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1、(10)申请公布号 CN 103571769 A (43)申请公布日 2014.02.12 CN 103571769 A (21)申请号 201310121725.1 (22)申请日 2013.04.09 CCTCC NO ： M 2010375 2010.12.31 201210113656.5 2012.04.17 CN C12N 1/20(2006.01) A62D 3/02(2007.01) C12R 1/01(2006.01) A62D 101/04(2007.01) A62D 101/26(2007.01) (71)申请人 上海交通大学 地址 200240 上海市闵行区东川路 80。
2、0 号 (72)发明人 许平 唐鸿志 胡海洋 李健 陶飞 (74)专利代理机构 上海旭诚知识产权代理有限 公司 31220 代理人 郑立 (54) 发明名称 一种寡养单胞菌及其在降解啶虫脒中的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种寡养单胞菌及其在降 解啶虫脒中的应用， 该菌菌名为寡养单胞菌 Stenotrophomonas sp.XP， 已于 2010 年 12 月 31 日保藏于中国典型培养物保藏中心， 其保藏登 记号为 CCTCC NO ： M 2010375 ； 所述寡养单胞菌 Stenotrophomonas sp.XP能在含酵母粉和啶虫脒 的无机盐培养基中培养， 并将有毒的啶虫脒降解。
3、 为无毒的化合物， 从而保护了环境， 且使用方法简 单、 经济、 无二次污染。 (66)本国优先权数据 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103571769 A CN 103571769 A 1/1 页 2 1. 一种寡养单胞菌， 其特征在于 ： 其菌名为寡养单胞菌 Stenotrophomonas spXP， 已于 2010 年 12 月 31 日保藏于中国典型培养物保藏中心， 其保藏登记号为 CCTCC N。
4、O ： M 2010375。 2. 一种权利要求 1 所述寡养单胞菌在降解啶虫脒中的应用。 3. 根据权利要求 2 所述的应用， 其中所述寡养单胞菌 Stenotrophomonas spXP 在添 加酵母粉和啶虫脒的无机盐培养基中培养。 4. 根据权利要求 3 所述的应用， 其中所述无机盐培养基的配方为 ： 每 1000ml 去离子 水中含有 133g K2HPO43H2O、 4g KH2PO4、 02gMgSO47H2O 和 5ml 微量金属盐溶液 ； 所 述微量金属盐溶液的配方为 ： 1000mL 01M 盐酸溶液中含有 005gCaCl22H2O、 005g CuCl22H2O、 00。
5、08g MnSO4H2O、 0004g FeSO47H2O、 01gZnSO4、 01g NaMoO42H2O 和 005g NaWO42H2O。 5. 根据权利要求 3 所述的应用， 其中所述无机盐培养基中啶虫脒的浓度为 1g L。 6. 根据权利要求 3 所述的应用， 其中所述寡养单胞菌 Stenotrophomonas spXP 的培 养温度为 30。 7. 根据权利要求 3 所述的应用， 其中所述寡养单胞菌 Stenotrophomonas spXP 的培 养摇床转速为 200 转分钟。 8. 根据权利要求 3 所述的应用， 其中所述酵母粉的浓度为 1g L。 权 利 要 求 书 CN。
6、 103571769 A 2 1/4 页 3 一种寡养单胞菌及其在降解啶虫脒中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种寡养单胞菌， 尤其涉及一种能降解啶虫脒的寡养单胞菌。 背景技术 0002 啶虫脒(Acetamiprid)属于氯化烟酰亚胺类新型高效杀虫剂， 于1996年由日本曹 达株式会社开发并商品化， 是继吡虫啉、 烯啶虫胺之后的第三个新烟碱类杀虫剂。 啶虫脒是 一种新型甲基乙酰胺类杀虫剂， 具有触杀、 胃毒、 渗透和内吸等杀虫作用， 高效、 安全、 广谱， 对半翅目、 鳞翅目、 鞘翅目等有效， 具有活性高、 持效期长、 用量少、 内吸性强等优点。 啶虫脒 作为一种神经性杀虫剂， 是烟酸。
