《纯白色真姬菇FINCW62菌种的分子标记及其获得方法与应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《纯白色真姬菇FINCW62菌种的分子标记及其获得方法与应用.pdf（9页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103289997 A (43)申请公布日 2013.09.11 CN 103289997 A *CN103289997A* (21)申请号 201310030551.8 (22)申请日 2013.01.25 C12N 15/11(2006.01) C12N 15/10(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 上海丰科生物科技股份有限公司 地址 201401 上海市奉贤区奉贤现代农业园 区高丰路 968 号 (72)发明人 刘玉 (74)专利代理机构 上海汉声知识产权代理有限 公司 31236 代理人 胡晶 (54) 发明名称 纯白色真。
2、姬菇 Finc-W-62 菌种的分子标记及 其获得方法与应用 (57) 摘要 一 种 纯 白 色 真 姬 菇 Finc-W-62 菌 种 的 分 子 标 记， 其 特 异 性 PCR 扩 增 引 物 对 序 列 为 5-ATAAGGCGTTCCAAACTCATCTC-3 和 5-TAAGAGACCAACTGCCCTTATCTC-3 ； DNA 片 段 大 小为 1082bp。本发明还公开了一种纯白色真姬菇 Finc-W-62 的分子标记的获得方法与应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要。
3、求书1页 说明书6页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103289997 A CN 103289997 A *CN103289997A* 1/1 页 2 1. 一种纯白色真姬菇 Finc-W-62 菌种的分子标记， 其特征在于 ： 特异性 PCR 扩增引物 对序列为 5-ATAAGGCGTTCCAAACTCATCTC-3 和 5-TAAGAGACCAACTGCCCTTATCTC-3 ； DNA 片 段大小为 1082bp。 2. 一种纯白色真姬菇 Finc-W-62 菌种的分子标记的获得方法， 其特征在于 ： 包括如下 步骤 ： 1） 获得菌丝或者子实体 ； 2） 基因组 DNA 提取 ；。
4、 3） RAPD 法分析并获得特异 DNA 片段 ： 采用 RAPD 法分析并获得真姬菇菌株 Finc-W-62 的特异 DNA 片段所用随机引物序列为 ： GGCGGATAAG。 4） 特异引物设计 ： 以上述获得的特异 DNA 片段序列为基础， 设计特异 PCR 扩增引物， 引 物对序列是 5-ATAAGGCGTTCCAAACTCATCTC-3 和 5-TAAGAGACCAACTGCCCTTATCTC-3。 5） SCAR 分子标记的 PCR 扩增 ： 用特异 PCR 扩增引物对真姬菇 Finc-W-62 菌株的基因组 进行 SCAR-PCR 扩增， 得到 1082bp 的特异分子标记。 。
5、6） 电泳检测。 3. 根据权利要求 2 所述的一种纯白色真姬菇 Finc-W-62 菌株的分子标记的获得方法， 其特征在于 ： 所述步骤 3） 中 RAPD 法的 PCR 扩增反应体系为 ： 总体积 25L ： 基因组模板 20-30ng/L 1.0L， 随机引物 0.5pmol/L 1.0L， 10mM dNTP mix0.5L， 10Taq 缓 冲液 2.5L， 25mM MgCl2 2.0L， Taq 酶 5U/L 0.25L， 加水至 25L ； PCR 反应条件 ： 预 变性 95 3min ； 94 45s， 36 60s， 72 2min， 35 个循环 ； 72延伸 10mi。
