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1、(10)申请公布号 CN 103525790 A (43)申请公布日 2014.01.22 CN 103525790 A (21)申请号 201310473865.5 (22)申请日 2013.10.12 C12N 9/42(2006.01) C12N 15/56(2006.01) C12N 15/63(2006.01) A23K 1/165(2006.01) (71)申请人 青岛根源生物技术集团有限公司 地址 266736 山东省青岛市平度市南村镇友 谊大道 42 号青岛海峡两岸农业合作试 验区 (72)发明人 张大伟 杜彦龙 (74)专利代理机构 青岛联智专利商标事务所有 限公司 3710。
2、1 代理人 王晓晓 (54) 发明名称 一种优化的耐高温甘露聚糖酶 MAN5gy 及其 制备方法和应用 (57) 摘要 本发明提供了一种优化的耐高温甘露聚糖酶 MAN5gy 及其制备方法和应用。本发明突变了来源 于黑曲霉的甘露聚糖酶 MAN5gy， 获得的氨基酸序 列如 SEQIDNO.3 所示， 且本发明提供了编码上述 阿拉甘露聚糖酶的编码基因man5gy。本发明突变 后的甘露聚糖酶的具有以下性质 ： 最适 pH4.0， 最 适温度 65。所述甘露聚糖酶适用于饲料工业， 可与木聚糖酶协同作用， 有效消除或降低因粘度 增加而引起的抗营养作用。在石油及天然气开采 业中， 甘露聚糖酶能够很好的降解。
3、半乳甘露聚糖， 继而增强石油或天然气流动的流速。由于在石油 开采过程中的温度较高 (80 )， 所以高温的甘 露聚糖酶能够很好的发挥作用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 10 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表10页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103525790 A CN 103525790 A 1/1 页 2 1. 一种优化的耐高温甘露聚糖酶 MAN5gy， 其特征在于 ： 其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 3 所示。 2. 根据权利要求 1 所述的耐高温甘露聚糖。
4、酶 MAN5gy， 其特征在于， 所述甘露聚糖酶在 pH3.0 5.5 有较高的酶活性， 在 50 -75之间具有较高的酶活。 3. 根据权利要求 2 所述的耐高温甘露聚糖酶 MAN5gy， 其特征在于， 所述甘露聚糖酶的 最适温度 65， 最适 pH 为 4.0。 4. 权利要求 1 所述的耐高温甘露聚糖酶 MAN5gy 的编码基因 man5gy， 其特征在于， 其核 苷酸序列如 SEQ ID NO.4 所示。 5. 权利要求 1 所述的耐高温甘露聚糖酶 MAN5gy 的优化的编码基因 man5gy， 其特征在 于， 其碱基序列如 SEQ ID NO. 5 所示。 6. 包含权利要求 4 或。
5、 5 所述编码基因 man5gy 的重组载体。 7. 根据权利要求 6 所述的含有编码基因 man5gy 的重组载体， 其特征在于， 所述重组载 体为 pPICZA- man5gy。 8.一种根据权利要求1所述的优化的耐高温甘露聚糖酶MAN5gy的制备方法， 其特征在 于， 包括以下步骤 ： 1) 用含有甘露聚糖酶 MAN5gy 的编码基因 man5gy 的重组载体转化宿主细胞， 得重组菌 株 ； 2) 培养重组菌株， 诱导重组甘露聚糖酶的表达 ； 3) 回收并纯化所表达的耐高温甘露聚糖酶 MAN5gy。 9. 权利要求 1 所述的耐高温甘露聚糖酶 MAN5gy 在制备饲料添加剂中的应用。 1。
6、0. 根据权利要求 9 所述的耐高温甘露聚糖酶 MAN5gy 在制备饲料添加剂中的应用， 其 特征在于所述饲料为玉米 - 豆粕型日粮、 小麦 - 豆粕型日粮、 杂粮杂粕型日粮。 权 利 要 求 书 CN 103525790 A 2 1/6 页 3 一种优化的耐高温甘露聚糖酶 MAN5gy 及其制备方法和应 用 技术领域 0001 本发明属于基因工程与酶工程领域， 具体涉及一种优化的耐高温甘露聚糖酶 MAN5gy 及其制备方法和应用。 背景技术 0002 甘露聚糖和木聚糖是半纤维素中最重要的两种多糖， 在软木和一些特殊组织如果 实和种子中甘露聚糖占据主导地位。甘露聚糖是以 -1,4- 甘露糖甘键。