7、乙酰胆碱酯酶受体的作用体， 能选择性抑制昆虫神经系统 中乙酰胆碱酯酶的受体， 表现出与这一受体的极高竞争性结合能力， 可抑制烟酸乙酰胆碱 的传递， 干扰害虫的神经系统化学信号的传递， 破坏昆虫中枢神经的正常传导， 从而导致昆 虫麻痹并最终死亡。 0003 随着对该杀虫剂研究的不断展开， 该杀虫剂的毒性日益显现。 Hassani等在其研究 中指出， 啶虫脒低浓度下会影响蜜蜂对刺激的灵敏度以及损伤蜜蜂的长期记忆。 Kocaman等 报道指出， 体外实验中啶虫脒显示出了对人体外周血淋巴细胞的基因毒性以及细胞毒性 ： 25-40g/ml浓度的啶虫脒处理24及48小时， 会显著诱发人体外周血淋巴细胞的姐。
8、妹染色 单体交换以及染色体畸变， 同时使用 30-40g/ml 啶虫脒会显著诱导细胞微核的产生， 表 明了啶虫脒会诱发 DNA 损伤。因而有必要研究该杀虫剂高效降解和转化方法， 减少其在环 境中残留， 降低对益虫及人类危害的目的。 0004 微生物转化是利用微生物代谢过程中产生的酶系对底物的某一特定部位进行有 机反应， 在微生物体内或体外促进天然的和人工合成的化学分子的诸多转化反应， 反应条 件温和、 专一性强、 高效环保。由于微生物种类繁多、 繁殖速度快、 代谢能力强等优点， 可以 考虑使用微生物转化技术降低农残中啶虫脒的含量， 并转化获得高值新型农药， 减少对益 虫及人类的潜在危害。 发明。
9、内容 0005 本发明的目的是提供一种能高效降解啶虫脒的寡养单胞菌及其在降解啶虫脒中 的应用， 所述寡养单胞菌能将有毒的啶虫脒降解为无毒的化合物， 保护了环境， 且使用方法 简单、 经济、 无二次污染。 0006 为实现上述目的， 本发明采用以下技术方案 ： 0007 一种寡养单胞菌， 菌名为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)XP， 已于2010年12 月 31 日保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)， 其保藏登记号为 CCTCC NO ： M2010375。 中国典型培养物保藏中心地址 ： 中国， 武汉， 武汉大学 ； 邮编 ： 430072。 0008 所述寡养。
10、单胞菌 (Stenotrophomonas sp.)XP， 来源于生产啶虫脒农药厂的上壤样 品、 排污口水样， 经富集培养、 分离得到。 0009 所述寡养单胞菌 (Stenotrophomonas sp.)XP， 菌落成半透明乳白色或乳白色， 菌 说 明 书 CN 103571769 A 3 2/4 页 4 落湿润、 边缘整齐， 多为规则圆形菌落， 该菌为一株革兰氏阴性菌， 具有极生鞭毛， 菌体为短 杆状， 长约为 1m， 宽约为 0.5m， 结果见图 1。使用 16S rDNA 基因序列分析， 结果显示该 菌与假单胞菌属 (Pseudomonas sp.) 及寡养单胞菌属 (Stenotr。
11、ophomonas sp.) 细菌相似 性最高， 同时进化树分析结果指出， 该菌与寡养单胞菌 (Stenotrophomonas sp.) 进化距离 更进， 结果见图 2。之后针对假单胞菌与寡养单胞菌氧化酶反应实验的不同设计实验， 结果 指出， 该菌为氧化酶反应阴性， 与寡养单胞菌 (Stenotrophomonas sp.) 反应结果一致。 0010 本发明所述的高效降解啶虫脒寡养单胞菌 (Stenotrophomonas sp.)XP， 在添加 1g/L 酵母粉的无机盐培养基中， 菌体初始浓度 OD600nm 为 0.04， 能够在 26 小时的培养过程 中将 1g/L 啶虫脒降解完全， 。