6、n ； 纯白色真姬菇 Finc-W-62 菌株特异 DNA 片段大小为 1082bp。 4. 根据权利要求 2 或 3 所述的一种纯白色真姬菇 Finc-W-62 菌株的分子标记的获得 方法， 其特征在于 ： 所述步骤 5） 中 SCAR 分子标记的 PCR 扩增， 其体系为 ： 总体积 25L， 模 板 20 30ng/L 1L， 真姬菇 Finc-W-62 特异引物对 0.5pmol/L 各 0.5L， 10mM dNTP mix0.5L， 10Taq Buffer 2.5L， 25mM MgCl2 2.0L， Taq 酶 5U/L 0.25L， 加水至 25L ； PCR 反应条件 ： 。
7、预变性 95 3min ； 94 30s， 62 30s， 72 1min， 35 个循环 ； 72延 伸 5min。 5.根据权利要求1所述的一种纯白色真姬菇Finc-W-62菌株的分子标记应用于纯白色 真姬菇 Finc-W-62 菌株的快速鉴定和检测。 权 利 要 求 书 CN 103289997 A 2 1/6 页 3 纯白色真姬菇 Finc-W-62 菌种的分子标记及其获得方法与 应用 【技术领域】 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种纯白色真姬菇 Finc-W-62 菌种的分子标 记及其获得方法与应用。 【背景技术】 0002 真姬菇 （拉丁文名称 Hypsizygus 。
8、marmoreus） ， 隶属担子菌亚门、 层菌纲、 伞菌目、 白蘑科、 玉蕈属， 因它具有独特的蟹鲜味， 故又称它为蟹味菇。最初的人工栽培于 1978 年前 后开始于日本， 其味道鲜美、 食感脆嫩、 营养丰富， 其味比平菇鲜， 其肉比滑菇厚， 其质比香 菇韧， 口感甚佳， 其干品还香味浓溢。真姬菇含有丰富的维生素和 17 种氨基酸， 子实体中提 取的 - 葡聚糖具有很高的抗肿瘤活性， 是一种低热量、 低脂肪的保健食品。 0003 传统食用菌菌种鉴别， 尤其对于真姬菇， 其主要依据是子实体的外观形态、 拮抗试 验、 出菇对比等。外观形态易受栽培环境 （温度、 湿度、 CO2浓度、 光照强度及通。
9、风等） 和配方 的影响， 造成外观形态鉴定的困难。亲缘关系较近的菌株之间 （比如有些亲本和子代之间） ， 拮抗现象不明显， 通过拮抗试验鉴别菌种也存在困难。出菇对比试验耗时至少 4 个月， 不利 于菌种的鉴定和检测。 随着分子生物学的发展， 分子标记法越来越广泛地用于菌种的鉴别。 SCAR（Sequence-characterized Amplified Region） 标记是一种十分稳定的分子标记， 能 够简便、 快速、 稳定的进行菌种鉴定， 但目前尚未有对纯白色真姬菇Finc-W-62的SCAR分子 标记， 以便快速鉴定纯白色真姬菇 Finc-W-62。 【发明内容】 0004 本发明解决。
10、的技术问题是克服现有技术存在的问题， 提供一种纯白色真姬菇 Finc-W-62 菌种的分子标记及其获得方法。 0005 本发明采用 PCR 技术进行了大量的筛选试验， 其中， 采用随机引物 （序列为 ： GGCGGATAAG） 获得了真姬菇菌株 Finc-W-62 的特异 DNA 片段， 分子量为 1093bp， 将该片段 克隆测序， 以此片段的 DNA 序列为基础， 设计特异 PCR 扩增引物， 其特异引物对序列为 ： 5-ATAAGGCGTTCCAAACTCATCTC-3 和 5-TAAGAGACCAACTGCCCTTATCTC-3。该引物对对真姬 菇 Finc-W-62 菌株进行 PCR。
11、 扩增， 可以获得分子量大小为 1082bp 的特异片段， 即为真姬菇 菌株 Finc-W-62 的分子标记。 0006 本发明还公开一种纯白色真姬菇 Finc-W-62 菌种的分子标记的获得方法， 包括如 下步骤 ： 0007 1） 获得菌丝或者子实体 ； 0008 2） 基因组 DNA 提取 ； 0009 3） RAPD 法分析并获得特异 DNA 片段 ： 采用 RAPD 法分析并获得真姬菇菌株 Finc-W-62 的特异 DNA 片段所用随机引物序列为 ： GGCGGATAAG。 0010 4）特 异 引 物 设 计 ： 以 上 述 获 得 的 特 异 DNA 片 段 序 列 为 基 础。
