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1、(10)申请公布号 CN 103525833 A (43)申请公布日 2014.01.22 CN 103525833 A (21)申请号 201310525013.6 (22)申请日 2013.10.30 C12N 15/31(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院农产品加工研究所 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路 2 号 (72)发明人 戴小枫 陈捷胤 李蕾 马雪峰 徐明 孔志强 包郁明 肖红利 桂月晶 (74)专利代理机构 北京英创嘉友知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 ) 11447 代理人。
2、 王浩然 桑传标 (54) 发明名称 一种基因以及鉴定大丽轮枝菌致病型的方法 和试剂盒 (57) 摘要 本发明提供了一种高致病性大丽轮枝菌 (Verticillium dahliae)基因， 其中， 该基因具有 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列。本发明还提供 了一种鉴定大丽轮枝菌致病型的方法， 该方法包 括以下步骤 ：（1） 制备含有大丽轮枝菌的全基因 组 DNA 的待测样本 ；（2） 以步骤 （1） 中得到的全基 因组 DNA 待测样本为模板进行 PCR 扩增， 检测扩 增产物中是否存在 SEQ ID No.4 所示的核苷酸序 列 ；（3） 根据步骤 （2） 的检测结果判断大丽轮。
3、枝菌 菌株的致病型。本发明还提供了一种试剂盒。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表5页 (10)申请公布号 CN 103525833 A CN 103525833 A 1/1 页 2 1. 一种高致病性大丽轮枝菌 (Verticillium dahliae) 基因， 其特征在于， 该基因具有 SEQ ID No ： 1 所示的核苷酸序列。 2. 一种鉴定大丽轮枝菌致病型的方法， 该方法包括以下步骤 ： （1） 制备含有大丽轮枝菌的全基因组 DNA 的待测样本 。
4、； （2） 以步骤 （1） 中得到的全基因组 DNA 待测样本为模板进行 PCR 扩增， 检测扩增产物中 是否存在 SEQ ID No.4 所示的核苷酸序列 ； （3） 根据步骤 （2） 的检测结果判断大丽轮枝菌菌株的致病型， 在所述扩增产物中不存在 SEQ ID No.4 所示的核苷酸序列的情况下， 则指示所述大丽轮枝菌的菌株不属于高致病型 ； 在所述扩增产物中存在具有 SEQ ID NO ： 4 所示的核苷酸序列的情况下， 则指示该大丽轮枝 菌的菌株属于高致病型。 3. 根据权利要求 2 所述的方法， 其中， 所述步骤 （2） PCR 扩增所用的引物包括如 SEQ ID NO ： 2 所示。
5、的正向引物和如 SEQ ID NO ： 3 所示的反向引物。 4. 一种试剂盒， 所述试剂盒含有根据权利要求 3 中的引物和 PCR 试剂。 权 利 要 求 书 CN 103525833 A 2 1/4 页 3 一种基因以及鉴定大丽轮枝菌致病型的方法和试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及农作物病害防治领域， 具体地， 涉及一种高致病性大丽轮枝菌 (Verticillium dahliae) 基因、 一种鉴定大丽轮枝菌致病型的方法和试剂盒。 背景技术 0002 大丽轮枝菌 (Verticillium dahliae) 是一种植物致病真菌， 它可以导致植物 （特 别是棉花） 发生黄萎病。但是， 。
