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1、(10)申请公布号 CN 103525754 A (43)申请公布日 2014.01.22 CN 103525754 A (21)申请号 201310472471.8 (22)申请日 2013.10.11 C12N 5/071(2010.01) C12Q 1/02(2006.01) (71)申请人 李兰芳 地址 421001 湖南省衡阳市南华大学药学与 生物科学学院药学系 (72)发明人 李兰芳 谢凤 柳威 吕德官 陈临溪 陈冠峰 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王文君 (54) 发明名称 压力诱导心肌肥厚细胞模型及其应用 (57) 摘要 本发明涉及一。
2、种压力诱导心肌肥厚细胞模型 及其应用。本发明的压力诱导心肌肥厚细胞模 型， 是通过给培养的心肌细胞施加压力培养获得， 其中所使用的压力为 60mmHg 180mmHg， 优选为 180mmHg， 所述心肌细胞可为大鼠H9c2细胞。 本发 明发现压力可以诱导大鼠 H9c2 心肌细胞肥厚， 促 进细胞直径、 体积增大和蛋白含量的增加。 本发明 还公开了所述压力诱导心肌肥厚细胞模型在心肌 肥厚的基础研究和药物研究中的应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 4 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 。
3、序列表4页 附图5页 (10)申请公布号 CN 103525754 A CN 103525754 A 1/1 页 2 1. 一种压力诱导心肌肥厚细胞模型， 其特征在于， 其通过给培养的心肌细胞施加压力 培养获得。 2. 权利要求 1 所述的细胞模型， 其特征在于， 所使用的压力为 60mmHg 180mmHg。 3. 权利要求 2 所述的细胞模型， 其特征在于， 所使用的压力优选为 180mmHg。 4. 权利要求 1 3 任一项所述的细胞模型， 其特征在于， 所述心肌细胞为大鼠 H9c2 细 胞。 5. 权利要求 1 4 任一项所述的细胞模型在心肌肥厚的基础研究和药物研究中的应 用。 6. 。
4、一种心肌肥厚细胞模型的制备方法， 其特征在于， 其通过给培养的心肌细胞施加压 力培养获得。 7. 权利要求 6 所述的方法， 其特征在于， 所使用的压力为 60mmHg 180mmHg。 8. 权利要求 7 所述的方法， 其特征在于， 所使用的压力优选为 180mmHg。 9. 权利要求 6 8 任一项所述的方法， 其特征在于， 所述心肌细胞为大鼠 H9c2 细胞。 10. 权利要求 6 9 任一项所述的方法在心肌肥厚的基础研究和药物研究中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103525754 A 2 1/7 页 3 压力诱导心肌肥厚细胞模型及其应用 技术领域 0001 本发明涉及细胞生物学领。
5、域， 具体涉及一种压力诱导心肌肥厚细胞模型及其应 用。 背景技术 0002 心肌肥厚是心脏对急、 慢性血流动力学超负荷的一种基本的适应性反应。以心肌 细胞直径、 体积增大及细胞内蛋白质合成增加为主要特征， 是引起心血管疾病的独立危险 因素， 也是心血管疾病常见的一种病理状态。早期心肌肥厚是心肌细胞对外界刺激的代偿 性改变， 有利于维持心输出量， 对机体起到代偿性保护作用， 但长期的心肌肥厚将会诱发心 力衰竭等心血管疾病， 甚至引发猝死。 因此， 探讨心肌肥厚的发生发展机制及其可能的调节 机制， 寻求防治心肌肥厚新靶点和开发更有效的药物， 对心肌肥厚诱发心衰等心血管疾病 的预防和治疗具有重要的意。
6、义。 0003 心肌肥厚的发生机制极其复杂至今仍未完全明了， 目前认为导致心肌肥厚的原因 主要可归纳为 ： 机械性、 神经性与体液性。其中机械刺激主要就是指压力诱导。压力超负荷 使心室壁张力增加， 可导致心肌肥厚的产生。 长期患有高血压的患者， 可引起左心室的心肌 肥厚。 压力负荷一方面直接刺激细胞生长， 另一方面可激活心肌细胞膜上的压力信号开关， 进而调节相关蛋白的表达以及各种细胞因子的分泌如去甲肾上腺素、 血管紧张素和甲状 腺素等等。2012 年 Nature 杂志已经报道血管紧张素受体样受体 APJ 可能作为一个压力 感受的靶标， 参与心肌肥厚的发生 （Scimia MC,et al.A。
