说明书含噁唑烷酮环侧链的喹唑啉衍生物及制备和应用
技术领域
本发明属于制药领域，具体涉及一种含噁唑烷酮环侧链的喹唑啉衍生物，以及其制备方法及其应用。
背景技术
自从1962年Stanley Cohen等首次报道分离纯化出EGF并确认其对应的受体EGFR（epidermal growth factor receptor, 表皮生长因子受体），围绕EGFR及其家族的相关研究取得了一系列的进展。EGFR是一个巨大的跨膜蛋白，从N末端到C末端可分为三个区：胞外区、跨膜区和胞内区。EGFR在细胞周期中起重要作用，与细胞生长、增殖、迁移有关。研究表明，超过60%的恶性肿瘤科出现一种或几种EGFR家族受体过表达或突变。在过去的时间里，EGFR抑制剂在肿瘤治疗中得到了快速发展，然而早期上市的药物如Gefitinib和Erlotinib的临床试验和治疗中，仅有一部分的患者对药物有反应。研究进一步发现，最初治疗有效的患者在6-12个月也会出现二次突变而耐药，结果显示50%的患者耐药是由于EGFR20位的外显子T790M突变影响了ATP分子和EGFR酪氨酸激酶的ATP结合区的亲和力。
不可逆抑制剂（包括Afatinib、Dacomitinib、Neratinib等）可与EGFR酪氨酸激酶以共价键结合，可以对抗T790M突变，克服了T790M引起的耐药。其中，勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）近日宣布，FDA已批准afatinib片以商品名Gilotrif上市，作为一种口服的、新的一线治疗药物，用于经由FDA批准的试剂盒证实肿瘤表皮生长因子受体（EGFR）19号外显子缺失或21号外显子突变（L858R）的转移性非小细胞肺癌（NSCLC）患者的治疗。Afatinib是勃林格殷格翰首个肿瘤学药物，是首个不可逆EGFR家族阻断剂，该药的成功上市为开发针对耐药的EGFR抑制剂提供了一个契机。
发明内容
本发明的目的是提供一种含噁唑烷酮环侧链的喹唑啉衍生物，包括其对映异构体，具有以下结构式I：
其中：
R1为取代或者未取代的C6~C10芳基或取代或未取代的C3~C12杂芳基，所述的取代为被C1~C6烷基、卤素、羟基、氨基、C2~C6炔基、C2~C6烯基、C1~C6烷基氧基、氰基、硝基、三氟甲基、C3~C6环烷基和C3~C6杂环烷基中的一种或多种所取代。
R2为氢、卤素、羟基、氨基、C1~C6烷基或C1~C6卤代烷基、C2~C6链烯基、C1~C6烷氧基、C1~C6烷氧基取代的C1~C6烷氧基、2-7个碳原子的烷氧基甲基、R4-(CH2)a-Y-、R4-(CH2)a-Z-(CH2)b-Y-、Het-W-(CH2)n-Y-；其中Y、Z、W各自独立为-O-、-S-或-N(R5)；Het为3~6元杂环基或5元含氮杂芳基；a为0~6，b为0~4；R5为C3~C5环烷基、-NR6R7、-OR8；R6和R7各自独立地为氢、C1~C6烷基、Het-W-(CH2)b-、或R8-W-(CH2)b-；R8为氢、或者C1~C6烷基。
R3选自氢、卤素、羟基、氨基、C1~C6烷基或C1~C6卤代烷基、C2~C6链烯基、C1~C6烷氧基、C1~C6烷氧基取代的C1~C6烷氧基、2-7个碳原子的烷氧基甲基。
X取自O或S。
所述的含噁唑烷酮环侧链的喹唑啉衍生物或者其对应异构体为如下任一化合物：
(S)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物1）；
(R)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物2）；
(S)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(四氢呋喃-3S-基)-喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物3）；
(R)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(四氢呋喃-3S-基)-喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物4）；
(S)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(N-甲基吡咯-3S-氧基)-喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物5）；
(R)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲氧基-喹唑啉-6-基)-2-吡咯烷酮-4-甲酰胺（化合物6）；
(S)-N-(4-(2,4-二氟-3-氯-苯胺基)-7-(N-甲基哌啶-4-甲氧基)-喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物7）；
(R)-N-(4-(2,4-二氟-3-氯-苯胺基)-7-(N-甲基哌啶-4-甲氧基)-喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物8）；
(S)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2,2,2-三氟乙氧基)喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物9）；
(S)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(N-甲基吗啉-2R-甲氧基)-喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物10）；
(S)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-甲氧基乙氧基)-喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物11）；
(R)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-甲氧基乙氧基)-喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物12）；
(S)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(哌啶-2-乙氧基)喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物13）；
(R)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(哌啶-2-乙氧基)喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物14）；
(S)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(吗啉-3-丙氧基)喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物15）；
(R)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(吗啉-3-丙氧基)喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物16）；
(S)-N-(4-(3-溴苯胺基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物17）；
(R)-N-(4-(3-溴苯胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物18）；
(S)-N-(4-(3-三氟甲基苯胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物19）；
(R)-N-(4-(3-三氟甲基苯胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物20）；
(S)-N-(4-((S)-1-苯乙胺基))-7-乙氧基-喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物21）；
(R)-N-(4-((S)-1-苯乙胺基))-7-乙氧基-喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物22）；
(S)-N-(4-(4-甲氧基苯胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物23）；
(S)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-3-甲基-4-甲酰胺（化合物24）；
(S)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯胺基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物25）；
(R)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯胺基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物26）；
