40的siRNA20。
通过定量PCR（qPCR）扩增、bDNA（分支DNA）分析、蛋白质印迹、ELISA等测定mNRA或蛋白质水平的变化，从而可确认敲除（Hif1α表达抑制）。根据一个实施方式，准备脂质体复合体以处理癌细胞系，然后通过mRNA阶段的bDNA分析可以确认核糖核酸介导的表达干扰。
本发明的siRNA序列具有低免疫应答诱导活性，同时有效抑制Hif1α的合成或表达。
根据一个实施方式，可使用siRNA‑DOTAP（N‑[1‑(2,3‑二油酰基)丙基]‑N,N,N‑三甲胺甲基硫酸盐)复合体处理人外周血单个核细胞（PBMC），然后测定在培养基中被释放的INFα和INF‑γ的细胞因子、肿瘤坏死因子‑α（TNF‑α）、白介素‑12（IL‑12）等是否增加来确认免疫毒性。
该siRNA可具有天然产生（非修饰）的核糖核酸单元结构，或可被化学修饰，以及例如可合成为至少一个核糖核酸的糖或碱基结构，核糖核酸之间的键可具有至少一个化学修饰。通过siRNA的化学修饰，可获得期望的效果例如改善的核酸酶抗性、提高的细胞内摄取、提高的细胞靶向（靶向特异性）、提高的稳定性或降低的脱靶效果例如降低干扰素活性、免疫应答和感知效果等，而不会影响原本的RNAi活性。
siRNA的化学修饰方法没有特别限定，并且本领域的常规技术之一可以通过本领域已知的方法根据需要合成和修饰siRNA（Andreas Henschel,Frank Buchholz1和Bianca Habermann(2004)DEQOR:a web based tool for the design and quality control of siRNAs.Nucleic Acids Research32(Web Server Issue):W113‑W120）。
例如，siRNA正义或反义链的磷酸二酯键可被硼烷磷酸酯或硫代磷酸酯取代，以提高对核酸降解的抗性。例如，可引入至siRNA的正义或反义链的3'或5'端或这两端，优选地仅RNA末端，例如3'端的突出端（例如，（dT）n，n=1‑5的整数，优选2‑4的整数）。
再例如，可将ENA（乙烯桥接核酸）或LNA（锁核酸）引入至siRNA的正义或反义链的5'或3'端或这两端，并且优选地，可引入至siRNA正义链的5'端。从而，可提高siRNA的稳定性，降低免疫应答和非特异性抑制，并且不影响RNAi的活性。
又例如，核糖环的2'‑OH基团可被‑NH2（氨基）、‑C‑烯丙基（烯丙基）、‑F（氟基）或‑O‑Me（或CH3，甲基）取代。例如，反义链的第一个和第二个核酸的核糖的2'‑OH基团可被2'‑O‑Me取代，反义链的第二个核酸的核糖的2'‑OH基团可被2'‑O‑Me取代，或者包含鸟嘌呤（G）或尿嘧啶（U）的核苷酸的核糖的2'‑OH可被2'‑O‑Me（甲基）或2'‑F（氟基）取代。
除了上述化学修饰以外，还可进行各种化学修饰，可进行一种化学修饰，也可组合进行多种化学修饰。
根据一个实施方式，化学修饰可以是表4的化学修饰中的一种，mod1至mod7可不修饰反义链的第10和11个碱基，并且所有mod1至mod10的siRNA的正义和反义链的3'端的dTdT（磷酸二酯键）可被硫代磷酸键（3'‑dT*dT，*：硫代磷酸键）取代。
在化学修饰中，优选地可降低基因表达的敲除活性，同时稳定siRNA的双链结构，因此优选最小的修饰。
并且，可在siRNA的5'‑或3'端连接配体，例如胆固醇、生物素或穿膜肽。
本发明的siRNA可通过体外转录或使用Dicer或具有类似活性的其他核酸酶裂解长双链RNA来生产。或者，如上所述，可通过质粒或病毒表达载体等来表达siRNA。
可通过实验确认特定的siRNA序列是否诱导含有树突细胞的人外周血单个核细胞（PBMC）中的干扰素，然后选择不诱导免疫应答的序列，从而选出候选的siRNA序列。
下面，描述用于递送siRNA的药物递送系统（DDS）。
核酸递送系统可用于提高siRNA的细胞内递送效率。