6、不同致病型的大丽轮枝菌菌株的致病表现差别很大， 例如某 些高致病型的菌株感染棉花后会导致棉花的严重病害而引起农田产量的下降， 而某些低致 病型的菌株感染棉花后仅导致棉花的轻微病害且对农田产量影响较小。此外， 大丽轮枝菌 的致病型还表现出一定的潜伏性， 即高致病型菌株在感染当年可能不致病， 而在次年大范 围地严重致病。 0003 如果能够检测出农田中大丽轮枝菌的主要菌株类型， 并对其致病型作出准确的判 断， 就可以结合药物防治和轮作等农业手段抑制病害的发生， 从而增加经济效益和社会效 益。 发明内容 0004 本发明的目的是解决如何准确判断大丽轮枝菌菌株的致病型的技术问题， 提供一 种高致病性大。
7、丽轮枝菌(Verticillium dahliae)基因、 一种鉴定大丽轮枝菌致病型的方法 和试剂盒。 0005 SEQ ID NO ： 1所示的核苷酸序列为本发明人发现的在高致病型的大丽轮枝菌菌株 的基因组序列中出现而在低致病型的大丽轮枝菌的基因组序列中不出现的序列。因而， 对 于某一致病型待测的大丽轮枝菌菌株， 只要鉴定该大丽轮枝菌菌株的基因组的序列中是否 存在 SEQ ID NO ： 1 所示的序列， 即可获知该大丽轮枝菌菌株是否为高致病型大丽轮枝菌。 具体地， 如果鉴定出该大丽轮枝菌菌株的基因组的序列中不存在SEQ ID NO ： 1所示的序列， 则判断该大丽轮枝菌菌株不属于高致病型 。
8、； 如果鉴定出该大丽轮枝菌菌株的基因组的序列 中存在SEQ ID NO ： 1所示的序列， 则判断该大丽轮枝菌菌株属于高致病型。 并且， 如果以该 大丽轮枝菌菌株的全基因组DNA待测样本为模板进行PCR扩增的产物中不存在SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列， 就能够充分证明该大丽轮枝菌菌株的基因组的序列中不存在 SEQ ID NO ： 1 所示的序列。由此， 本发明的发明人得到了本发明的技术方案。 0006 为了实现上述目的， 一方面， 本发明提供一种高致病性大丽轮枝菌 (Verticillium dahliae) 基因， 其中， 该基因具有 SEQ ID No ： 1 所示的核苷酸序。
9、列。 0007 另一方面， 本发明还提供了一种鉴定大丽轮枝菌致病型的方法， 该方法包括以下 步骤 ： 0008 （1） 制备含有大丽轮枝菌的全基因组 DNA 的待测样本 ； 0009 （2） 以步骤 （1） 中得到的全基因组 DNA 待测样本为模板进行 PCR 扩增， 检测扩增产 物中是否存在 SEQ ID No.4 所示的核苷酸序列 ； 说 明 书 CN 103525833 A 3 2/4 页 4 0010 （3） 根据步骤 （2） 的检测结果判断大丽轮枝菌菌株的致病型， 在所述扩增产物中不 存在 SEQ ID No.4 所示的核苷酸序列的情况下， 则指示所述大丽轮枝菌的菌株不属于高致 病型。
10、 ； 在所述扩增产物中存在具有 SEQ ID NO ： 4 所示的核苷酸序列的情况下， 则指示该大 丽轮枝菌的菌株属于高致病型。 0011 另一方面， 本发明还提供了一种试剂盒， 所述试剂盒含有本发明提供的引物和 PCR 试剂。 0012 本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。 具体实施方式 0013 以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是， 此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明， 并不用于限制本发明。 0014 本发明提供一种高致病性大丽轮枝菌 (Verticillium dahliae) 基因， 其中， 该基 因具有 SEQ ID No ：。
11、 1 所示的核苷酸序列核酸。 0015 本发明还提供了一种鉴定大丽轮枝菌致病型的方法， 该方法包括以下步骤 ： 0016 （1） 制备含有大丽轮枝菌的全基因组 DNA 的待测样本 ； 0017 （2） 以步骤 （1） 中得到的全基因组 DNA 待测样本为模板进行 PCR 扩增， 检测扩增产 物中是否存在 SEQ ID No.4 所示的核苷酸序列 ； 0018 （3） 根据步骤 （2） 的检测结果判断大丽轮枝菌菌株的致病型， 在所述扩增产物中不 存在 SEQ ID No.4 所示的核苷酸序列的情况下， 则指示所述大丽轮枝菌的菌株不属于高致 病型 ； 在所述扩增产物中存在具有 SEQ ID NO 。