(S)-N-(4-(3-氯-4-(吡啶-2-甲氧基)苯胺基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物27）；
(R)-N-(4-(3-氯-4-(吡啶-2-甲氧基)苯胺基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物28）；
(S)-N-(4-(1-(3-氟苯基)-1H-吲唑基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物29）；
(R)-N-(4-(1-(3-氟苯基)-1H-吲唑基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物30）；
(S)-N-(4-(6-甲基吡啶-3-氧基)苯胺基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物31）；
(S)-N-(4-(3-氯-4-(环丙基-1-甲氧基)苯胺基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物32）；
(S)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯胺基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-3-甲基-4-甲酰胺（化合物33）；
(S)-N-(4-(3-氯-4-(环丙基-1-甲氧基)苯胺基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-3-甲基-4-甲酰胺（化合物34）；
本发明的另一个目的是提供所述的化合物I的制备方法，通过以下步骤实现：
以2-氨基-4-氟苯甲酸（化合物1）为起始原料，和醋酸甲脒在乙二醇单甲脒中回流生成7-氟喹唑啉酮（化合物2），7-氟喹唑啉酮（化合物2）在发烟硝酸和浓硫酸的作用下得到硝化产物6-硝基-7-氟喹唑啉酮（化合物3），6-硝基-7-氟喹唑啉酮（化合物3）与新蒸的氯化亚砜作用生成4-氯-6-硝基-7-氟喹唑啉（化合物4），各种取代的芳基胺与上述产物反应得到4-芳胺基-6-硝基-7-氟喹唑啉（化合物5），上述产物的7位氟原子被各种脂肪醇取代，得到4-芳胺基-6-硝基-7-烷氧基喹唑啉（化合物6），在硼氢化钠和六水合氯化亚锡的作用下，中间体（化合物6）的硝基被还原得到4-芳胺基-6-氨基-7-烷基喹唑啉（化合物7），最后与各种取代的噁唑烷酮甲酸缩合得到目标化合物I（化合物8）。
反应式：
其中，各基团的定义均同前式I所述。
本发明制备方法中所涉及的原料或中间体，可直接购买，或按照实施例部分提及的文献方法制备。
本发明制备方法中所述的式I化合物，可以用有机合成和药物化学领域及技术人员熟知的多种方法制备，可以使用上面所描述的方法来制备本发明的化合物，将理解的是当给出典型的或优选的工艺操作条件（即反应温度、时间、反应物的摩尔比、溶剂、压力等等），还可以使用其他工艺操作条件，除非另有说明。最佳反应条件可以随所用的具体反应物或溶剂而变化，但这些条件可以由本领域技术人员通过常规最佳化过程加以确定。通常，可以使用如上所述的反应路线及工艺制备本发明化合物，但并不限于反应条件中的试剂和溶剂。
本发明的再一个目的是提供所述的含噁唑烷酮环侧链的喹唑啉衍生物在制备抗肿瘤细胞药物中的应用，所述肿瘤细胞是指过表达EGFR的人表皮癌细胞株A431、对Gefitinib耐药的人肺腺癌细胞株H1975。实验证明，在细胞水平对与EGFR酪氨酸激酶活性相关的肿瘤细胞（过表达EGFR的人表皮癌细胞株A431、对Gefitinib耐药的人肺腺癌细胞株H1975）具有显著的增殖抑制作用，特别是对耐药细胞株H1975有较好的抑制效果，可制备相应抗肿瘤细胞药物。
本发明提供了一类全新的喹唑啉衍生物，其中的噁唑烷酮可作为新型的非可逆共价反应官能团，可以规避不饱和双键的脱靶标等副作用，其药效学实施例实验数据显示，在细胞水平对与EGFR酪氨酸激酶活性相关的肿瘤细胞（过表达EGFR的人表皮癌细胞株A431、对Gefitinib耐药的人肺腺癌细胞株H1975）具有显著的增殖抑制作用，特别是对耐药细胞株H1975有较好的抑制效果，可以为设计新型克服Gefitinib耐药的EGFR抑制剂提供可能。
附图说明
图1是蛋白质印迹测定法示意图。
图2是Western Blotting 检测化合物对EGFR-TK 的磷酸化抑制结果。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1：(S)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺（化合物1）：
步骤：(S)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺的制备
原料1:6-氨基-4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-乙氧基喹唑啉按照文献J.Med.Chem.2009, 52, 6880-6888的方法制备；
原料2：(S)-2-噁唑烷酮-4-甲酸的合成按照文献Angew.Chem.Int.Ed.2006, 45, 5334-5336的方法制备；
将(S)-2-噁唑烷酮甲酸 (2.0 mmol) 溶于DCM (10 ml)中，加入3 滴DMF，在冰浴条件下，滴加入草酰氯 (1.7mmol)，在冰浴条件下反应30 min, 撤掉冰浴，自然恢复至室温，反应2h，将6-氨基-4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-乙氧基喹唑啉(1.0mmol) 溶于DCM (20ml) 中，于0 oC 搅拌5 min，加入至上述酰氯溶液中，加入Et3N (4.0mmol ), 在冰浴条件下反应30 min，撤除冰浴，自然恢复至室温后，继续搅拌反应过夜。反应结束后，减压浓缩至干得粗品，经柱层析纯化 (流动相DCM/MeOH = 10:1) 得淡黄色的固体，产率为85%。m.p. >250 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.88 (s, 1H), 9.84 (s, 1H), 8.90 (s, 1H),8.54 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 8.11 (dd, J = 7.0, 2.5 Hz, 1H), 7.80-7.76 (m, 1H), 7.43 (t, J =9.0 Hz, 1H), 7.32 (s, 1H), 4.70 (dd, J = 9.5, 4.0 Hz, 1H), 4.58 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 4.33(dd, J = 9.5, 4.0 Hz, 1H), 4.03 (s, 3H); HRMS (ESI): m/z calcd for(C19H15ClFN5O4+H)+: 432.0875; found: 432.0868。
实施例2：(R)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例1的方法，只是将原料（S）-2-噁唑烷酮甲酸换成（R）-噁唑烷酮甲酸，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为85%。 m.p. >250 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.88 (s, 1H), 9.84 (s, 1H), 8.90 (s, 1H),8.54 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 8.11 (dd, J = 7.0, 2.5 Hz, 1H), 7.80-7.76 (m, 1H), 7.43 (t, J =9.0 Hz, 1H), 7.32 (s, 1H), 4.70 (dd, J = 9.5, 4.0 Hz, 1H), 4.58 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 4.33(dd, J = 9.5, 4.0 Hz, 1H), 4.03 (s, 3H); HRMS (ESI): m/z calcd for(C19H15ClFN5O4+H)+: 432.0875; found: 432.0868。