用于将核酸材料递送到细胞中的核酸递送系统可包括病毒载体、非病毒载体、脂质体、阳离子聚合物微胶粒、乳剂和固体脂质纳米粒等。非病毒载体可具有高递送效率和长保留时间。病毒载体可包括转录病毒载体、腺病毒载体、牛痘病毒载体、腺相关病毒载体、溶瘤腺病毒载体等。非病毒载体可包括质粒。另外，可使用各种形式，例如脂质体、阳离子聚合物微胶粒、乳剂、固体脂质纳米粒等。用于递送核酸的阳离子聚合物可包括天然聚合物例如壳聚糖、去端肽胶原、阳离子多肽等，以及合成聚合物例如聚（L‑赖氨酸）、线形或分支聚乙烯亚胺（PEI）、基于环糊精的聚阳离子、树形分子等。
可将本发明的siRNA或siRNA的复合体以及核酸递送系统通过体内或体外途径引入细胞用于癌症治疗。如下面的实施例所示，如果本发明的siRNA或siRNA的复合体或核酸递送系统被引入细胞，则可选择性地抑制Hif1α的表达从而降低与瘤形成相关的靶蛋白Hif1α的表达，因此可杀死癌细胞和可治疗癌症。
本发明的siRNA或含有该siRNA的药物组合物可配制用于局部、经口或非经肠给药等。特别地，siRNA的给药途径可以是局部给药例如眼内、阴道内或肛门内等，非经肠给药例如肺内、支气管内、鼻腔内、包膜、内皮内、静脉内、动脉内、皮下、腹腔内、肌肉内、颅内（鞘内或脑室内）等，或经口给药等。对于局部给药，可将siRNA或包括该siRNA的药物组合物配置为片剂、软膏、乳液、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、溶液、粉剂等形式。对于非经肠给药，鞘内或脑室内给药，siRNA或含有该siRNA的药物组合物可包括含有适宜的添加剂的无菌水溶液，例如缓冲液、稀释液、渗透促进剂、其他药物可接受的载体或赋形剂。
进一步，siRNA可与可注射溶液混合并以注射剂的形式通过瘤内注射而给药，或可与凝胶或透皮粘合剂组合物混合并通过经皮给药途径直接分散或贴附至欲给药的感染区域。可注射溶液没有特别限制，但优选地，可以是等渗水溶液或悬浮液，并且可以是无菌的和/或含有添加剂（例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、增溶剂、用于控制渗透压的盐、缓冲液和/或脂质体制剂）。凝胶组合物可含有传统的凝胶制剂例如羧甲基纤维素、甲基纤维素、丙烯酸聚合物、羧乙烯聚合物等以及药学上可接受的载体和/或脂质体制剂。并且，在透皮粘合剂组合物中，活性成分层可包括粘合剂层、用于吸收皮脂的吸收层和治疗药物层，并且治疗药物层可含有药学上可接受的载体和/或脂质体制剂，但不限于此。
进一步，除了用于抑制Hif1α表达的siRNA以外，本发明的用于治疗癌症的药物组合物可进一步包括已知的抗癌化疗药物，从而可期望组合效应。可与本发明的用于抑制Hif1α表达的siRNA一起组合给药的抗癌化疗药物可包括顺氯氨铂、碳基氯氨铂、奥沙利铂、阿霉素、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、戊柔比星、姜黄素、吉非替尼、厄洛替尼、西妥昔单抗、拉帕替尼、曲妥珠单抗、舒尼替尼、索拉非尼、贝伐单抗、硼替佐米、替西罗莫司、依维莫司、伏立诺他、伊立替康、拓扑替康、长春碱、长春新碱、多西他赛、紫杉醇以及它们的组合。
进一步，除了与化疗药物组合以外，或与之相独立地，用于抑制各种生长因子（VEGF、EGF、PDGF等）、生长因子受体和下游信号转到蛋白、病毒致癌基因、抗癌剂和药物抗性基因的表达的siRNA可与Hif1αsiRNA组合，从而同时阻断各种癌途径而使抗癌效果最大化。
根据本发明的另一实施方式，提供了一种用于抑制Hif1α的表达和/或合成的方法，包括使有效量的Hif1αsiRNA与表达Hif1α的细胞接触。所述细胞可包括表达Hif1α的任何细胞，例如癌细胞，并且可包括动物、优选哺乳动物、例如人类、猴子、啮齿类（小鼠、大鼠）等的体内的细胞，并且细胞从动物体分离。例如，用于抑制Hif1α的表达和/或合成的方法包括提供从动物体分离的表达Hif1α的细胞；以及使siRNA与从动物体分离的表达Hif1α的细胞接触。表达Hif1α的细胞可通过人工培养从动物体分离的表达Hif1α的细胞而获得。