12、： 4 所示的核苷酸序列的情况下， 则指示该大 丽轮枝菌的菌株属于高致病型。 0019 其中， SEQ ID NO ： 4所示的核酸是SEQ ID NO ： 1所示的核酸的一个片段， 它能够通 过上述引物对以 SEQ ID NO ： 1 所示的核酸为模板而 PCR 扩增得到。 0020 其中， 制备待测样本的步骤可以按照本领域常规的制备用于检测核酸的样本的方 法进行， 本发明没有特别的要求， 例如可以从棉花植株上采集组织， 并且将采集的组织在含 有抗性的培养基上培养， 并且筛选、 辨别和分离大丽轮枝菌的菌落， 然后按照 （ 植物基因工 程 （何光源著， 科学出版社， 2007 年出版） ） 中。
13、所述的方法提取大丽轮枝菌的基因组 DNA， 即 可制备得到待测样本。 0021 其中， 检测扩增产物中是否存在 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列的方法可以按照 本领域常规的方法和标准进行， 例如可以通过琼脂糖凝胶电泳进行检测， 如果需要还可以 通过对电泳得到的目的条带进行回收测序来进一步判断。 0022 所述扩增中用到的引物可以根据 SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列的特征 及引物设计的规则来设计， 优选情况下， 所述引物的包括如 SEQ ID NO ： 2 所示的正 向 引 物 （F ： 5TCCTTGCTTGTATTTTGAGCA3）和 如 SEQ ID NO ： 3 所。
14、 示 的 反 向 引 物 （R ： 5ACATCGAATCCATCTTGGTTG3） 。 0023 另一方面， 本发明还提供了一种试剂盒， 所述试剂盒含有引物和 PCR 试剂， 其中， 所述引物包括如 SEQ ID NO ： 2 所示的正向引物 （F ： 5TCCTTGCTTGTATTTTGAGCA3） 和如 SEQ ID NO ： 3 所示的反向引物 （R ： 5ACATCGAATCCATCTTGGTTG3） 。 0024 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中， 各种大丽轮枝菌的菌 说 明 书 CN 103525833 A 4 3/4 页 5 株属于经过合法渠道获得的遗传资源。。
15、 0025 实施例 1 0026 本实施例用于说明待测样本的制备。具体地， 是从 80 个不同的大丽轮枝菌菌株 （编号为 VDG1 至 VDG80） 的基因组 DNA 的制备。 0027 切取棉花植株离地表约 10-35cm 处的茎， 切成 1mm3左右大小的小块， 接种在在含 有抗生素 （氨苄青霉素、 利福平和链霉素， 浓度均为 100g/ml） 的 PDA 培养基 （含有马铃薯 200g/L， 葡萄糖20g/L， 琼脂20g/L） 上， 25下培养7天， 根据大丽轮枝菌的标准菌落形态鉴 别大丽轮枝菌的菌落。得到鉴别的大丽轮枝菌的菌落即作为大丽轮枝菌菌株样品。 0028 按照上述方法， 从8。
16、0个不同的棉花植株中取得80个不同的大丽轮枝菌菌株， 将上 述 80 个不同的大丽轮枝菌菌株按照 植物基因工程（何光源著， 科学出版社， 2007 年出版） 中所述的方法， 分别提取基因组 DNA 样本， 得到待测样本 1-80。 0029 实施例 2 0030 本实施例用于说明上述 80 个不同的大丽轮枝菌菌株的致病型的检测结果。 0031 参照文献 （张兴华， 棉花抗枯、 黄萎病研究进展及其抗性鉴定方法， 江西农业学报， 2008,20(3):43-49） 中的人工苗床病圃法， 对实施例 1 中所述的 80 个不同的大丽轮枝菌菌 株进行棉花苗期致病型鉴定。以所述的 80 个不同的大丽轮枝菌。
17、菌株在接种健康棉花植株 后的病情指数来表征致病型的高低。 0032 具体地， 将大丽轮枝菌在查比克培养基 （2g/L 的 NaNO3， 1g/L 的 K2HPO4， 0.5g/L 的 KCl， 0.5g/L 的 MgSO4， 0.01g/L 的 FeSO4， 30g/L 的蔗糖， 20g/L 的琼脂） 上培养至产生孢子， 用 无菌水洗下孢子得到孢子悬液， 并将孢子悬液中的孢子浓度调整至 1107个 /ml。然后， 在 同一品种的棉花 15 日龄幼苗的下胚轴处， 使用 1ml 规格的无菌注射器接种上述孢子悬液， 每株接种量为 100l， 接种后 10 天和 15 天分两次统计发病情况， 计算病情。