实施例3：(S)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(四氢呋喃-3S-基)-喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例1的方法，只是将原料4-（3-氯-4-氟苯胺基）-6-氨基-7-甲氧基喹唑啉换成4-（3-氯-4-氟苯胺基）-6-氨基-7-（四氢呋喃-3S-基）喹唑啉，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为75%。m.p.:223-225 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.88 (s, 1H), 9.59 (s, 1H), 8.84 (s, 1H),8.54 (s, 1H), 8.19 (s, 1H), 8.12 (dd, J = 7.0, 2.5 Hz, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.80-7.77 (m, 1H),7.43 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 7.27 (s, 1H), 5.32-5.30 (m, 1H), 4.67 (dd, J = 9.0, 3.5 Hz, 1H),4.61 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 4.35 (dd, J = 9.0, 3.5 Hz, 1H), 4.03-4.00 (m, 1H), 3.97-3.91 (m,2H), 3.82-3.78 (m, 1H), 2.37-2.33 (m, 1H), 2.13-2.10 (m, 1H); HRMS (ESI): m/z calcdfor (C22H19ClFN5O5+H)+: 488.1137; found: 488.1124。
实施例4：(R)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(四氢呋喃-3S-基)-喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例3的方法，只是将原料4-（3-氯-4-氟苯胺基）-6-氨基-7-（四氢呋喃-3S-基）喹唑啉换成4-（3-氯-4-氟苯胺基）-6-氨基-7-（四氢呋喃-3R-基）喹唑啉，（S）-2-噁唑烷酮甲酸换成（R）-噁唑烷酮甲酸，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为78%。m.p.:223-225 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.87 (s, 1H), 9.59 (s, 1H), 8.83 (s, 1H),8.54 (s, 1H), 8.19 (s, 1H), 8.12 (dd, J = 6.5, 2.5 Hz, 1H), 7.80-7.77 (m, 1H), 7.43 (t, J =9.0 Hz, 1H), 7.27 (s, 1H), 5.32-5.30 (m, 1H), 4.67 (dd, J = 9.0, 3.0 Hz, 1H), 4.61 (t, J =8.5 Hz, 1H), 4.35 (dd, J = 8.5, 3.5 Hz, 1H), 4.03-4.00 (m, 1H), 3.96-3.90 (m, 2H),3.82-3.78 (m, 1H), 2.38-2.31 (m, 1H), 2.16-2.11 (m, 1H); HRMS (ESI): m/z calcd for(C22H19ClFN5O5+H)+: 488.1137; found: 488.1139。
实施例5：(S)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(N-甲基吡咯-3S-氧基)-喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例1的方法，只是将原料4-（3-氯-4-氟苯胺基）-6-氨基-7-甲氧基喹唑啉换成4-（3-氯-4-氟苯胺基）-6-氨基-7-（N-甲基吡咯-3S-氧基）喹唑啉，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为70%。m.p.:213-215 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.88 (s, 1H), 9.66 (s, 1H), 8.84 (s, 1H),8.53 (s, 1H), 8.21-8.19 (m, 1H), 8.12 (dd, J = 6.5, 2.5 Hz, 1H), 7.80-7.77 (m, 1H), 7.43(t, J = 9.0 Hz, 1H), 7.20 (s, 1H), 5.14 (m, 1H), 4.68 (m, 1H), 4.62 (t, J = 9.0 Hz, 1H),4.36 (dd, J = 8.5, 3.5 Hz, 1H), 2.84-2.82 (m, 2H), 2.41 (m, 2H), 2.31 (s, 3H), 2.04-1.95(m, 1H); HRMS (ESI): m/z calcd for (C23H22ClFN6O4+H)+: 501.1453; found:501.1437。
实施例6：(R)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲氧基-喹唑啉-6-基)-2-吡咯烷酮-4-甲酰胺
参照实施例1的方法，只是将原料(S)-2-噁唑烷酮甲酸换成（S）-2-吡咯烷酮甲酸，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为85%。m.p. > 250 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.85 (s, 1H), 9.61 (s, 1H), 8.88 (s, 1H),8.53 (s, 1H), 8.10 (dd, J = 7.0, 2.5 Hz, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.80-7.77 (m, 1H), 7.42 (t, J =9.0 Hz, 1H), 7.31 (s, 1H), 4.45 (dd, J = 8.5, 3.5 Hz, 1H), 4.03 (s, 3H), 2.45-2.37 (m, 1H),2.30-2.23 (m, 1H), 2.20-2.13 (m, 1H), 2.09-2.03 (m, 1H); HRMS (ESI): m/z calcd for(C20H17ClFN5O3+H)+: 430.1082; found: 430.1035。
实施例7：(S)-N-(4-(2,4-二氟-3-氯-苯胺基)-7-(N-甲基哌啶-4-甲氧基)-喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例1的方法，只是将原料4-（3-氯-4-氟苯胺基）-6-氨基-7-甲氧基喹唑啉换成4-（2,4-二氟-3-氯苯胺基）-6-氨基-7-（N-甲基哌啶-4-甲氧基）喹唑啉，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为70%。m.p.:204-205 oC; 1 H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.93 (s, 1H), 9.61 (s, 1H), 8.79 (s, 1H),8.41 (s, 1H), 7.54-7.49 (m, 1H), 7.38 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.32-7.30 (m, 1H), 4.68-4.60(m, 2H), 4.33 (dd, J = 8.5, 3.5 Hz, 1H), 4.10 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 2.89 (m, 2H), 2.26 (m,2H), 2.06 (m, 2H), 1.90-1.84 (m, 3H), 1.40-1.38 (m, 2H); HRMS (ESI): m/z calcd for(C25H25ClF2N6O4+H)+: 547.1672; found: 547.1710。
实施例8：(R)-N-(4-(2,4-二氟-3-氯-苯胺基)-7-(N-甲基哌啶-4-甲氧基)-喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例7的方法，只是将原料（S）-2-噁唑烷酮甲酸换成（R）-2-噁唑烷酮甲酸，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为56%。m.p.:206-207 oC; 1 H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.93 (s, 1H), 9.61 (s, 1H), 8.79 (s, 1H),8.41 (s, 1H), 7.54-7.49 (m, 1H), 7.38 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.32-7.30 (m, 1H),4.68-4.60(m, 2H), 4.33 (dd, J = 8.5, 3.5 Hz, 1H), 4.10 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 2.89 (m, 2H),2.26 (m, 2H), 2.06 (m, 2H), 1.90-1.84 (m, 3H), 1.40-1.38 (m, 2H); HRMS (ESI): m/z calcd for (C25H25ClF2N6O4+H)+: 547.1672; found: 547.1661。