7、键聚合而成的线 状多糖。依据主链组成的不同可以分为两大类 ： 线状甘露聚糖和葡甘露聚糖。甘露聚糖酶 （EC3.2.1.78） 是一类催化水解 -1,4- 甘露聚糖苷键的内切水解酶， 作用底物比较广泛， 属于半纤维素酶类。 0003 甘露聚糖酶的来源比较广泛， 植物中的甘露聚糖酶存在于种子和果实等储藏器官 中 ； 在一些低等动物如海洋软体动物 ： 滨螺、 亮大蜗牛和淡菜等动物中也发现含有甘露聚 糖酶 ； 微生物来源的甘露聚糖酶最多， 其中细菌、 真菌、 放线菌等都是其主要的来源， 到目前 为止， 发现产甘露聚糖酶的微生物已经近百余种， 它们中绝大多数微生物生活在水环境或 土壤里， 也有一些微生物。
8、分布在反刍动物的瘤胃里。 微生物来源的甘露聚糖酶具有高活性、 方便提取， 且随着微生物工程和基因工程的发展， 甘露聚糖酶在食品、 饲料、 药品、 造纸及石 油和天然气开采等行业中得到了广泛应用。 0004 在饲料行业中， 甘露聚糖酶的添加主要作用是降低食糜粘度， 提高动物对饲料的 利用率等。主要因为 - 甘露聚糖在豆粕等常用的植物蛋白原料中的含量比其它的常用 饲料都高， 作为一种抗营养因子 - 甘露聚糖在动物的消化道内形成凝胶状， 使消化道内 容物具有较强的黏性， 从而影响动物的营养吸收。甘露聚糖酶在饲料行业应用的一个关键 问题需要有较好耐高温特性， 饲料制粒时需要在高温环境下进行， 不耐高温。
9、的甘露聚糖酶 酶的活性将受到较大损失。 目前许多研究者从不同的方面对甘露聚糖酶的耐热性进行了研 究， 如通过筛选产耐热植酸酶的菌株、 运用蛋白质工程等现代分子生物学方法等方法来获 得耐高温甘露聚糖酶， 效果不是很理想。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种通过定点突变得到的优化的耐高温甘露聚糖酶， 其氨基 酸序列如SEQ ID NO. 3所示， 本发明通过定点突变甘露聚糖酶氨基酸序列来提高其热稳定 性， 本发明的另一目的是提供编码上述突变的耐高温甘露聚糖酶的基因和优化后的编码基 因。 0006 本发明还提供了包含上述突变得到耐高温甘露聚糖酶MAN5gy的重组载体， 优选 为pPICZA-。
10、MAN5gy。将突变得到的耐高温甘露聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性 酶切位点之间， 使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优 选的实施方案， 优选为将本发明的甘露聚糖酶基因插入到质粒pPICZA上的EcoR I和Not 说 明 书 CN 103525790 A 3 2/6 页 4 I 限制性酶切位点之间， 得到重组酵母表达质粒pPICZA-MAN5gy。 0007 本发明还提供了包含上述耐高温甘露聚糖酶MAN5gy的重组菌株， 所述菌株为大 肠杆菌、 酵母菌、 芽孢杆菌， 优选为重组菌株pPICZA/man5gy。 0008 本发明还提供了一种制备耐高温甘露聚糖酶。
11、 MAN5gy 的方法， 包括以下步骤 ： 1) 用含有甘露聚糖酶MAN5gy的编码基因man5gy的重组载体转化宿主细胞， 得重组菌 株 ； 2) 培养重组菌株， 诱导重组甘露聚糖酶表达 ； 3) 回收并纯化所表达的甘露聚糖酶 MAN5gy。 0009 本发明的另一目的提供上述耐高温甘露聚糖酶 MAN5gy 在制备饲料添加剂中的应 用。 0010 所述饲料为玉米 - 豆粕型日粮、 小麦 - 豆粕型日粮、 杂粮杂粕型日粮。 0011 与现有技术相比， 本发明的优点和技术效果是 ： 本发明首先所要解决的技术问题 是克服现有技术中的不足， 通过定点突变提供一种具有耐高温特性的、 适合于在饲料、 石。
12、油 及天然气开采工业中应用新的甘露聚糖酶。 0012 本发明通过定点突变黑曲霉甘露聚糖酶氨基酸序列， 来提高甘露聚糖酶的热稳定 性， 并在不改变氨基酸情况下按照毕赤酵母密码子偏好性改造其基因， 以获得甘露聚糖酶 突变体的高效表达。本发明得到了突变后的黑曲霉来源的甘露聚糖酶 MAN5gy， 具有以下性 质 ： 最适温度 65， 50 -75之间仍具有 80% 以上的酶活性， 具有较高的酶活， 具有良好 的热稳定性， 90处理 10 min 还可保持 40% 以上最大酶活力 ； 最适 pH4.0， 并在 pH3.0 5.5 范围内具有 70% 以上的酶活力， 具有很好的宽泛的 pH 稳定性， 37。