根据另一个实施方式，提供了一种用于抑制癌细胞生长的方法，包括使有效量的用于抑制Hif1α的合成和/或表达的Hif1αsiRNA与癌细胞接触。癌细胞可以是存在于动物，优选哺乳动物例如人类、猴子、啮齿类（小鼠，大鼠）等的体内的癌细胞，或从动物体分离的癌细胞。例如，用于抑制癌细胞生长的方法可包括提供从动物体分离的表达Hif1α的癌细胞，并且使siRNA与从动物体分离的表达Hif1α的癌细胞接触。
根据另一个实施方式，提供了一种预防和/或治疗癌症的方法，包括向需要预防和/或治疗癌症的患者给予有效量的Hif1αsiRNA和/或含有siRNA的表达载体。该预防和/或治疗癌症的方法还包括在给药前确定需要预防和/或治疗癌症的患者。
根据本发明的可以治疗的癌症可以是选自由大多数实体癌症（例如肺癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、甲状腺癌、食道癌、前列腺癌、脑癌等）、皮肤癌、骨肉瘤、软组织肉瘤、神经胶质瘤、淋巴瘤等所组成的组中的至少一种。
患者可包括哺乳动物、优选人类、猴子、啮齿类（小鼠、大鼠等）等，特别地，患者包括哺乳动物，例如患有与Hif1α表达相关的疾病或病症（例如癌症）或需要抑制Hif1α表达的人类。
根据本发明的siRNA的有效量是指获得抑制Hif1α表达或合成，或者产生癌细胞生长抑制的效果以及癌症治疗效果而需要给药的量。因此，可取决于各种因素而适宜地控制，这些因素包括疾病的种类或严重等级、给药siRNA的种类、剂型的种类、患者的年龄、体重、正常健康水平、性别或饮食、给药时间、给药途径、和给药时间、组合药物例如组合的化学治疗剂等。例如，每日剂量可以为0.001mg/kg～100mg/kg，可以一次给药或分成几次给药。
与本发明的Hif1α转录本（mRNA）的碱基序列互补的siRNA可通过RNA介导的干扰（RNAi）抑制通常在癌细胞中表达的Hif1α的表达从而杀死癌细胞，因此显示出卓越的抗癌效果。并且，可使免疫应答的诱导最小化。
本发明中采用的使用RNA介导的干扰的RNAi技术被提出作为选择性抑制Hif1α表达的最有效方法，其具有很大潜力和精确基因选择性。现有的药物抑制已表达的蛋白质的功能，而RNAi技术是天然基因沉默途径，可选择性地抑制诱导特定疾病的蛋白质的表达并降解蛋白质合成前期的mRNA，从而，可抑制癌的生长和转移而不诱发副作用，并且会成为更根本的癌症疗法。
进一步，通过将化学疗法与siRNA组合来提高对化疗药物的敏感性，可使治疗活性最大化并降低副作用，并且，通过将抑制各种生长因子（VEGF、EFG、PDGF等）、生长因子受体和下游信号转导蛋白、病毒致癌基因和抗癌剂抗性基因的表达的siRNA与Hif1αsiRNA组合来同时阻断各种癌的途径，可使抗癌效果最大化。
实施例
下面，通过以下的实施例描述本发明。
然而，这些实施例仅旨在例示本发明，本发明的范围不限于此。
实施例1.设计用于抑制Hif1α表达的siRNA可结合的靶碱基序列
使用siDesign Center（Dharmacon）、BLOCK‑iTTM RNAi Designer（Invitrogen）、AsiDesigner（KRIBB）、siDirect（东京大学）和siRNA Target Finder（Ambion）的siRNA设计程序，从Hif1αmRNA序列（NM_001530）得到siRNA可结合的靶碱基序列。在下表5中，表示为cDNA序列的序列表示靶碱基序列。
[表5]
靶碱基序列（cDNA序列）
SEQ ID NO序列(5'‑>3')2GTTTGAACTAACTGGACAC3TGATTTTACTCATCCATGT4CATGAGGAAATGAGAGAAA5GAGAAATGCTTACACACAG6CGAGGAAGAACTATGAACA7GAACATAAAGTCTGCAACA8TGATACCAACAGTAACCAA9TCAGTGTGGGTATAAGAAA10GCTGATTTGTGAACCCATT11GCCGCTCAATTTATGAATA12GCATTGTATGTGTGAATTA13TCAGGATCAGACACCTAGT14ATTTAGACTTGGAGATGTT15AGAGGTGGATATGTCTGGG16CACCAAAGTGGAATCAGAA