实施例9：(S)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2,2,2-三氟乙氧基)喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例1的方法，只是将原料4-（3-氯-4-氟苯胺基）-6-氨基-7-甲氧基喹唑啉换成4-（3-氯-4-氟苯胺）-6-氨基-7-（2,2,2,-三氟乙氧基）喹唑啉，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为75%。m.p. > 250 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.94 (s, 1H), 9.84 (s, 1H), 8.73 (s, 1H),8.59 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 8.14 (dd, J = 7.0, 2.5 Hz, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.81-7.78 (m, 1H),7.51 (s, 1H), 7.45 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 5.06 (q, J = 8.5 Hz, 2H), 4.63-4.62 (m, 2H),4.31-4.30 (m, 1H); HRMS (ESI): m/z calcd for (C20H14ClF4N5O4+H)+: 500.0748; found:500.0729。
实施例10：(S)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(N-甲基吗啉-2R-甲氧基)-喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例1的方法，只是将原料4-（3-氯-4-氟苯胺基）-6-氨基-7-甲氧基喹唑啉换成4-（3-氯-4-氟苯胺）-6-氨基-7-（N-甲基吗啉-2R-甲氧基）喹唑啉，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为55%。m.p. > 250 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.89 (s, 1H), 9.67 (s, 1H), 8.76 (s, 1H),8.56 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 8.14 (dd, J = 5.0, 2.5 Hz, 1H), 7.81-7.78 (m, 1H), 7.44 (t, J =9.0 Hz, 1H), 7.37 (s, 1H), 4.64-4.610 (m, 2H), 4.40-4.35 (m, 2H), 4.16-4.13 (m, 1H),3.96-3.94 (m, 1H), 3.74-3.72 (m, 1H), 3.57 (1H), 3.44 (t, J = 10.0 Hz, 1H), 2.59 (m, 1H),2.33 (s, 3H), 2.28 (m, 1H); HRMS (ESI): m/z calcd for (C24H24ClFN6O5+H)+: 531.1559;found: 531.1552。
实施例11：(S)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-甲氧基乙氧基)-喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例1的方法，只是将原料4-（3-氯-4-氟苯胺基）-6-氨基-7-甲氧基喹唑啉换成4-（3-氯-4-氟苯胺）-6-氨基-7-（2-甲氧基乙氧基）喹唑啉，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为89%。m.p. > 250 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.89 (s, 1H), 9.71 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.54 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 8.13 (dd, J = 7.0, 3.0 Hz, 1H), 7.81-7.80 (m, 1H), 7.43 (t, J =9.0 Hz, 1H), 7.34 (s, 1H), 4.65-4.62 (m, 2H), 4.37-4.36 (m, 3H), 3.79-3.78 (m, 2H), 3.35 (s, 3H); HRMS (ESI): m/z calcd for (C21H19ClFN5O5+H)+: 476.1137; found:476.1174。
实施例12：(R)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(2-甲氧基乙氧基)-喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例11的方法，只是将原料（S）-2-噁唑烷酮甲酸换成（R）-2-噁唑烷酮甲酸，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为89%。m.p. > 250 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.93 (s, 1H), 9.79 (s, 1H), 8.81 (s, 1H),8.54 (s, 1H), 8.14 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.80 (m, 1H), 7.43 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 7.33 (s,1H), 4.66 (m, 1H), 4.63-4.60 (m, 1H), 4.40-4.33 (m, 3H), 3.79-3.76 (m, 2H), 3.35 (s, 3H); HRMS (ESI): m/z calcd for (C21H19ClFN5O5+H)+: 476.1137; found: 476.1155。
实施例13：(S)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(哌啶-2-乙氧基)喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例1的方法，只是将原料4-（3-氯-4-氟苯胺基）-6-氨基-7-甲氧基喹唑啉换成4-（3-氯-4-氟苯胺）-6-氨基-7-（哌啶-2-乙氧基）喹唑啉，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为89%。m.p.:203-205 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.86 (s, 1H), 9.64 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.54 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 8.12 (dd, J = 6.5, 2.5 Hz, 1H), 7.80-7.77 (m, 1H), 7.42 (t, J =9.0 Hz, 1H), 7.34 (s, 1H), 4.63-4.60 (m, 2H), 4.37-4.36 (m, 1H), 4.33 (t, J = 6.0 Hz, 2H),2.79 (m, 2H), 1.52-1.50 (m, 5H), 1.40-1.39 (m, 3H), 1.18 (t, J = 7.0 Hz, 1H);HRMS (ESI): m/z calcd for (C25H26ClFN5O4+H)+: 529.1766; found: 529.1760。
实施例14：(R)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(哌啶-2-乙氧基)喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例13的方法，只是将原料（S）-2-噁唑烷酮甲酸换成（R）-2-噁唑烷酮甲酸，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为89%。m.p.:204-205 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.78 (s, 1H), 9.65(s, 1H), 8.79 (s, 1H), 8.60 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 8.12 (dd, J = 6.5, 2.5 Hz, 1H), 7.80-7.77 (m, 1H), 7.50 (t, J =9.0 Hz, 1H), 7.34 (s, 1H), 4.63-4.60 (m, 2H), 4.37-4.36 (m, 1H), 4.33 (t, J = 6.0 Hz, 2H),2.79 (m, 2H), 1.52-1.50 (m, 5H), 1.40-1.39 (m, 3H), 1.18 (t, J = 7.0 Hz, 1H);HRMS (ESI): m/z calcd for (C25H26ClFN5O4+H)+: 529.1766; found: 529.1765。