13、下作用 1 h 后， 在 pH 2.0 6.5 之间， 最大酶活力几乎不变。 0013 本发明所述甘露聚糖酶耐高温特性较好， 可使其在需求高温环境的工业如饲料 制粒上应用。所述甘露聚糖酶适用于饲料工业， 可与木聚糖酶协同作用， 有效消除或降低 因粘度增加而引起的抗营养作用。在石油及天然气开采业中， 甘露聚糖酶能够很好的降解 半乳甘露聚糖， 继而增强石油或天然气流动的流速。由于在石油开采过程中的温度较高 (80 )， 所以高温的甘露聚糖酶能够很好的发挥作用。 附图说明 0014 图 1 是本发明重组甘露聚糖酶的结构图。 0015 图 2 是本发明重组甘露聚糖酶的蛋白电泳图。 0016 图 3 是。
14、本发明重组甘露聚糖酶的最适温度。 0017 图 4 是本发明重组甘露聚糖酶的热稳定性。 0018 图 5 是本发明重组甘露聚糖酶的最适 pH。 0019 图 6 是本发明重组甘露聚糖酶的 pH 稳定性。 具体实施方式 0020 下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明 以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法， 均参照 分子克隆实验指南 （第 三版） J. 萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行， 或者按照试剂盒和产品说明书进行。 说 明 书 CN 103525790 A 4 3/6 页 5 0021 实施例 1、 黑曲霉甘露聚糖酶蛋白质突变体基因的获得 1、 选择黑曲霉。
15、Aspergillus niger中的甘露聚糖酶氨基酸序列， 如SEQ ID NO. 1所示。 0022 SEQ ID NO. 1 ： mklssslltlaslalanvstalpkaspapstsssaastsfastsglqftidgetgyfagtnsywigfltdna dvdlvmghlkssglkilrvwgfndvtsqpssgtvwyqlhqdgkstintgadglqrldyvvssaeqhdikliinfvny wtdyggmsayvsayggsgetdfytsdtmqsayqtyiktvverysnssavfawelaneprcpscdtsvlynwiektsk fik。
16、gldadrmvcigdegfglnidsdgsypyqfseglnftmnlgidtidfgtlhlypdswgtsddwgngwitahgaac kaagkpclleeygvtsnhcsvegswqktalsttgvgadlfwqygddlstgkspddgntiyygtsdyqclvtdhvaai dsa 其中， 该酶基因编码 383 个氨基酸， N 端 21 个氨基酸为其预测的信号肽序列 “mklssslltlaslalanvsta” 。 0023 编码上述来源于黑曲霉的甘露聚糖酶的基因， 其基因组序列如 SEQ ID NO. 2 所 示。 0024 Atgaagctctccagctc。
17、cctcctcaccctggctagcctggcgctggccaacgtctccacggctctgccg aaagcctcccctgcaccgagcaccagcagcagtgctgcctccacctccttcgccagcacctccggcctccaattcac cattgatggcgaaactggctacttcgccggaacgaacagctactggatcggtttcctcactgacaacgcggacgtcg acctcgtcatgggccacctgaagtcgtccggcctcaagatcctccgcgtgtggggcttcaacgatgtcacctcgcag ccctcctccggca。
18、cagtctggtaccaactgcaccaggacggcaaatcgacaatcaacacgggtgccgacggtctcca gcgcctcgactacgtcgtctcgtctgccgaacagcacgacatcaaactcatcatcaacttcgtcaactactggaccg attacggtggtatgtctgcgtacgtgagcgcgtatggcggatccggcgagacggatttctataccagtgataccatg cagagtgcctatcagacatatatcaagacggtcgtggagcggtacagtaactcctcggcggtgtttgcgtgggagtt g。