7、PJ acts as a dual receptor in cardiac hypertrophy.Nature.2012,16;488(7411):394-8.） 。 0004 压力负荷即机械性因素在心肌肥厚中的作用最为重要。压力负荷诱导心肌肥厚 在实验动物上可以通过腹主动脉狭窄来建立， 而目前在体外培养的细胞上以前无法实现。 压力负荷可以激活机体产生众多细胞因子如去甲肾上腺素、 血管紧张素和甲状腺素的分 泌， 有报道单独使用这些细胞因子也能诱导体外培养的心肌细胞肥厚， 但处理因素单一， 并 且无法模拟体内压力负荷的环境。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种压力诱导心肌肥厚细胞模型。
8、， 其特征在于， 其通过给 培养的心肌细胞施加压力培养获得。 0006 本发明的另一目的在于提供一种压力诱导心肌肥厚细胞模型， 其特征在于， 所使 用的压力为 60mmHg 180mmHg。 0007 本发明的另一目的在于提供一种压力诱导心肌肥厚细胞模型， 其特征在于， 所使 用的压力为优选为 180mmHg。 0008 本发明的另一目的在于提供一种压力诱导心肌肥厚细胞模型， 其特征在于， 所使 用的心肌细胞为大鼠 H9c2 细胞。 0009 本发明的另一目的在于提供一种压力诱导心肌肥厚细胞模型在心肌肥厚的基础 说 明 书 CN 103525754 A 3 2/7 页 4 研究和药物研究中的应。
9、用。 0010 本发明的另一目的在于提供一种心肌肥厚细胞模型的制备方法， 其特征在于， 其 通过给培养的心肌细胞施加压力培养获得。 0011 本发明的另一目的在于提供一种心肌肥厚细胞模型的制备方法， 其特征在于， 所 使用的压力为 60mmHg 180mmHg。 0012 本发明的另一目的在于提供一种心肌肥厚细胞模型的制备方法， 其特征在于， 所 使用的压力为优选为 180mmHg。 0013 本发明的另一目的在于提供一种心肌肥厚细胞模型的制备方法， 其特征在于， 所 使用的心肌细胞为大鼠 H9c2 细胞。 0014 本发明的另一目的在于提供一种心肌肥厚细胞模型的制备方法在心肌肥厚的基 础研究。
10、和药物研究中的应用。 0015 在本发明中， 发明人应用自制的压力细胞培养箱， 可以将心肌细胞置于体外的压 力负荷环境来培养， 从而可以在体外实验中模拟体内的压力负荷环境。应用压力培养可以 弥补单一因子诱导培养的不足。压力培养箱的压力还可以调节， 从而可以模拟体内压力负 荷的动态变化。该模型实施的操作便利， 在短时间内 （通常 48 小时） 即可复制出心肌肥厚细 胞模型， 重复性很好， 与动物实验也可以做平行研究， 具有较好的可比性。 0016 在本发明中， 发明人将普通细胞培养箱改装成压力细胞培养箱， 通过这种压力细 胞培养箱， 给培养的心肌细胞施加压力。发明人的研究结果发现压力可以诱导大鼠。
11、 H9c2 心 肌细胞肥厚， 促进细胞直径、 体积增大和蛋白含量的增加， 并且细胞内血管紧张素受体样受 体 APJ 表达的增加。 0017 发明人进一步设计并合成小分子 RNA 用于干扰 APJ 的表达， 结果发现干扰 APJ 后 可以逆转压力诱导的心肌细胞直径、 体积增大和蛋白含量的增加。整个实验结果可通过如 图 1 所述的信号通路图来描述说明 ： 压力刺激细胞膜上的压力感受器APJ 受体， 使 APJ 受 体表达增加， 然后诱导心肌细胞肥厚 ； 而RNA干扰抑制APJ的表达后能逆转压力诱导的心肌 细胞肥厚 （如图 1） 。此外， 使用磷脂酰肌醇 3- 激酶 (PI3K) 抑制剂 LY294。