实施例15：(S)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(吗啉-3-丙氧基)喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例1的方法，只是将原料4-（3-氯-4-氟苯胺基）-6-氨基-7-甲氧基喹唑啉换成4-（3-氯-4-氟苯胺）-6-氨基-7-（吗啉-3-丙氧基）喹唑啉，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为75%。m.p.:234-236 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.86 (s, 1H), 9.63 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.54 (s, 1H), 8.19 (s, 1H), 8.12 (dd, J = 7.0, 2.5 Hz, 1H), 7.80-7.77 (m, 1H), 7.43 (t, J =9.0 Hz, 1H), 7.31 (s, 1H), 4.65-4.62 (m, 2H), 4.34 (dd, J = 8.0, 3.5 Hz, 1H), 4.28 (t, J =6.0 Hz, 2H), 3.59 (t, J = 4.5 Hz, 4H), 2.40 (m, 3H), 2.01-1.98 (m, 2H); HRMS (ESI):m/z calcd for (C25H26ClFN6O5+H)+: 545.1715; found: 545.1712。
实施例16：(R)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(吗啉-3-丙氧基)喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例15的方法，只是将原料（S）-2-噁唑烷酮甲酸换成（R）-2-噁唑烷酮甲酸，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为65%。m.p.:228-229 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.87 (s, 1H), 9.64 (s, 1H), 8.82 (s, 1H), 8.54 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 8.12 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.80-7.77 (m, 1H), 7.43 (t, J = 9.5Hz, 1H), 7.31 (s, 1H), 4.65-4.62 (m, 2H), 4.34 (dd, J = 8.0, 3.0 Hz, 1H), 4.27 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.59 (m, 4H), 2.40 (m, 4H), 2.02-1.99 (m, 2H); HRMS (ESI): m/z calcd for(C25H26ClFN6O5+H)+: 545.1715; found: 545.1729。
实施例17：(S)-N-(4-(3-溴苯胺基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例1的方法，只是将原料4-（3-氯-4-氟苯胺基）-6-氨基-7-甲氧基喹唑啉换成4-（3-溴苯胺）-6-氨基-7-乙氧基喹唑啉，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为85%。m.p. >250 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.83 (s, 1H), 9.66 (s, 1H), 8.86 (s, 1H),8.55 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.84 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.33 (t, J = 8.0 Hz, 1H),7.28-7.26 (m, 2H), 4.69-4.66 (m, 1H), 4.61 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 4.36-4.28 (m, 3H), 1.46(t, J = 7.0 Hz, 3H); HRMS (ESI): m/z calcd for (C20H18BrN5O4+H)+: 472.0620; found:474.0593。
实施例18: (R)-N-(4-(3-溴苯胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例17的方法，只是将原料（S）-2-噁唑烷酮甲酸换成（R）-2-噁唑烷酮甲酸，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为80%。m.p. >250 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.86-9.85 (m, 2H), 8.92 (s, 1H), 8.56 (s,1H), 8.14 (d, J = 5.0 Hz, 2H), 7.84 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.40-7.39 (m, 1H), 7.33-7.31 (m,2H), 5.19-5.16 (m, 1H), 4.60-4.57 (m, 1H), 4.54-4.48 (m, 1H), 4.03 (s, 3H); HRMS(ESI): m/z calcd for (C19H16BrN5O4+H)+: 458.0464; found: 460.0144。
实施例19：(S)-N-(4-(3-三氟甲基苯胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例1的方法，只是将原料4-（3-氯-4-氟苯胺基）-6-氨基-7-甲氧基喹唑啉换成4-（3-三氟甲基苯胺）-6-氨基-7-乙氧基喹唑啉，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为84%。m.p. >250 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 10.00 (s, 1H), 9.85 (s, 1H), 8.95 (s, 1H),8.57 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 8.18 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.61 (t, J = 8.0 Hz, 1H),7.43 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.40-7.39 (m, 1H), 7.33-7.32 (m, 1H), 4.71 (dd, J = 9.0, 4.0 Hz, 1H), 4.58 (t, J = 9.5 Hz, 1H), 4.34 (dd, J = 9.0, 4.0 Hz, 1H), 4.04 (s, 3H); HRMS (ESI):m/z calcd for (C20H16F3N5O4+H)+: 448.1232; found: 448.1245。
实施例20：(R)-N-(4-(3-三氟甲基苯胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例19的方法，只是将原料（S）-2-噁唑烷酮甲酸换成（R）-2-噁唑烷酮甲酸，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为80%。m.p. >250 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 10.00 (s, 1H), 9.85 (s, 1H), 8.95 (s, 1H),8.57 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 8.18 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.61 (t, J = 8.0 Hz, 1H),7.43 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.40-7.39 (m, 1H), 7.33-7.32 (m, 1H), 4.71 (dd, J = 9.0, 4.0 Hz, 1H), 4.58 (t, J = 9.5 Hz, 1H), 4.34 (dd, J = 9.0, 4.0 Hz, 1H), 4.04 (s, 3H); HRMS (ESI):m/z calcd for (C20H16F3N5O4+K)+: 486.0791; found: 486.0805。