19、gcgaatgagccgagatgtccgagttgcgatacttctgtgttgtataactggattgagaagacgagtaagtttatta aggggttggatgcggatcgtatggtttgtattggtgatgagggcttcggtctcaacatcgactcggacggcagctac ccttatcaattctccgagggcttgaactttacgatgaacctcggtatcgatactattgactttggtaccctccactt gtaccctgatagctggggcacctccgacgactggggcaacggctggatcaccgcccacggcgcagcc。
20、tgcaaagcgg ccggcaagccatgtctcctggaggaatacggagtcacctcgaaccactgcagtgtggagggctcgtggcagaagaca gcgctcagcacaacgggcgtcggcgcggatctgttctggcagtatggtgatgatttgagtaccgggaagtcgccgga tgatgggaatactatctactatgggactagtgattatcagtgcctggtgacggatcatgttgctgctattgatagcg cctaa。 0025 2、 对甘露聚糖酶氨基酸序列进行定点突变 通过中温蛋白和嗜热蛋白的氨基酸组成对比分析，。
21、 发现不同的氨基酸对于蛋白的热稳 定性贡献是不同的。蛋白的热稳定性与其氨基酸的组成相关， 在耐热蛋白里甘氨酸往往更 容易被丙氨酸取代， 赖氨酸容易被精氨酸取代。 对于亮氨酸、 丙氨酸等脂肪族氨基酸残基来 说， 它们主要是通过分子间的疏水作用力来使得蛋白质内部的构象稳定 ； 而精氨酸和脯氨 酸在耐热蛋白中出现频率较高， 可能是由于精氨酸参与了盐桥的形成， 增大了分子间的作 用力， 稳定蛋白空间结构， 脯氨酸一方面参与了转角的形成， 高含量则可加强蛋白的刚性结 构， 另一方面其熵值在所有氨基酸中最低， 蛋白熵值越低越稳定。因此在不影响蛋白活性 的基础上， 通过定向突变技术， 将甘露聚糖酶部分氨基酸。
22、突变为脯氨酸、 精氨酸和丙氨酸， 能有效提高甘露聚糖酶的热稳定性。脯氨酸易形成 折叠， 从而使蛋白构象更稳定牢固， 说 明 书 CN 103525790 A 5 4/6 页 6 精氨酸侧链较大， 所提供的疏水作用及离子间互相作用能提高蛋白质的稳定性， 丙氨酸可 提高分子间的疏水作用力。因此本发明在甘露聚糖酶成熟蛋白氨基酸序列中的第 51 位的 丙氨酸 （A） 突变成脯氨酸 （P） ， 第 146 位甘氨酸 （G） 和第 306 位丝氨酸 （S） 改为丙氨酸 （A） ， 第 333 位赖氨酸 （K） 变成精氨酸 （R） ， 由获得的氨基酸序列根据毕赤酵母密码子偏好性， 将 其碱基序列进行密码子改。
23、造， 后经毕赤酵母表达获得耐高温、 高表达量的甘露聚糖酶。 突变 后的甘露聚糖酶氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示， 其编码基因序列如SEQ ID NO. 3所示。 突变后甘露聚糖酶的三维结构图如图 1 所示。 0026 SEQ ID NO. 3 lpkaspapstsssaastsfastsglqftidgetgyfagtnsywigfltdnpdvdlvmghlkssglkilrvwg fndvtsqpssgtvwyqlhqdgkstintgadglqrldyvvssaeqhdikliinfvnywtdyggmsayvsayggsaetd fytsdtmqsayqtyiktvvery。
24、snssavfawelaneprcpscdtsvlynwiektskfikgldadrmvcigdegfgln idsdgsypyqfseglnftmnlgidtidfgtlhlypdswgtsddwgngwitahgaackaagkpclleeygvtsnhcsv egawqktalsttgvgadlfwqygddlstgrspddgntiyygtsdyqclvtdhvaaidsa 所述突变后的甘露聚糖酶 MAN5gy 的编码基因序列如 SEQ ID NO. 4 所示。 0027 SEQ ID NO. 4 ctgccgaaagcctcccctgcaccgagcaccagcagcagtgctg。