17TTCAAGTTGGAATTGGTAG18AAAGTCGGACAGCCTCACCAA
实施例2.制造用于抑制Hif1α表达的siRNA
从ST Pharm有限公司（韩国）获得实施例1中设计的可结合至靶碱基序列的20种siRNA。20种siRNA记载于表6中，其中两条链的3'端都包括dTdT。
[表6]
用于抑制Hif1α表达的siRNA的碱基序列


实施例3.使用siRNA在癌细胞系中的Hif1α表达抑制试验
使用实施例2中制造的每种siRNA转化人类肺癌细胞系（A549，ATCC），在转化的癌细胞系中测定Hif1α的表达。
实施例3‑1.癌细胞系的培养
将从美国标准培养物集存库（ATCC）获得的人类肺癌细胞系（A549）在37℃、5%（v/v）CO2、使用含有10%（v/v）胎牛血清、盘尼西林（100单位/ml）和链霉素（100ug/ml）的RPMI培养基（GIBCO/Invitrogen，美国）进行培养。
实施例3‑2.制造用于抑制Hif1α表达的siRNA与脂质体的复合体
对实施例1中设计并合成的20种siRNA，制备用于递送它们的Hif1α表达抑制的siRNA与脂质体lipofectamine2000（Invitrogen）的复合体。
将含有10nM siRNA的Opti‑MEM培养基（Gibco）25ul和每孔含有0.4ul lipofectamine2000（Invitrogen）Opti‑MEM培养基以相同的体积混合，并在室温下反应20分钟，以制备siRNA与脂质体的复合体。
实施例3‑3.使用靶向Hif1α的siRNA抑制癌细胞系中的Hif1αmRNA表达
将实施例3‑1中培养的癌细胞系以每孔104细胞接种于96孔板中。24小时后，移除培养基，并以每孔50μl的量添加Opti‑MEM培养基。添加实施例3‑2中制备的siRNA与脂质体的复合体组合物50μl，并在细胞培养器中培养，同时保持在37℃和5%（v/v）CO224小时。
IC50值是Hif1αmRNA表达50%受抑制的药物浓度，为了计算该IC50值，使用0.001nM至10nM之间的7种浓度的每种siRNA处理A549细胞系。
实施例3‑4.Hif1αmRNA–肺癌细胞的定量分析
使用Quantigene2.0系统（Panomics公司）通过bDNA分析来测定表达被siRNA脂质体复合体抑制的Hif1αmRNA的表达水平。
使用siRNA脂质体复合体处理细胞24小时后，对mRNA进行定量。根据制造商的方案，使用96孔板的每孔100μl裂解液混合物（Panomics，Quantigene2.0bDNA试剂盒）处理以在50℃系裂解细胞。从Panomics公司购买特异性结合至Hif1αmRNA的探针（Panomics，Cat.#SA‑11598），并在96孔板中与80μl所得的细胞样品混合在一起。在55℃下反应16至20小时，从而可使mRNA被固定在孔中并与探针结合。接着，在每孔中引入100μl的试剂盒的扩增试剂，反应并洗涤，该过程以两个阶段进行。引入第三扩增试剂100μl并在50℃下反应，然后引入100μl的发光诱导试剂，并在5分钟后，通过发光检测器（Bio‑Tek，Synergy‑HT）测定荧光素，以计算与仅使用lipofectamine处理的对照品（100%）的发光值相比的百分比值。该百分比表示对照品与每种siRNA处理的试验组的Hif1αmRNA表达比率。
在人类肺癌细胞系A549中，使用10nM Hif1αsiRNA脂质体复合体处理的试验组的荧光素值的相对值相比于仅使用脂质体处理的对照品的荧光素质进行计算，以测定使用siRNA转化的A549细胞系中的Hif1αmRNA表达水平，结果记载于下表7。
[表7]
使用10mN siRNA处理的人类肺癌细胞系（A549）中Hif1αmRNA的相对表达比率