实施例21：(S)-N-(4-((S)-1-苯乙胺基))-7-乙氧基-喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例1的方法，只是将原料4-（3-氯-4-氟苯胺基）-6-氨基-7-甲氧基喹唑啉换成4-（S-1-苯乙胺基）-6-氨基-7-乙氧基喹唑啉，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为74%。m.p. >250 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.59 (s, 1H), 8.69 (s, 1H), 8.42 (d, J = 8.0Hz, 1H), 8.32 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.44-7.39 (m, 2H), 7.30 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 7.20 (t, J= 7.5 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 16.4 Hz, 1H), 5.61-5.58 (m, 1H), 4.64-4.58 (m, 2H),4.35-4.33 (m, 1H), 4.26 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 1.58 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.42 (t, J = 7.0 Hz,3H); HRMS (ESI): m/z calcd for (C22H23N5O4+H)+: 422.1828; found: 422.1816。
实施例22：(R)-N-(4-((S)-1-苯乙胺基))-7-乙氧基-喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例21的方法，只是将原料（S）-2-噁唑烷酮甲酸换成（R）-2-噁唑烷酮甲酸，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为74%。m.p. >250 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.72 (s, 1H), 9.03 (s, 1H), 8.79 (s, 1H),8.49 (s, 1H), 8.16-8.14 (m, 2H), 7.45 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.33 (t, J = 7.5 Hz, 3H),7.25-7.22 (m, 2H), 5.70-5.67 (m, 1H), 4.67-4.66 (m, 1H), 4.60 (t, J = 8.5 Hz, 1H),4.50-4.47 (m, 1H), 4.36-4.34 (m, 2H), 4.31-4.24 (m, 3H), 1.60 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.44 (t, J = 6.5 Hz, 3H); HRMS (ESI): m/z calcd for (C22H23N5O4+H)+: 422.1828; found:422.1366。
实施例23：(S)-N-(4-(4-甲氧基苯胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例1的方法，只是将原料4-（3-氯-4-氟苯胺基）-6-氨基-7-甲氧基喹唑啉换成4-（4-甲氧基苯胺基）-6-氨基-7-乙氧基喹唑啉，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为87%。m.p. >250 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.81 (s, 1H), 9.67 (s, 1H), 8.85 (s, 1H),8.42 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.61 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.26 (s, 1H), 6.98-6.93 (m, 2H), 4.69(dd, J = 9.5, 4.0 Hz, 1H), 4.58 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 4.33 (dd, J = 9.5, 4.0 Hz, 1H), 4.01 (s,3H), 3.77 (s, 3H); HRMS (ESI): m/z calcd for (C20H19N5O5+H)+: 410.1464; found:410.1435。
实施例24：(S)-N-(4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-3-甲基-4-甲酰胺
参照实施例1的方法，只是将原料（S）-2-噁唑烷酮甲酸换成（R）-2-噁唑烷酮-3-甲基甲酸，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为70%。m.p. >250 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.88 (s, 1H), 9.84 (s, 1H), 8.87 (s, 1H),8.55 (s, 1H), 8.11 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 7.80-7.77 (m, 1H), 7.43 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 7.32 (s,1H), 4.64-4.62 (m, 1H), 4.33 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 4.04 (s, 3H), 1.47 (d, J = 6.5 Hz, 3H); HRMS (ESI): m/z calcd for (C20H17ClFN5O4+H)+: 446.1031; found: 446.1030。
实施例25：(S)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯胺基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例1的方法，只是将原料4-（3-氯-4-氟苯胺基）-6-氨基-7-甲氧基喹唑啉换成4-（4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯胺基）-6-氨基-7-乙氧基喹唑啉，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为70%。m.p. >250 oC; HRMS (ESI): m/z calcd for (C27H23ClFN5O5+H)+: 552.1450; found:552.1480。
实施例26：(R)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯胺基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例25的方法，只是将原料（S）-2-噁唑烷酮甲酸换成（R）-2-噁唑烷酮甲酸，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为70%。m.p. >250 oC; HRMS (ESI): m/z calcd for (C27H23ClFN5O5+K)+: 590.1009; found:590.1015。
实施例27：(S)-N-(4-(3-氯-4-(吡啶-2-甲氧基)苯胺基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例1的方法，只是将原料4-（3-氯-4-氟苯胺基）-6-氨基-7-甲氧基喹唑啉换成4-（4-（3-氯-4-(吡啶-2-甲氧基)苯胺基）-6-氨基-7-乙氧基喹唑啉，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为70%。m.p. >250 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.72 (s, 1H), 9.64 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.60 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.16 (s, 1H), 7.96 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.88 (t, J =8.0 Hz, 1H), 7.67 (dd, J = 9.0, 2.5 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.38-7.36 (m, 2H),7.26-7.24 (m, 2H), 5.29 (s, 2H), 4.68-4.66 (m, 1H), 4.61 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 4.34 (dd, J= 9.0, 4.0 Hz, 1H), 4.29 (q, J = 4.5 Hz, 2H), 1.45 (t, J = 7.0 Hz, 3H); HRMS (ESI): m/zcalcd for (C26H23ClN6O5+H)+: 535.1496; found: 535.1489。