12、002 和细胞自噬抑 制剂 3-Methyladenine 两种工具药也可以逆转压力诱导的心肌细胞肥厚。 0018 综上所述， 本发明发现了用发明人自制的压力细胞培养箱可以诱导 H9c2 心肌肥 厚细胞模型， 深入研究后发现 APJ 介导压力诱导的心肌细胞肥厚。本发明为压力如何诱导 心肌细胞肥厚提供了实验的证据。 这一心肌细胞模型及其制备方法在心肌肥厚的基础研究 和药物研究中都有重要的意义和广泛的应用前景。 附图说明 0019 图 1 信号通路图， 显示压力刺激细胞膜上的压力感受器APJ 受体， 使 APJ 受体表 达增加， 然后诱导心肌细胞肥厚 ； 而RNA干扰抑制APJ的表达后能逆转压力诱。
13、导的心肌细胞 肥厚。 0020 图 2 本发明自制的压力细胞培养箱实物照片。 0021 图 3Western Blot 结果图， 显示压力诱导大鼠 H9c2 心肌细胞中 APJ 的表达显著增 加 说 明 书 CN 103525754 A 4 3/7 页 5 0022 图 4shRNA 干扰 APJ 的结果图 0023 图 5 本发明自制的压力细胞培养箱外部结构图， 1 为压力控制器， 2 为放气阀， 3 为 温度计， 4 为压力表， 5 为温控开关， 6 为气瓶。 0024 图 6 本发明自制的压力细胞培养箱内部结构图， 1 为压力控制器， 2 为放气阀， 3 为 温度计， 4 为压力表， 5。
14、 为温控开关， 6 为气瓶， 7 为高压箱体。气体流通路径 ： 6 气瓶4 压力 表1 压力控制器7 高压箱体。 0025 图 7 本发明自制的压力细胞培养箱内置高压小箱体二维图， 1 为内六角螺栓， 2 为 密封垫圈， 3 为高压箱体门。 具体实施方式 0026 建立压力诱导心肌肥厚细胞模型的实验方法如以下实施例所示。 以下实施例用于 说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 0027 实施例 1 大鼠 H9c2 心肌细胞培养 0028 大鼠 H9c2 心肌细胞 （市售可得， 可从例如中国科学院典型培养物保藏委员会细胞 库或其它公司获得） 是源于 BD1X 大鼠胚胎心脏组织的亚克隆细胞株， 。
15、用含 10% 胎牛血清 （FBS） 的DMEM （1.5g/LNaHCO3， 4.5g/L C6H12O6， 4mM L-谷氨酰胺） 培养 ； 每24h换一次培养液， 换液前用 0.01M PBS（称取 8g NaCl、 0.2g KCl、 1.44gNa2HPO4 和 0.24g KH2PO4， 溶于 800ml 蒸馏水中， 用 HCl 调节溶液的 pH 值至 7.4， 最后加蒸馏水定容至 1L） 洗 3 遍后再加入新鲜 培养液 ； 当细胞生长到约 70% 融合时可传代， 用 0.25% 胰酶细胞消化液消化， 显微镜下观察 到贴壁细胞从长梭形变为圆形时停止消化， 加入新鲜培养基吹打均匀后分瓶。
16、培养。在倒置 显微镜下观察， 大鼠 H9c2 心肌细胞呈长梭形、 带状三角形， 细胞间有突起相连， 未见心肌搏 动。取生长状态良好的细胞用于后续实验。 0029 实施例 2 压力培养箱培养大鼠 H9c2 心肌细胞 0030 将生长状态良好的大鼠 H9c2 心肌细胞放入自制的压力细胞培养箱继续培养。靠 注入 5%CO2混合气体 （即 95% 的空气和 5% 的 CO2） ， 可以调节压力培养箱中的压力。 0031 本发明自制的压力细胞培养箱实物照片参见图 2。 0032 实施例 3 大鼠 H9c2 心肌细胞肥厚的检测 0033 1. 大鼠 H9c2 心肌细胞直径和体积测定 0034 收集培养后的。
17、大鼠 H9c2 心肌细胞， 用 0.01M PBS 洗 3 次， 加入 0.25% 胰酶细胞消 化液， 充分消化后吹打均匀制成细胞悬液， 离心弃掉上清， 再加入0.5ml PBS重悬细胞， 使其 呈单个悬浮液， 并且用 PBS 调节细胞密度在 5104-5105/ml， 取 200l 装于 2ml 的 EP 管 中 ； 用Scepter2.0手持式细胞计数器 （Millipore公司， 美国） 测量细胞直径和体积， 直径单 位 ： m/cell， 体积单位 ： m3/cell。 0035 2. 大鼠 H9c2 心肌细胞蛋白含量测定 0036 收集培养后的大鼠 H9c2 心肌细胞， 对各组心肌细。