在表7中，SEQ ID NO2、3和5‑14（siRNA NO1、2和4至13）与本发明的实施例相对应，SEQ ID NO4和15‑18（siRNA No3和14‑17）示为比较例。如表7所示，测试了使用总共17种siRNA转染的细胞系中Hif1αmRNA的表达，结果是本发明的12种siRNA与比较例的5种siRNA相比显示出卓越的抑制效果。特别地，在本发明的12种siRNA中，9种siRNA显示出大于40%且小于70%的抑制率（大于30%且小于60%的表达率），3种siRNA显示出70%或更高的抑制率（小于30%的表达率）。
对于表7中具有卓越基因表达抑制效果的3种siRNA5、9和11，使用A549细胞系在10nM至0.001nM的范围内测试降低Hif1αmRNA表达的效果，以计算IC50，且结果记载于下表8。使用由SofrMax pro software Biotek（Synergy‑HT ELISA装置）模型且由Spectra Max190（ELISA装置）模型支持的KC4软件来计算IC50值。siRNA5、9和11的IC50值表现出比siRNA3和16的IC50值低4至500倍。
[表8]
A549细胞系中的IC50（nM）

实施例3‑5.非对称siRNA_肺癌细胞的Hif1αmRNA抑制效果
将肺癌细胞系A549分别用靶向至SEQ ID NO.6、10或12的对称结构的siRNA5、9和11以及正义链短于反义链的非对称结构的siRNA18、19和20各10nM进行处理，并测试Hif1αmRNA抑制效果，结果记载于下表9。实验方法与实施例3‑4相同。
[表9]按照结构修饰的Hif1αmRNA抑制率


如表9中所示，如果靶向至SEQ ID NO6、10和12，在非对称siRNA中，也可将H if1α有效抑制到与对称siRNA类似的水平。
实施例4.siRNA的化学修饰
制造化学修饰的siRNA5、9和11
如下表10中所示，设计10种化学修饰的siRNA，其中化学修饰是使用2'‑O‑Me、硫代磷酸键、2'‑F或通过在末端引入ENA（乙烯桥接核酸）来进行。由ST Pharm有限公司（韩国）合成化学修饰的siRNA。
[表10]
化学修饰的siRNA



[表11]化学修饰的符号
符号引入的化学修饰*磷酸二酯键→硫代磷酸键下划线2'‑OH→2'‑O‑Me小写字母2'‑OH→2'‑F黑体字母ENA(2'‑O,4'‑C乙烯桥接核苷酸)
[表12]siRNA的化学修饰

其中mod1和mod7不修饰反义链的第10个和第11个碱基，并且在mod1至mod10的所有siRNA正义和反义链的3'端的dTdT（磷酸二酯键）都被硫代磷酸键（3'‑dT*dT，*：硫代磷酸键）取代。
实施例5.癌细胞系中化学修饰siRNA的mRNA抑制效果
为了确认实施例4的化学修饰的siRNA是否保持在癌细胞系中的mRNA抑制活性，将未修饰的siRNA（siRNA5、9和11）以及30个化学修饰的siRNA（siRNA21‑50）分别配制成实施例3‑2那样的脂质体复合体中，并转染到人类肺癌细胞系（A549，ATCC）（10nM siRNA）中，以与实施例3‑4相同的方式对被转染癌细胞系中的Hif1α表达进行定量分析，结果记载于下表13。
[表13]
使用10nM化学修饰的siRNA处理的A549细胞系中的Hif1αmRNA表达率（%）
 siRNA No.5siRNA No.9siRNA No.11mod014.98.18.9mod146.38.617.6mod237.27.916.2mod323.061.310.9mod416.367.135.9mod56.220.28.0mod65.66.512.9mod74.17.011.1mod84.07.810.1mod96.06.78.9mod107.79.68.8
（未被化学修饰的原始siRNA记为mod0。）
如表13中所示，即使当siRNA5、9和11被化学修饰，在癌细胞系中mRNA抑制效果也得以维持。特别地，mod5、mod6、mod7、mod8、mod9和mod10显示出与未被修饰的siRNA相比等同或更高的效果。
实施例6.对免疫活性细胞因子释放的影响