实施例28：(R)-N-(4-(3-氯-4-(吡啶-2-甲氧基)苯胺基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例27的方法，只是将原料（S）-2-噁唑烷酮甲酸换成（R）-2-噁唑烷酮甲酸，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为70%。m.p. >250 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.72 (s, 1H), 9.64 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.60 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.16 (s, 1H), 7.96 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.90-7.87(m, 1H), 7.67 (dd, J = 9.0, 3.0 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.38-7.36 (m, 1H), 7.26-7.24 (m, 2H), 5.29 (s, 2H), 4.68-4.66 (m, 1H), 4.60 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 4.34 (dd, J= 9.0, 4.0 Hz, 1H), 4.29 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 1.46 (d, J = 7.0 Hz, 3H); HRMS (ESI): m/zcalcd for (C26H23ClN6O5+H)+: 535.1496; found: 535.1487。
实施例29：(S)-N-(4-(1-(3-氟苯基)-1H-吲唑基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例1的方法，只是将原料4-（3-氯-4-氟苯胺基）-6-氨基-7-甲氧基喹唑啉换成4-（4-(1-(3-氟苯基)-1H-吲唑基）-6-氨基-7-乙氧基喹唑啉，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为70%。m.p. >250 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.84 (s, 1H), 9.69 (s, 1H), 8.85 (s, 1H),8.43 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 8.13 (d, J = 11.0 Hz, 2H), 7.72 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.66 (dd,J = 9.0, 1.5 Hz, 1H), 7.41-7.35 (m, 2H), 7.26 (s, 1H), 7.13-7.09 (m, 1H), 7.06 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 5.70 (s, 2H), 4.68 (dd, J = 9.0, 3.5 Hz, 1H), 4.62 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 4.35 (dd, J= 8.5, 3.5 Hz, 1H), 4.29 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 1.45 (t, J = 7.0 Hz, 3H); HRMS (ESI): m/z calcd for (C28H24FN7O4+H)+: 542.1952; found: 542.1939。
实施例30：(R)-N-(4-(1-(3-氟苯基)-1H-吲唑基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例29的方法，只是将原料（S）-2-噁唑烷酮甲酸换成（R）-2-噁唑烷酮甲酸，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为70%。m.p. >250 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.84 (s, 1H), 9.69 (s, 1H), 8.85 (s, 1H),8.43 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 8.12 (s, 1H), 7.72 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.68-7.63(m, 1H), 7.43-7.35 (m, 2H), 7.25 (s, 1H), 7.11 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.06 (d, J = 8.0 Hz,2H), 5.70 (s, 2H), 4.67 (dd, J = 9.0, 3.5 Hz, 1H), 4.61 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 4.34 (dd, J =9.0, 4.0 Hz, 1H), 4.29 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 1.45 (t, J = 7.0 Hz, 3H); HRMS (ESI): m/zcalcd for (C28H24FN7O4+H)+: 542.1952; found: 542.1939。
实施例31：(S)-N-(4-(6-甲基吡啶-3-氧基)苯胺基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例1的方法，只是将原料4-（3-氯-4-氟苯胺基）-6-氨基-7-甲氧基喹唑啉换成4-(4-(6-甲基吡啶-3-氧基)苯胺基）-6-氨基-7-乙氧基喹唑啉，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为70%。m.p. >250 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.88 (s, 1H), 9.67 (s, 1H), 8.86 (s, 1H),8.55 (s, 1H), 8.22 (t, J = 2.0 Hz, 1H), 8.18-8.17 (m, 2H), 7.95 (s, 1H), 7.82 (dd, J = 9.0,3.0 Hz, 1H), 7.30 (s, 1H), 7.27-7.26 (m, 2H), 7.20 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 4.68 (dd, J = 9.0, 4.0 Hz, 1H), 4.61 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 4.36-4.33 (m, 1H), 4.30 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 2.45(s, 3H), 1.47 (t, J = 7.0 Hz, 3H); HRMS (ESI): m/z calcd for (C26H23ClN6O5+H)+:535.1496; found: 542.1938。
实施例32：(S)-N-(4-(3-氯-4-(环丙基-1-甲氧基)苯胺基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-4-甲酰胺