18、胞进行细胞计数。进一步离心沉 淀细胞后加入 5 倍体积的含 90%RIPA 裂解液和 10% 苯甲基磺酰氟 （PMSF） 的细胞裂解液， 裂 解大鼠 H9c2 心肌细胞的细胞膜， 4 12000rpm 离心 30min 后吸取上清， 用 BCA 蛋白定量分 析试剂盒 （Pierce 公司， 美国） 测定 H9c2 大鼠心肌细胞的蛋白含量， 单位 ： pg/cell。 0037 实施例 4 蛋白质印迹 Western Blot 说 明 书 CN 103525754 A 5 4/7 页 6 0038 取培养后的大鼠H9c2心肌细胞， 弃去培养液， PBS洗3次， 滤纸吸去多余液体， 加入 含 90。
19、%RIPA 裂解液和 10% 苯甲基磺酰氟 （PMSF） 的细胞裂解液 50-70l， 冰上裂解 20min， 用细胞刮匙刮取蛋白收集于 1.5ml EP 管中， 4 12000rpm 离心 15min， 收集上清后用 BCA 蛋白定量分析试剂盒进行蛋白定量。加入 25% 蛋白样品体积的 4 上样缓冲液并混匀， 煮沸 10min， 取 30g 蛋白样品上样进行 SDS-PAGE 凝胶电泳， 于电泳缓冲液中 80V 恒压电 泳 30min， 待样品进入分离胶后改用 120V 恒压电泳， 直至样品电泳至分离胶底部。然后转 膜， 于转膜液中 250mA 恒流湿法电转 2.5h 使蛋白从凝胶转移至 P。
20、VDF 膜上， 5%BSA 封闭液摇 床室温封闭 PVDF 膜 2h 后加 APJ（兔抗） 一抗 （1 ： 1000） ， 4摇床孵育过夜。次日， 用 TBST 洗膜 4 次， 10min/ 次， 加辣根过氧化物酶标记的二抗 （羊抗兔） （1 ： 3000） 室温下摇床孵育 1h， TBST 洗膜 4 次， 15min/ 次， 然后将 PVDF 膜放入发光剂 (Millipore 公司， 美国） 中孵育 2 分钟， 随后将膜放置于 Tanon-6200 化学发光成像系统的平台上， 曝光， 拍照。应用软件 Alphalmager2200（FORM 公司， 美国） 进行图像分析， 统计灰度扫描值。。
21、 0039 实施例 5 针对 APJ 的 RNA 干扰可以逆转压力诱导的心肌细胞肥厚 0040 shRNAs 在上海吉玛公司设计和合成的， 共合成了四条 APJ 干扰链 （分别为 pGPU6/Neo-APJ-rat-531， pGPU6/Neo-APJ-rat-399， pGPU6/Neo-APJ-rat-1071 和 pGPU6/ Neo-APJ-rat-759） 。以 pGPU6/Neo-shNC 并连接一段与目的基因 APJ 无同源性的 siRNA 作 为对照。细胞待长到 70% 左右的时候， 进行转染。转染的时候， 先将质粒 2l( 含 1.0g DNA) 溶于 100l 无血清培养基。
22、中， 转染试剂 Attractene(Qiagen 公司， 德国） 4.5l 溶于 100l无血清培养基中， 然后两者混合后常温下静置30分钟， 再加入六孔板培养的H9c2细 胞中， 同时加入 2ml 培养基进行培养， 6 个小时后， 进行一次换液。24 小时后提取蛋白， 检测 APJ 的表达。 0041 实施例 6 结果分析 0042 （一） 压力诱导心肌细胞肥厚 0043 分别使用压力 (60mmHg、 90mmHg、 120mmHg、 150mmHg 和 180mmHg) 来处理大鼠 H9c2 细胞 48 小时， 并检测细胞的直径、 体积和蛋白含量的变化。结果显示 ： 与 Control。
23、 组比较， 用 120mmHg、 150mmHg 和 180mmHg 的压力培养大鼠 H9c2 心肌细胞， 心肌细胞直径、 体积明显 增大， 蛋白含量显著增加 （表 1） 。 0044 表 1 压力培养对大鼠 H9c2 心肌细胞直径、 体积和蛋白含量的影响 0045 说 明 书 CN 103525754 A 6 5/7 页 7 0046 与 Control 组比较， *p0.05，*p0.01 ； 0047 （二） 压力促进大鼠 H9c2 心肌细胞中 APJ 表达 0048 使用不同压力 （0mmHg、 60mmHg、 90mmHg、 120mmHg、 150mmHg 和 180mmHg）刺激。