18、指数。 0033 本实施例检测得到了上述 80 个不同的大丽轮枝菌菌株的致病型， 通过上述鉴别 标准， 鉴定出其中 61 个大丽轮枝菌菌株的病情指数均高于 35， 属于高致病型， 而另外 19 个 大丽轮枝菌菌株的病情指数均低于 20， 不属于高致病型。 0034 上述 61 个属于高致病型的大丽轮枝菌菌株分别为 ： VDG3、 VDG63、 VDG61、 VDG18、 VDG35、 VDG32、 VDG73、 VDG31、 VDG33、 VDG26、 VDG55、 VDG23、 VDG57、 VDG36、 VDG11、 VDG67、 VDG47、 VDG5、 VDG29、 VDG59、 VD。
19、G49、 VDG44、 VDG21、 VDG48、 VDG8、 VDG50、 VDG25、 VDG43、 VDG37、 VDG46、 VDG16、 VDG4、 VDG68、 VDG6、 VDG52、 VDG34、 VDG7、 VDG45、 VDG12、 VDG76、 VDG27、 VDG10、 VDG41、 VDG64、 VDG17、 VDG54、 VDG39、 VDG75、 VDG20、 VDG13、 VDG22、 VDG38、 VDG19、 VDG28、 VDG14、 VDG9、 VDG53、 VDG15、 VDG42、 VDG40 和 VDG1。上述 19 个不属于高致病型的大丽轮枝 菌。
20、菌株分别为 ： VDG70、 VDG69、 VDG71、 VDG24、 VDG79、 VDG65、 VDG56、 VDG77、 VDG74、 VDG30、 VDG80、 VDG60、 VDG2、 VDG58、 VDG66、 VDG62、 VDG72、 VDG80 和 VDG51。 0035 实施例 3 0036 按照 Illumina 公司的测序仪 Genome Analyzer 的说明书 （Solexa 技术） 中规定的 方法， 测定大丽轮枝菌菌株 （编号为 VDG1 以及 VDG2） 的全基因组序列。 0037 本实施例得到了上述 2 个不同的大丽轮枝菌菌株的全基因组序列， 通过序列比 对。
21、， 鉴定出VDG1的全基因组序列中不含有SEQ ID NO ： 1所示的序列 ； 而VDG2的全基因组序 列中含有 SEQ ID NO ： 1 所示的序列。 说 明 书 CN 103525833 A 5 4/4 页 6 0038 通过上述相同的方法， 鉴定出上述 80 个不同的大丽轮枝菌菌株中的 61 个 （分别 为 VDG3、 VDG63、 VDG61、 VDG18、 VDG35、 VDG32、 VDG73、 VDG31、 VDG33、 VDG26、 VDG55、 VDG23、 VDG57、 VDG36、 VDG11、 VDG67、 VDG47、 VDG5、 VDG29、 VDG59、 VD。
22、G49、 VDG44、 VDG21、 VDG48、 VDG8、 VDG50、 VDG25、 VDG43、 VDG37、 VDG46、 VDG16、 VDG4、 VDG68、 VDG6、 VDG52、 VDG34、 VDG7、 VDG45、 VDG12、 VDG76、 VDG27、 VDG10、 VDG41、 VDG64、 VDG17、 VDG54、 VDG39、 VDG75、 VDG20、 VDG13、 VDG22、 VDG38、 VDG19、 VDG28、 VDG14、 VDG9、 VDG53、 VDG15、 VDG42、 VDG40 和 VDG1） 的基因组的 序列中均含有SEQ ID N。