参照实施例1的方法，只是将原料4-（3-氯-4-氟苯胺基）-6-氨基-7-甲氧基喹唑啉换成4-(4-(3-氯-4-(环丙基-1-甲氧基)苯胺基）-6-氨基-7-乙氧基喹唑啉，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为70%。m.p. >250 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.70 (s, 1H), 9.65 (s, 1H), 8.81 (s, 1H),8.48 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.91 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.65 (dd, J = 8.5, 2.0 Hz, 1H), 7.26(s, 1H), 7.14 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 4.68-4.66 (m, 1H), 4.62-4.59 (m, 1H), 4.35-4.34 (m,1H), 4.29 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.92 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 1.45 (t, J = 7.0 Hz, 3H),1.26-1.24 (m, 1H), 0.60-0.59 (m, 2H), 0.36-0.35 (m, 2H); HRMS (ESI): m/z calcd for(C24H24ClN5O5+H)+: 498.1544; found: 498.1549。
实施例33：(S)-N-(4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯胺基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-3-甲基-4-甲酰胺
参照实施例25的方法，只是将原料（S）-2-噁唑烷酮甲酸换成（S）-2-噁唑烷酮-3-甲基甲酸，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为74%。m.p. >250 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.84 (s, 1H), 9.77 (s, 1H), 8.84 (s, 1H),8.50 (s, 1H), 8.12 (s, 1H), 7.95 (d, J = 3.5 Hz, 2H), 7.67 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.48 (dd, J= 14.0, 8.0 Hz, 1H), 7.37-7.30 (m, 3H), 7.25 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.19 (t, J = 10.0 Hz,1H), 5.25 (s, 2H), 4.63 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.32 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 4.03 (s, 3H), 1.46 (d, J = 6.5 Hz, 3H); HRMS (ESI): m/z calcd for (C27H23ClFN5O5+H)+: 552.1450; found:552.1435。
实施例34：(S)-N-(4-(3-氯-4-(环丙基-1-甲氧基)苯胺基)-7-乙氧基喹唑啉-6-基)-2-噁唑烷酮-3-甲基-4-甲酰胺
参照实施例33的方法，只是将原料4-（4-(3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯胺基）-6-氨基-7-甲氧基喹唑啉换成4-(4-(3-氯-4-(环丙基-1-甲氧基)苯胺基）-6-氨基-7-乙氧基喹唑啉，反应结束后，减压浓缩至干得到粗品，经柱层析纯化（DCM/MeOH=10:1）得到淡黄色固体，收率为70%。m.p. >250 oC; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.71 (s, 1H), 9.66 (s, 1H), 8.76 (s, 1H),8.48 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.91 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.65 (dd, J = 9.0, 2.5 Hz, 1H), 7.26(s, 1H), 7.13 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 4.64-4.62 (m, 1H), 4.30-4.26 (m, 2H), 3.92 (d, J = 7.0Hz, 2H), 1.50-1.43 (m, 6H), 1.28-1.21 (m, 1H), 0.62-0.57 (m, 2H), 0.38-0.34 (m, 2H); HRMS (ESI): m/z calcd for (C25H26ClN5O5+H)+:512.9652; found: 512.9635。
实施例35 化合物对A431、H1975细胞增殖抑制活性测定
本例用于测定本发明化合物对于EGFR野生型高表达细胞株A431及T790M点突变细胞株H1975的增殖抑制活性，化合物对细胞增殖的抑制活性用半数抑制浓度IC50来表示。试验方案如下：EGFR野生型高表达细胞株A431及T790M点突变细胞株H1975细胞均购于ATCC，以适宜的细胞浓度（A431：20000个细胞/ml 培养基；H1975：15000个细胞/ml 培养基）将细胞接种于白色不透明的384孔培养板上；之后将细胞放置于37℃，5%CO2的环境中进行培养，24小时后，向培养的细胞培养基中加入一系列浓度梯度的药物，一般选择10个浓度，之后将细胞放回原培养环境中继续培养48小时，之后按照CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay的方法，测定受试化合物对A431及H1975细胞增殖的影响，并计算不同浓度的化合物对细胞增殖的抑制活性，CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay检测试剂购自Promega。之后对不同浓度的化合物下A431及H1975细胞增殖抑制活性进行四参数拟合，受试化合物的IC50数据参见表1。
结论：在这一系列本发明的化合物中，部分化合物在体外肿瘤细胞人表皮癌细胞株A431、Gefitinib 耐药非小细胞肺癌细胞株H1975 的细胞增殖抑制实验中，都优于阳性Gefitinib，部分与阳性Canertinib 相当。同时在本发明中设计了五元内酰胺类衍生物化合物6作为对照，再次从细胞水平上来验证该类噁唑酮类作为Cysteine 反应官能团的可能性。实验结果表明，在丧失了噁唑酮这样的骨架，化合物6 在H1975 的抑制活性明显丧失。
实施例36 通过Western Blot方法测定化合物对A431细胞中EGFR磷酸化的抑制效果
蛋白质印迹 (western blotting) 测定法其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。主要分为以下几个步骤，参见图1：（1） 蛋白样品制备；（2）蛋白含量的测定；（3）SDS-PAGE 电泳；（4）转膜；（5）免疫反应；（6）化学发光，显影，定影；（7）凝胶图象分析。
我们设计了两组实验组，第一组为NO WASH 组，即不对抑制剂在A431 细胞中的抑制作用进行洗脱处理；第二组为WASH-OUT 组，即对抑制剂的抑制作用进行较为彻底的洗脱处理。具体的操作如下：
（1）NO WASH 组：将状态较好的A431 细胞株种入6 孔板，细胞密度为3 X 105/孔,恒温孵育24 h，待细胞状态良好后，换掉培养基，改加无血清的培养基饥饿培养10h 后，加入抑制剂孵育1 h (抑制剂的终浓度为1 μM)。然后加入20 ng/mL 的EGF刺激孵育0.5 h 后收集蛋白，制备样品，上样跑胶。
（2）WASH 组：将状态较好的A431 细胞株种入6 孔板，细胞密度为3 X 105/孔, 恒温孵育24h，待细胞状态良好后，换掉培养基，改加无血清的培养基饥饿培养10h后，加入抑制剂孵育1 h (抑制剂的终浓度为1 μM) 。接下去，用中性新鲜培养液彻底洗涤、置换培养皿中的培养液，洗涤5 h，每0.5h 置换一次培养皿中的培养液即共置换了10 次培养液。然后，再用同样浓度的EGF 刺激0.5h，收集蛋白，制备样品，上样跑胶。结果参见图2，G 代表Gefitinib，C 代表Canertinib，T 代表化合物25，左图是未洗脱组，右图为洗脱组。
结论：人表皮癌细胞株A431 与待测化合物25共孵育1h 后，再用20ng/ml的EGF 刺激0.5h，不洗脱组中，待测化合物TKI-090 与阳性对照药物Gefitinib 和Canertinib 一样具有EGFR-TK 磷酸化抑制作用。当洗脱组在待测化合物25共孵育1h 后，每隔1h 用中性洗脱液洗去未发生共价结合的化合物。5h 后，同样用20ng/ml 的EGF 刺激0.5h，发现洗脱组中，可逆型EGFR 抑制剂Gefitinib 几乎没有了EGFR-TK 磷酸化抑制作用，而不可逆抑制剂Canertinib 仍然保持EGFR-TK磷酸化抑制作用。而我们的待测化合物25则介于阳性对照Gefitinib 和Canertinib 之间。我们初步推测该类化合物具有部分非可逆的抑制作用。
本发明化合物结构上具有新颖性，是首次提出的新型非可逆共价结合片段，同时体外生物活性评价结果显示，本发明的化合物对过表达EGFR的人表皮癌细胞株A431、对Gefitinib耐药的人肺腺癌细胞株H1975具有明显的抑制增殖活性，部分化合物优于阳性Canerinib ，为设计新型克服Gefitinib耐药 EGFR抑制剂提供了设计思路。