为了评估本发明的siRNA是否具有免疫毒性，通过下面的过程进行实验。
实施例6‑1.外周血单个核细胞的制备
在实验日使用Histopaque1077试剂（Sigma，St Louis，美国密苏里州）通过密度梯度离心由健康志愿受试者提供的血液中分离人外周血单个核细胞（PBMC）（Boyum A.Separation of leukocytes from blood and bone marrow.Scand J Clin Lab Invest21(Suppl97):77,1968）。小心地将血液以1:1的比例（以重量计）引入到接种于15ml试管的Histopaque1077试剂上，使其不会相互混合。在室温下以400x g离心后，使用无菌移液管仅分离出含有PBMC的层。向含有分离的PBMC的试管中，转移10ml磷酸盐缓冲盐溶液（PBS），然后将混合物以250x g离心10分钟，使用5ml PBS再洗涤PBMC两次。使用无血清x‑vivo15培养基（Lonza，Walkersville，美国马里兰州）将分离的PBMC悬浮为4×106细胞/ml的浓度，并以每孔100ul的量接种于96孔板中。
实施例6‑2.siRNA‑DOTAP复合体的配制
按下述制备用于转染实施例6‑1中制备的PBMC的siRNA‑DOTAP复合体。分别混合5ul的DOTAP转染试剂（ROCHE，德国）和45ul的x‑vivo15培养基、以及1ul（50uM）的mod1至mod10化学修饰的siRNA5、9、11和49ul的x‑vivo15培养基，然后在室温下反应10分钟。10分钟后，混合含有DOTAP的溶液和含有siRNA的溶液，并在20至25℃的温度下反应20分钟，以制备siRNA‑DOTAP复合体。
实施例6‑3.细胞培养
在实施例6‑1的接种的PBMC培养溶液100ul中，以每孔100ul的量加入根据实施例6‑2制备的siRNA‑DOTAP复合体（siRNA最终浓度250nM），然后，在37℃的CO2孵育器中培养18小时。作为对照，使用未用siRNA‑DOTAP复合体处理的细胞培养物组和仅使用DOTAP而未使用siRNA处理的细胞培养物组。并且，将用于替代siRNA的已知诱导免疫应答的材料，即Poly I:C（聚肌苷酸‑聚胞苷酸钾盐，Sigma，USA)和siApoB‑1siRNA（正义GUC AUC ACA CUG AAU ACC AAU（SEQ ID NO116），反义：*AUU GGU AUU CAG UGU GAU GAC AC，*：5'磷酸盐（SEQ ID NO117），ST Pharm公司）通过与实施例6‑2相同的方法配制成带有DOTAP的复合体，并且对细胞培养物组使用该复合体进行处理并作为阳性对照。培养以后，仅分离细胞上清液。
实施例6‑4.免疫活性的测定
为了测定免疫活性，如实施例6‑3那样使用siRNA‑DOTAP复合体处理外周血单个核细胞，并对释放的细胞因子进行定量。释放到上清液中的干扰素α（INF‑α）和干扰素γ（INF‑γ）、肿瘤坏死因子（TNF‑α）和白介素‑12（IL‑12）的含量使用Procarta Cytokine分析试剂盒（Affymetrix，美国）进行测定。具体地，将50ul连接有细胞因子抗体的小珠（抗体珠）移动到滤板上，并使用缓冲液洗涤一次，然后，加入50ul PMBC培养溶液的上清液和细胞因子标准溶液，并在室温下以500rpm振荡孵育60分钟。使用测定装置、含有连接细胞因子抗体的小珠的样品、以及包含在Procarta Cytokine分析试剂盒中的洗涤缓冲液以及细胞因子标准溶液。
然后，使用洗涤缓冲液洗涤溶液一次，加入包括在试剂盒中的检测抗体25ul，并在室温下以500rpm振荡孵育30分钟。再一次，在减压下移除反应溶液并洗涤，然后加入50ul包含在试剂盒中的链霉亲和素‑PE（链霉亲和素藻红蛋白），并在室温下以500rmp振荡孵育30分钟，然后，移除反应溶液并洗涤三次。加入120ul读取缓冲液并将反应溶液以500rpm振荡5分钟，然后，使用Luminex装置（Bioplex luminex系统，Biorad，美国）测定每个细胞因子小珠的PE荧光。使用各250nM siRNA处理PBMC时释放到细胞培养介质中的细胞因子的浓度（pg/ml）记载于下表14中。样品中的细胞因子浓度由1.22～20,000pg/ml范围的标准校正曲线来计算。