12、，设 计 说 明 书 CN 103289997 A 3 2/6 页 4 特 异 PCR 扩 增 引 物， 引 物 对 序 列 是 5-ATAAGGCGTTCCAAACTCATCTC-3 和 5-TAAGAGACCAACTGCCCTTATCTC-3。 0011 5） SCAR 分子标记的 PCR 扩增 ： 用特异 PCR 扩增引物对真姬菇 Finc-W-62 菌株的基 因组进行 SCAR-PCR 扩增， 得到 1082bp 的特异分子标记。 0012 6） 电泳检测。 0013 所述步骤 3）中 RAPD 法的 PCR 扩增反应体系为 ： 总体积 25L ： 基因组模板 20-30ng/L 1.。
13、0L， 随机引物 0.5pmol/L 1.0L， 10mM dNTP mix 0.5L， 10Taq 缓 冲液 2.5L， 25mM MgCl2 2.0L， Taq 酶 5U/L 0.25L， 加水至 25L ； PCR 反应条件 ： 预 变性 95 3min ； 94 45s， 36 60s， 72 2min， 35 个循环 ； 72延伸 10min ； 纯白色真姬菇 Finc-W-62 菌株特异 DNA 片段大小为 1082bp。 0014 所述步骤 5） 中 SCAR 分子标记的 PCR 扩增， 其体系为 ： 总体积 25L， 模板 20 30ng/L 1L， 真姬菇 Finc-W-62。
14、 特异引物对 0.5pmol/L 各 0.5L， 10mM dNTP mix 0.5L， 10Taq Buffer 2.5L， 25mM MgCl2 2.0L， Taq 酶 5U/L 0.25L， 加 水 至 25L ； PCR 反应条件 ： 预变性 95 3min ； 94 30s， 62 30s， 72 1min， 35 个循环 ； 72延 伸 5min。 0015 本发明又公开一种纯白色真姬菇 Finc-W-62 菌株的分子标记用于纯白色真姬菇 Finc-W-62 菌株的快速鉴定和检测的应用， 具体为采用真姬菇 Finc-W-62 菌株特异检测 引物对真姬菇菌株进行 PCR 扩增， 根据。
15、能否产生 1082bp 大小的 DNA 片段， 作为对真姬菇 Finc-W-62 菌株进行鉴定和检测的依据。 0016 本发明的检测方法与常规的形态学检测、 拮抗试验和栽培出菇对比等鉴定方法相 比， 具有检测时间短、 准确性高的优点。 它既能克服形态学检测、 拮抗试验精确度差， 又能克 服栽培出菇对比耗时长的缺点。本方法在应用于已有的白色真姬菇菌株检测中发现， 其具 有 Finc-W-62 菌株的专一性。 【附图说明】 0017 图 1 是随机引物 S265 对 4 个真姬菇菌株的 PCR 扩增产物的电泳图谱， 其中 1 为 H-W， 2 为 Finc-W-62， 3 为 G-W， 4 为 G。
16、C-W， M 为 10kbp DNA ladder。 0018 图 2 是特异引物对对 4 个真姬菇菌株的 PCR 扩增产物的电泳图谱， 其中 1 为 H-W， 2 为 Finc-W-62， 3 为 G-W， 4 为 GC-W， M 为 10kbp DNA ladder。 【具体实施方式】 0019 以下实施例中的所述 “H-W” 是 2002 年日本北斗株式会社选育推出的纯白色真姬 菇品种， 它通体雪白、 无苦味 ； 所述 “G-W” 菌株是从市场上购买的一种真姬菇菌株， 它的原 基为灰色， 随着子实体的生长和发育逐渐变白， 采收期菌柄为灰白色， 菌盖为纯白色 ； 所述 “GC-W” 菌株为。
17、日本葛城新育成的白玉菇菌株。 0020 一种纯白色真姬菇 Finc-W-62 的分子标记的获得方法， 包括如下步骤 ： 0021 1） 菌丝培养和气生菌丝获得 0022 把低温保藏的 Finc-W-62 和 H-W、 G-W 和 GC-W 接种到 PDA 培养基上， 在温度 22、 湿度 75% 的条件下培养 20 天， 刮取气生菌丝， -20冻存。 说 明 书 CN 103289997 A 4 3/6 页 5 0023 2） 菌株基因组 DNA 提取 0024 按照生工生物工程 （上海） 股份有限公司 ( 以下简称 “生工” )SK1375 真菌基因组 DNA 抽提试剂盒说明书提取， 将所得。