25、cctccacctccttcgccagcacctccggc ctccaattcaccattgatggcgaaactggctacttcgccggaacgaacagctactggatcggtttcctcactgacaa cccagacgtcgacctcgtcatgggccacctgaagtcgtccggcctcaagatcctccgcgtgtggggcttcaacgatg tcacctcgcagccctcctccggcacagtctggtaccaactgcaccaggacggcaaatcgacaatcaacacgggtgcc gacggtctccagcgcctcgactacgtcgtctcgtct。
26、gccgaacagcacgacatcaaactcatcatcaacttcgtcaa ctactggaccgattacggtggtatgtctgcgtacgtgagcgcgtatggcggatccgctgagacggatttctatacca gtgataccatgcagagtgcctatcagacatatatcaagacggtcgtggagcggtacagtaactcctcggcggtgttt gcgtgggagttggcgaatgagccgagatgtccgagttgcgatacttctgtgttgtataactggattgagaagacgag taagtttattaaggggttggatgc。
27、ggatcgtatggtttgtattggtgatgagggcttcggtctcaacatcgactcgg acggcagctacccttatcaattctccgagggcttgaactttacgatgaacctcggtatcgatactattgactttggt accctccacttgtaccctgatagctggggcacctccgacgactggggcaacggctggatcaccgcccacggcgcagc ctgcaaagcggccggcaagccatgtctcctggaggaatacggagtcacctcgaaccactgcagtgtggagggcgctt ggcagaagacag。
28、cgctcagcacaacgggcgtcggcgcggatctgttctggcagtatggtgatgatttgagtaccggg agatcgccggatgatgggaatactatctactatgggactagtgattatcagtgcctggtgacggatcatgttgctgc tattgatagcgcctaa 在不改变氨基酸情况下按照毕赤酵母密码子偏好性改造其基因， 以获得甘露聚糖酶突 变体的高效表达， 具体地该基因序列如 SEQ ID NO. 5 所示， 可编码产生定点突变的甘露聚 糖酶。 0028 SEQ ID NO. 5 Cttcccaaagcatctcccgcgccctcaa。
29、cttcatcatcagctgcatctacttctttcgcatcaacttctggg ctgcaattcactatcgacggggaaaccgggtacttcgcagggacaaactcatactggattggtttcctgaccgataa cccagatgttgatctggttatggggcaccttaagagttctgggctgaagattctgcgagtatgggggttcaacgacg ttactagtcagccgtcttctgggacggtttggtaccaacttcaccaggatgggaaaagtacgattaacacaggtgca gatggtctgcagcgactggat。
30、tacgttgttagttccgcagaacagcacgatattaaactgattattaacttcgttaa 说 明 书 CN 103525790 A 6 5/6 页 7 ctactggactgactacggtggtatgtccgcatacgtatcagcatatggggggtctgctgagacagacttctatactt cagacactatgcagtcagcatatcagacgtatattaagacagttgtagagcgatactcaaactctagtgcagtattt gcatgggagttggcaaatgagcccagatgtccctcatgcgacacctccgtattgta。