23、O ： 1所示的序列 ； 并且， 另外的19个大丽轮枝菌菌株 （分别为VDG70、 VDG69、 VDG71、 VDG24、 VDG79、 VDG65、 VDG56、 VDG77、 VDG74、 VDG30、 VDG80、 VDG60、 VDG2、 VDG58、 VDG66、 VDG62、 VDG72、 VDG80 和 VDG51） 的全基因组序列中不含有 SEQ ID NO ： 1 所示的序列。 0039 根据实施例 2 和实施例 3 的结果可以确定， 如果鉴定出大丽轮枝菌菌株的基因组 的序列中存在 SEQ ID NO ： 1 所示的序列， 则该大丽轮枝菌菌株属于高致病型 ； 如果鉴定出 大。
24、丽轮枝菌菌株的基因组的序列中不存在 SEQ ID NO ： 1 所示的序列， 则该大丽轮枝菌菌株 不属于高致病型。 0040 实施例 4 0041 以实施例 1 中分别制得的检测样本 DNA 作为模板进行 PCR 扩增， 引物包括如 SEQ ID NO ： 2 所示的正向引物 （F ： 5TCCTTGCTTGTATTTTGAGCA3） 和如 SEQ ID NO ： 3 所示的反向 引物 （R ： 5ACATCGAATCCATCTTGGTTG3） 。 0042 具体的扩增条件包括 ： 94， 10分钟 ；（94， 30秒， 54， 45秒， 72， 1分钟30秒） 35 个循环 ； 72， 10。
25、 分钟， 将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。 0043 检测结果说明 ： 上述 80 个不同的大丽轮枝菌菌株中的 61 个 （分别为 VDG3、 VDG63、 VDG61、 VDG18、 VDG35、 VDG32、 VDG73、 VDG31、 VDG33、 VDG26、 VDG55、 VDG23、 VDG57、 VDG36、 VDG11、 VDG67、 VDG47、 VDG5、 VDG29、 VDG59、 VDG49、 VDG44、 VDG21、 VDG48、 VDG8、 VDG50、 VDG25、 VDG43、 VDG37、 VDG46、 VDG16、 VDG4、 VDG68、 VDG6、 。
26、VDG52、 VDG34、 VDG7、 VDG45、 VDG12、 VDG76、 VDG27、 VDG10、 VDG41、 VDG64、 VDG17、 VDG54、 VDG39、 VDG75、 VDG20、 VDG13、 VDG22、 VDG38、 VDG19、 VDG28、 VDG14、 VDG9、 VDG53、 VDG15、 VDG42、 VDG40 和 VDG1） 的基因组的序列中均存 在 SEQ ID NO ： 4 所示的序列 ； 证明这些大丽轮枝菌菌株均存在具有 SEQ ID NO ： 1 所示的序 列的核酸， 据此判断这些大丽轮枝菌菌株属于高致病型。并且， 另外的 19 个大丽轮枝。
27、菌菌 株 （分别为 VDG70、 VDG69、 VDG71、 VDG24、 VDG79、 VDG65、 VDG56、 VDG77、 VDG74、 VDG30、 VDG80、 VDG60、 VDG2、 VDG58、 VDG66、 VDG62、 VDG72、 VDG80 和 VDG51） 的基因组的序列中不存在所述 SEQ ID NO ： 4 所示的序列 ； 证明这些大丽轮枝菌菌株均不存在具有 SEQ ID NO ： 1 所示的序 列的核酸， 据此判断这些大丽轮枝菌菌株不属于高致病型。 0044 根据实施例 2 和实施例 4 的结果可以确定， 如果鉴定出大丽轮枝菌菌株的基因组 的序列中不存在 SE。
28、Q ID NO ： 1 所示的核苷酸序列， 则该大丽轮枝菌菌株不属于高致病型 ； 如果鉴定出大丽轮枝菌菌株的基因组的序列中存在 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列， 则该 大丽轮枝菌菌株属于高致病型。 说 明 书 CN 103525833 A 6 1/5 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 103525833 A 7 2/5 页 8 0003 序 列 表 CN 103525833 A 8 3/5 页 9 0004 序 列 表 CN 103525833 A 9 4/5 页 10 0005 序 列 表 CN 103525833 A 10 5/5 页 11 序 列 表 CN 103525833 A 11 。