18、到的 DNA 溶液置于 -20备用。 0025 3） RAPD 法分析 0026 请参见表 1， 选用 14 条随机引物进行 RAPD 分析。PCR 扩增及体系建立 （25L） ： 基 因 组 模 板 (20-30ng/L)1.0L， 随 机 引 物 (0.5pmol/L)1.0L， dNTP mix(10mM each)0.5L， 10Taq 缓冲液 2.5L， MgCl2（25mM） 2.0L， Taq 酶 (5U/L)0.25L， 加 水至 25L。PCR 反应条件 ： 预变性 95 3mim ； 94 45s， 36 60s， 72 2min， 35 个循环 ； 72延伸 10min。。
19、 0027 表 1 随机引物 0028 0029 经过筛选， 随机引物 S265 能扩增得到 Finc-W-62 菌株所特有的 DNA 条带， 请参阅 图 1。从图 1 可知， a 框所在位置的条带为 Finc-W-62 所特有， 而 H-W、 G-W 和 GC-W 所在泳道 对应位置上均无该条带出现。 0030 切割图 1 中 a 框所在位置 Finc-W-62 特有的 DNA 条带， 回收 DNA。回收方法按照生 工 UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒说明。 0031 回收的 DNA 采用常规测序， 结果见序列表， 其为 1093bp 的 DNA 片段。 0032 4） 特异引物的。
20、获得 0033 根据上述 1093bp 的 DNA 片段两端碱基序列， 用 Primer premier5.0 软件设 计特异引物序列， 所述 DNA 片段两端各舍弃数个碱基， 最终设计的扩增引物对序列为 5-ATAAGGCGTTCCAAACTCATCTC-3 和 5-TAAGAGACCAACTGCCCTTATCTC-3。 0034 5） SCAR 分子标记的 PCR 扩增 0035 用特异 PCR 扩增引物对 Finc-W-62 和 H-W、 G-W 和 GC-W 进行 SCAR-PCR 扩增。扩 增体系 ： 总体积 25L， 模板 (20-30ng/L)1L， 真姬菇 Finc-W-62 。
21、菌株检测专用引物 对 (0.5pmol/L) 各 0.5L， dNTPmix(10mM each)0.5L， 10Taq Buffer2.5L， MgCl2 （25mM） 2.0L， Taq 酶 （5U/L） 0.25L， 加水至 25L ； PCR 反应条件 ： 预变性 95 3min ； 94 30s， 62 30s， 72 1min35 个循环 ； 72延伸 5min。 0036 6） 电泳检测 0037 取上述 PCR 扩增产物 6L， 与 1L 加样缓冲液混匀， 点样于 1.5% 的琼脂糖凝胶 上， 于 0.5TBE 缓冲液中， 5V/cm 电压下电泳， 电泳结束后， 用 EB 染色。
22、， 进行琼脂糖凝胶电 泳， 然后在凝胶成像仪上照相， 其结果请参阅图 2 电泳图谱。 0038 从图2可知， 只有本发明真姬菇新菌株Finc-W-62有特异扩增条带， 而其他三种现 说 明 书 CN 103289997 A 5 4/6 页 6 有真姬菇菌株 H-W、 G-W 和 GC-W 均无扩增条带， 由此说明 5-ATAAGGCGTTCCAAACTCATCTC-3 和 5-TAAGAGACCAACTGCCCTTATCTC-3 是 Finc-W-62 的 SCAR 分子标记引物。用该引物对所 扩增出的DNA片段分子量为1082bp， 所述大小为1082bp的特异DNA片段是本发明真姬菇新 菌。
23、株 Finc-W-62 的 SCAR 分子标记。 0039 在本实施例中， 采用菌丝进行基因组 DNA 的提取， 显然， 采用子实体也同样可以进 行基因组 DNA 的提取。提取的方法已为现有技术所公开， 在此不在赘述。 0040 以上描述仅为本发明的实施例， 谅能理解， 在不偏离本发明构思的前提下， 对本发 明的简单修改和替换皆应包含在本发明的技术构思之内。 0041 说 明 书 CN 103289997 A 6 5/6 页 7 0042 说 明 书 CN 103289997 A 7 6/6 页 8 说 明 书 CN 103289997 A 8 1/1 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103289997 A 9 。