31、taactggatcgagaagacatc aaagtttatcaagggattggacgcagaccgaatggtctgtatcggtgacgaggggttcggtctgaacattgatagtg atgggtcatacccctatcaattctctgaggggttgaactttacaatgaacctgggtattgacaccatcgattttggt actctgcacttgtaccccgactcatgggggacttctgatgattgggggaacgggtggattactgcacacggggcggc atgcaaagcagcagggaagccatgtctgcttgaggaatacgggg。
32、ttactagtaaccactgctcagtagagggggctt ggcagaagacggcactgtcaacgacaggggttggggcagaccttttctggcagtatggtgacgacttgtcaactgga agaagtcccgacgacggaaataccatttactatggaacctcagactatcagtgccttgtaacagaccatgtcgctgc tatcgactcagcataa。 0029 3、 将获得的甘露聚糖酶序列送生物公司合成， 合成好的甘露聚糖酶基因克隆到 DH5 载体上。 0030 实施例 2 黑曲霉甘露聚糖酶工程菌的构建 所采用的酵母表达载体为 pP。
33、ICZA， 构建载体的宿主细胞是大肠杆菌 DH5。根据合 成的甘露聚糖酶基因序列设计带有酶切位点的表达引物 ： 上游表达引物 5 -GGGGAATTCctgccgaaagcctcccctgc-3 （SEQ ID No:6） 下游表达引物 5 -GGGGCGGCCGCTTAGGCGCTATCAATAGCAGC-3 （SEQ ID No:7） 对克隆质粒进行 PCR 扩增， 待得到全长甘露聚糖酶基因时， 将其进行双酶切 (EcoR I+NotI)， 同时将表达载体 pPICZA 进行双酶切 (EcoR I+NotI)， 纯化回收酶切产物后， 将 两者用 T4DNA 连接酶在 16 下过夜连接， 连。
34、接产物转化进 DH5 感受态细胞中， 获得重组 表达质粒pPICZA-MAN5gy。 进行阳性验证后， 提取表达质粒进行线性化， 线性化体系如下 ： 表达质粒 80 L、 10*H 缓冲液 20 L、 Bgl II 5L 补水至 200 L， 4 下酶切过夜， 酶 切完全后进行胶回收纯化， 电转至酵母 X-33 进行培养， 筛选出活力较高的单克隆菌株。 0031 其中， 本发明所述宿主细胞可以选择毕赤酵母细胞、 啤酒酵母细胞或多型逊酵母 细胞， 本实施例优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞 (Pichia pastoris)X-33， 得到 重组菌株X-33/ man5gy。 0032 实施。
35、例 3 重组甘露聚糖酶的诱导表达 将筛选到活力较高的单克隆菌株， 接种于30 mL BMGY培养液中， 30 200 rpm振荡培 养至 OD 值为 2-4 时， 约 1d， 接种于含有 400 mLBMGY 的 1 L 摇瓶进行震荡培养， 48h 后， 离心 收集菌体。然后于 200mL BMMY 培养基重悬， 30 200 rpm 振荡培养。甲醇诱导 72h 后， 离 心收集上清酶液。进行 SDS-PAGE 蛋白电泳检测， 目的蛋白条带如图 2 所示。取部分上清酶 液稀释到适宜的倍数， 测定甘露聚糖酶的活力。 0033 实施例 4 重组甘露聚糖酶的活性分析 酶活单位 （IU） ： 在 pH。
36、 为 5.5， 温度为 50条件下， 每分钟从浓度为 3mg/mL 的甘露聚糖 溶液中降解释放 1mol 甘露糖所需酶量定义为一个酶活单位。 0034 甘露聚糖酶活性的测定 ： 吸取 2mL 经过适当稀释的酶液， 加入到刻度试管中， 再加 入 2mL 甘露聚糖溶液， 震荡 3s， 50下温育 30min。加入 5mLDNS 试剂， 震荡均匀， 沸水浴加 热 5min， 冷却至室温， 加水定容到 25mL， 在 540nm 处测定吸光度。 0035 实施例 5 重组甘露聚糖酶的性质测定 说 明 书 CN 103525790 A 7 6/6 页 8 1、 重组甘露聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法。