24、大鼠 H9c2 心肌细胞 24 小时， WesternBlot 检测发现心肌细胞内 APJ 表达增加 （参见图 3） 。该结 果提示压力促进心肌细胞中 APJ 表达增加。 （与 Control 组比较， *p0.05 ；） 0049 （三） RNA 干扰 APJ 表达 0050 shRNAs 在上海吉玛公司设计和合成的， 以 pGPU6/Neo-shNC 为载体并连接一段与 目的基因 APJ 无同源性的 siRNA 作为对照， 针对目的基因 APJ 共设计并合成了四条干扰链 （分别为 pGPU6/Neo-APJ-rat-531， pGPU6/Neo-APJ-rat-399， pGPU6/Neo。
25、-APJ-rat-1071 和 pGPU6/Neo-APJ-rat-759。具体基因序列如下 ： 0051 pGPU6/Neo-shNC（简称 ： shNC） : 0052 5 -CACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3 0053 5 -GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAGAAC-3 0054 pGPU6/Neo-APJ-rat-531（简称 ： APJ-531） : 0055 5 -CACCGCAGCTACCTCATCTTTGTCATT。
26、CAAGAGATGACAAAGATGAGGTAGCTGCTTTTTTG-3 0056 5 -GATCCAAAAAAGCAGCTACCTCATCTTTGTCATCTCTTGAATGACAAAGATGAGGTAGCTGC-3 0057 pGPU6/Neo-APJ-rat-399（简称 ： APJ-399） : 0058 5 -CACCGACGCTCAGCTGACATCTTCATTCAAGAGATGAAGATGTCAGCTGAGCGTCTTTTTTG-3 0059 5 -GATCCAAAAAAGACGCTCAGCTGACATCTTCATCTCTTGAATGAAGATGTCAGCTGAGCGTC-3 。
27、0060 pGPU6/Neo-APJ-rat-1071（简称 ： APJ-1071） : 0061 5 -CACCGCTTCCTCATGAATGTCTTTCTTCAAGAGAGAAAGACATTCATGAGGAAGCTTTTTTG-3 0062 5 -GATCCAAAAAAGCTTCCTCATGAATGTCTTTCTCTCTTGAAGAAAGACATTCATGAGGAAGC-3 0063 pGPU6/Neo-APJ-rat-759（简称 ： APJ-759） : 0064 5 -CACCGCTACATGGACTACTCTATGGTTCAAGAGACCATAGAGTAGTCCATGTAGCTTT。
28、TTTG-3 0065 5 -GATCCAAAAAAGCTACATGGACTACTCTATGGTCTCTTGAACCATAGAGTAGTCCATGTAGC-3 0066 细胞待长到 70% 左右的时候， 进行转染。转染后 24 小时后提取蛋白， 检测 APJ 的 表达。四条干扰链针对 APJ 均有不同程度的抑制作用， 其中效果最好的是 APJ-399 片段 （参 说 明 书 CN 103525754 A 7 6/7 页 8 见图 4） ， 于是采用这一干扰片段进行进一步实验。 0067 （四） 干扰 APJ 后可以逆转压力诱导的心肌细胞肥厚 0068 使用的是 APJ-399 转染 H9c2 。
29、细胞 24 小时， 然后放入自制的压力细胞培养箱中培 养48小时 （pressure用的是180mmHg） ， 中间隔24小时拿出来换一次液。 48小时后， 进行细 胞直径、 体积的检测 ； 剩下的通过离心重新收集细胞， 然后加裂解液裂解细胞， BCA 蛋白定 量试剂盒检测细胞内蛋白的含量。 结果显示 ： 与Control组比较， 用180mmHg的压力培养后， 心肌细胞直径、 体积明显增大， 蛋白含量显著增加， 干扰APJ后可以逆转压力诱导的H9c2心 肌细胞肥厚 （表 2） 。 0069 表 2 干扰 APJ 后逆转压力诱导的 H9c2 心肌细胞肥厚 0070 0071 与 Control。