[表14]使用250nM化学修饰的siRNA处理PBMC时释放到细胞培养介质中的细胞因子的浓度（pg/ml）


在表14中，“培养基”表示未处理的对照品，“DOTAP”表示仅用DOTAP处理的组，“POLY I:C”或“siApoB‑1”表示正向对照组，“siRNA5”表示试验组，其中如所示的那样SEQ ID NO27和28被化学修饰，“siRNA9”表示试验组，其中如所示的那样SEQ ID NO35和36的siRNA被化学修饰，以及“siRNA11”表示试验组，其中如所示的那样SEQ ID NO39和40被化学修饰。
化学修饰的mod1～10显示出干扰素α值的微小上升，其他细胞因子的几乎无变化或非常小的升高。干扰素α的值按照mod1→mod2→mod3、mod4、mod5、mod8、mod9和mod10的顺序显著下降至仅使用DOTAP处理的组的水平，因此，本发明的化学修饰的siRNA5、9和11可降低免疫活性。
实施例7.通过化学修饰的siRNA抑制正义链脱靶效应
进行下面的实验来测试是否可通过siRNA的化学修饰来去除正义链脱靶效应
正义链脱靶效应级别可以这样确认：如果正义链结合至RISC且作用于具有与正义链互补的碱基序列的序列，则由具有与正义链互补的序列的萤火虫荧光素酶质粒所表达的荧光素酶的量与没有使用siRNA处理的细胞相比降低。并且，对于使用具有与反义互补的序列的萤火虫荧光素酶质粒处理的细胞，由反义造成的siRNA活性的维持级别可通过由siRNA显示的荧光素酶的降低水平来确认，即使是在化学修饰以后。
实施例7‑1.萤火虫荧光素酶载体的制备
与siRNA的反义链互补的序列和与正义链互补的序列分别克隆到表达萤火虫荧光素酶的pMIR‑REPORT（Ambion）载体中，从而制备两种不同的质粒。利用Cosmo Genetech设计和合成互补的序列，使得两个末端都具有SpeI和HindIII酶位点突出端，然后，使用pMIR‑REPORT载体的SpeI和HindIII酶位点进行克隆。
实施例7‑2.化学修饰的siRNA的脱靶效应的测定
使用在实施例7‑1中制备的包括分别与siRNA的每个正义链和反义链互补的序列的质粒，测定siRNA的反义和正义链的作用。
特别地，将实施例7‑1中制备的萤火虫荧光素酶载体与siRNA一起转染到A549细胞（ATCC）中，然后，通过荧光素酶分析来测定所表达的萤火虫荧光素酶的量。在转染的前一天，以6*104细胞/孔在24孔板中制备A549细胞系。使用lipofectamine2000（Invitrogen)与表达海肾萤光素酶（renilla luciferase）的pRL‑SV40载体的标准化载体（2ng，Promega）一起，在Opti‑MEM培养基（Gibco）中将其中克隆有互补碱基序列的荧光素酶载体（100ng）转染。24小时以后，使用裂解液裂解细胞，通过双荧光素酶试剂盒（Promega）测定荧光素酶活性。
用测得的海肾萤光素酶的值，将测得的萤火虫荧光素酶的值标准化为转染效率，然后计算相对于对照品的标准化的荧光素酶值（100%）的百分比，其中，对照品被海肾萤光素酶载体和萤火虫荧光素酶载体转染，海肾萤光素酶载体和萤火虫荧光素酶载体中与每条链互补的序列被克隆而不是siRNA被克隆。结果记载于下表15。
[表15]通过siRNA的化学修饰降低的感受效果


（未被化学修饰的原始siRNA记为mod0）
如表15中所示，在人类肺癌细胞系中，在siRNA5和siRNA11的情况中，未被修饰的siRNA（mod0）本身没有正义链脱靶效应。然而，随着具有与siRNA9的正义链互补的序列的萤火虫荧光素酶活性的降低，观察到轻微的正义链的脱靶效应，但是若被化学修饰，则脱靶效应降低，反义靶效应被维持，特别是mod2、6、7、9和10。