37、如下 ： 阿拉伯呋喃糖苷酶的最适温度的测定为在乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.0)体系及不同温 度下 (37、 40、 45、 50、 60、 65、 70、 75、 80 ) 进行酶促反应。高温耐受性测 定为称取 0.5g 固体酶和 4.5g 淀粉混合后放到盖盖的称量瓶中， 分别在温度为 50、 60、 70、 80、 85、 90气浴中保温 5min 和 10min 后， 进行酶促反应， 对照室温下进行。酶反 应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为65。 高温耐受性试验表明(图4)， MAN5gy 有良好的稳定性， 50 -75之间仍具有 80% 以上的酶活性， 具有较高的酶活， 具有良好。
38、的 热稳定性， 90处理 10 min 还可保持 40% 以上最大酶活力。 0036 2、 重组甘露聚糖酶的最适 pH 和 pH 稳定性的测定方法如下 ： 将纯化的甘露聚糖酶用不同的 pH 值 (2.5、 3.0、 3.5、 4.0、 4.5、 5.0、 5.5、 6.0、 6.5、 7.0) 的乙酸 - 乙酸钠 ( 浓度为 0.2 M) 缓冲液稀释， 并用以上 pH 值的缓冲溶液配制甘露聚糖酶 的底物进行酶促反应以测定其最适 pH。吸取酶液 0.5mL（液体直接取酶液， 固体酶则称取 固体原酶粉 1.00 g 溶于 80mL 蒸馏水中 ； 室温下磁力搅拌 10min 后用 100mL 容量瓶。
39、定容， 离 心后取上清液， 待用） ， 各自加入 4.5mL 的 pH 2.5、 pH 3.0、 pH 3.5、 pH 4.0、 pH 4.5、 pH 5.0、 pH 5.5、 pH 6.0、 pH 6.5、 pH 7.0 乙酸 - 乙酸钠缓冲液 （0.2M） ， 37条件下处理一个小时 （注 意密闭） 处理完后， 稀释成合适的待测酶液， 以没有处理的原酶液在 37条件下处理一小时 为对照， 计算处理一小时后剩余酶活。结果 ( 图 5) 表明， 重组甘露聚糖酶的最适 pH 为 4.0， 在 pH3.05.5 之间有 70% 以上的相对酶活性。pH 耐受性显示结果 ( 图 6) 酶在 pH2.0。
40、-6.5 之间均很稳定， 在此pH范围内处理1h后剩余酶活性在95%以上， 说明此该酶具有较好的pH 稳定性。 0037 3、 重组甘露聚糖酶对豆粕型饲料的体外酶解 通过体外模拟禽类的消化系统， 进行了甘露聚糖酶对豆粕型饲料的酶解的应用试验。 具体步骤 ： 称取 2.0g 豆粕， 放入 100 mL 三角瓶内， 加入相应的酶。加入 10ml pH5.26 的 PBS 溶液， 加入 1M 盐酸溶液， 调节 pH 到 5.26。将食糜混合均匀后， 放入 41的恒温震荡水 浴锅内， 消化 60 min。待初步消化完毕后加入 10mL pH 为 2.7 的稀盐酸溶液， 加入 1.75mL 1M 盐酸溶。
41、液将食糜调到 pH 为 3.18， 封口， 混匀后继续消化 60min。加入 10M 氢氧化钠溶液 0.4 mL， 使食糜pH调至7.0， 加入30 mL pH为6.8的磷酸盐缓冲液， 41恒温震荡水浴消化 240min。消化完毕后取出放置 4冰箱静止过夜。 0038 取静置后的上清液测还原糖含量 ； 将剩余食糜抽滤测干物质损失率。通过测定发 现重组甘露聚糖酶可以有效的酶解豆粕型饲料。 说 明 书 CN 103525790 A 8 1/10 页 9 SEQUENCE LISTING 青岛根源生物技术集团有限公司 一种优化的耐高温甘露聚糖酶 MAN5gy 及其制备方法和应用 7 PatentIn。
42、 version 3.3 1 383 PRT Aspergillus niger 1 Met Lys Leu Ser Ser Ser Leu Leu Thr Leu Ala Ser Leu Ala Leu Ala 1 5 10 15 Asn Val Ser Thr Ala Leu Pro Lys Ala Ser Pro Ala Pro Ser Thr Ser 20 25 30 Ser Ser Ala Ala Ser Thr Ser Phe Ala Ser Thr Ser Gly Leu Gln Phe 35 40 45 Thr Ile Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Phe A。