30、 组比较， *p0.05 ； 与 pressure 组比较，#p0.05 ； 0072 （五） 磷脂酰肌醇 3- 激酶 (PI3K) 抑制剂 LY294002 可以逆转压力诱导的心肌细胞 肥厚 0073 磷脂酰肌醇 3- 激酶 (PI3K) 信号通路参与心肌肥厚的发生。发明人发现压力培养 箱培养的大鼠 H9c2 心肌细胞中 PI3K 磷酸化水平上调， 采用 PI3K 抑制剂 LY294002（Sigma 公司， 美国） 可以逆转压力诱导的大鼠 H9c2 心肌细胞直径、 体积增大和蛋白含量的增加。使 用的是 LY294002（10M） 预处理 H9c2 细胞 30 分钟， 然后放入自制的压力细胞。
31、培养箱中培 养 48 小时 （pressure 用的是 180mmHg） ， 中间隔 24 小时拿出来换一次液。48 小时后， 进行 细胞直径、 体积的检测 ； 剩下的通过离心重新收集细胞， 然后加裂解液裂解细胞， BCA 蛋白 定量试剂盒检测细胞内蛋白的含量。结果显示 ： 与 Control 组比较， 用 180mmHg 的压力培养 后， 心肌细胞直径、 体积明显增大， 蛋白含量显著增加， LY294002 可以逆转压力诱导的 H9c2 心肌细胞肥厚 （表 3） 。 0074 表 3PI3K 抑制剂 LY294002 逆转压力诱导的 H9c2 心肌细胞肥厚 0075 说 明 书 CN 103。
32、525754 A 8 7/7 页 9 0076 与 Control 组比较， *p0.05 ； 与 pressure 组比较，#p0.05 ； 0077 （六） 细胞自噬抑制剂 3-Methyladenine 可以逆转压力诱导的心肌细胞肥厚 0078 自噬是细胞在应激状态如营养缺乏下细胞内受损物质降解和循环的过程。在一 些疾病如缺血再灌注、 心肌肥厚和心力衰竭等疾病状态下， 心肌细胞自噬的水平也会发生 改变。发明人发现压力培养箱培养的大鼠 H9c2 心肌细胞中自噬标记性蛋白 LC3-II 和 Beclin-1 的表达增加， 采用自噬的抑制剂 3-Methyladenine（3-MA） （Sig。
33、ma 公司， 美国） 可 以抑制压力诱导的大鼠 H9c2 心肌细胞直径、 体积增大和蛋白含量增加的作用。使用的是 3-Methyladenine（5mM） 预处理 H9c2 细胞 30 分钟， 然后放入自制的压力细胞培养箱中培 养 48 小时 （pressure 用的是 180mmHg） ， 中间隔 24 小时拿出来换一次液。48 小时后， 进行 细胞直径、 体积的检测 ； 剩下的通过离心重新收集细胞， 然后加裂解液裂解细胞， BCA 蛋白 定量试剂盒检测细胞内蛋白的含量。结果显示 ： 与 Control 组比较， 用 180mmHg 的压力培养 后， 心肌细胞直径、 体积明显增大， 蛋白含量。
34、显著增加， 3-MA 可以逆转压力诱导的 H9c2 心肌 细胞肥厚 （表 4） 。 0079 表 4 细胞自噬抑制剂 3-MA 逆转压力诱导的 H9c2 心肌细胞肥厚 0080 0081 与 Control 组比较， *p0.05 ； 与 pressure 组比较，#p0.05 ； 0082 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述， 但在本 发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 103525754 A 9 1/4 页 10 。
35、0001 序 列 表 CN 103525754 A 10 2/4 页 11 序 列 表 CN 103525754 A 11 3/4 页 12 序 列 表 CN 103525754 A 12 4/4 页 13 序 列 表 CN 103525754 A 13 1/5 页 14 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103525754 A 14 2/5 页 15 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103525754 A 15 3/5 页 16 图 5 说 明 书 附 图 CN 103525754 A 16 4/5 页 17 图 6 说 明 书 附 图 CN 103525754 A 17 5/5 页 18 图 7 说 明 书 附 图 CN 103525754 A 18 。