43、la Gly Thr Asn Ser Tyr Trp 50 55 60 Ile Gly Phe Leu Thr Asp Asn Ala Asp Val Asp Leu Val Met Gly His 65 70 75 80 Leu Lys Ser Ser Gly Leu Lys Ile Leu Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp 85 90 95 序 列 表 CN 103525790 A 9 2/10 页 10 Val Thr Ser Gln Pro Ser Ser Gly Thr Val Trp Tyr Gln Leu His Gln 100 105 110 Asp Gl。
44、y Lys Ser Thr Ile Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gln Arg Leu 115 120 125 Asp Tyr Val Val Ser Ser Ala Glu Gln His Asp Ile Lys Leu Ile Ile 130 135 140 Asn Phe Val Asn Tyr Trp Thr Asp Tyr Gly Gly Met Ser Ala Tyr Val 145 150 155 160 Ser Ala Tyr Gly Gly Ser Gly Glu Thr Asp Phe Tyr Thr Ser Asp Thr 165 170 17。
45、5 Met Gln Ser Ala Tyr Gln Thr Tyr Ile Lys Thr Val Val Glu Arg Tyr 180 185 190 Ser Asn Ser Ser Ala Val Phe Ala Trp Glu Leu Ala Asn Glu Pro Arg 195 200 205 Cys Pro Ser Cys Asp Thr Ser Val Leu Tyr Asn Trp Ile Glu Lys Thr 210 215 220 Ser Lys Phe Ile Lys Gly Leu Asp Ala Asp Arg Met Val Cys Ile Gly 225 23。
46、0 235 240 Asp Glu Gly Phe Gly Leu Asn Ile Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Tyr 245 250 255 序 列 表 CN 103525790 A 10 3/10 页 11 Gln Phe Ser Glu Gly Leu Asn Phe Thr Met Asn Leu Gly Ile Asp Thr 260 265 270 Ile Asp Phe Gly Thr Leu His Leu Tyr Pro Asp Ser Trp Gly Thr Ser 275 280 285 Asp Asp Trp Gly Asn Gly Trp 。
47、Ile Thr Ala His Gly Ala Ala Cys Lys 290 295 300 Ala Ala Gly Lys Pro Cys Leu Leu Glu Glu Tyr Gly Val Thr Ser Asn 305 310 315 320 His Cys Ser Val Glu Gly Ser Trp Gln Lys Thr Ala Leu Ser Thr Thr 325 330 335 Gly Val Gly Ala Asp Leu Phe Trp Gln Tyr Gly Asp Asp Leu Ser Thr 340 345 350 Gly Lys Ser Pro Asp Asp Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Gly Thr Ser Asp 355 360 365 Tyr Gln Cys Leu Val Thr Asp His Val Ala Ala Ile Asp Ser Ala 370 375 380 2 1152 DNA Aspergillus nige。