12、结果见图 3。 0011 较 佳 的，所 述 无 机 盐 培 养 基 的 配 方 为 ： 每 1000ml 去 离 子 水 中 含 有 13.3gK2HPO43H2O， 4g KH2PO4， 0.2gMgSO47H2O， 5ml 微量金属盐溶液。其中的微量金属盐 溶液配方为 1000mL 0.1M 盐酸溶液中含有 0.05g CaCl22H2O， 0.05g CuCl22H2O， 0.008g MnSO4H2O， 0.004g FeSO47H2O， 0.1g ZnSO4， 0.1g NaMoO42H2O， 0.05g NaWO42H2O。 0012 较佳的， 所述寡养单胞菌 (Stenotro。
13、phomonas sp.)XP 的培养温度为 30， 培养摇 床转速为 200 转 / 分钟。 0013 本发明的优点是 ： 所述寡养单胞菌 (Stenotrophomonas sp.)XP 在高效降解啶虫 脒的同时， 可以将其转化为C7H9N2Cl， 该产物为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)XP脱去 啶虫脒药效基团氰基所得， 结果见图 5， 保护了环境。 附图说明 0014 图 1 为寡养单胞菌 (Stenotrophomonas sp.)XP 的电镜照片。 0015 图2为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)XP16S rDNA基因序列分析比对结果。。
14、 0016 图 3 为寡养单胞菌 (Stenotrophomonas sp.)XP 生长及降解曲线。 ： 寡养单胞菌 菌株生长曲线 ； ： 菌株降解曲线。 0017 图 4 为寡养单胞菌 (Stenotrophomonas sp.)XP 降解及代谢产物鉴定。 0018 图 5 为代谢产物质谱鉴定结果。 具体实施方式 0019 下面对发明的实施例作详细说明， 本实施例在本发明技术方案为前提下进行实 施， 给出了详细的实施方式和具体的操作过程， 但本发明的保护不限于下属的实施例。 0020 实施例 1 ： 寡养单胞菌 (Stenotrophomonas sp.)XP 的分离筛选及鉴定 0021 1。
15、、 分离及筛选 0022 筛菌使用土样分别从上海东风农药厂以及江苏克胜集团厂区采集了土样、 排污口 水样以及曝气池水样。密封保存后， 及时带回实验室进行实验。上样及水样悬浮处理， 洗掉 砂石后转接入含有一定浓度啶虫脒的选择性培养基与 LB 培养基 (pH 7.0) 中 ( 富集培养 ) 中， 30、 200 转 / 分钟震荡培养， 菌液长浓后， 再次转接入新的含有啶虫脒的选择性培养基 中。按照上述操作， 反复转接三次， 每轮转接后菌液 -80保存， 后续做 DGGE 分析菌落变化 情况。同时从第三轮筛选过程中挑菌液平板划线， 挑选出长势较好的单菌落分别培养这些 单一菌株， 进行农药降解实验， 。
16、HPLC 检测农药降解情况从中筛选出 3-4 株较好菌株进行后 说 明 书 CN 103571769 A 4 3/4 页 5 续的生理生化鉴定， 以及代谢途径的研究。 0023 选择性培养基如下 ： 唯一碳源培养基 (g L-1) ： 13.3g K2HPO4 3H2O， 4g KH2PO4， 0.2g MgSO47H2O， 5ml 无机盐混合液， 啶虫脒 0.5g， 加蒸馏水至 1000ml。待以上培养基混匀后， 使用已灭菌微孔滤膜过滤除菌至已灭菌的 300ml 三角瓶中， 每瓶装入 50ml。无机盐混合液 配方为 ： 0.05g CaCl22H2O， 0.05gCuCl22H2O， 0.0。
17、08g MnSO4H2O， ， 0.004g FeSO47H2O， 0.1g ZnSO4， 0.1g NaMoO42H2O， 和 0.05g NaWO42H2O， 溶于 1000mL 0.1M 盐酸溶液中。 0024 2、 菌株的鉴定 0025 如图 2 所示， 使用 16S rDNA 基因序列分析， 结果显示该菌与假单胞菌属 (Pseudomonas sp.) 及寡养单胞菌属 (Stenotrophomonas sp.) 细菌相似性最高， 同时进化 树分析结果指出， 该菌与寡养单胞菌 (Stenotrophomonas sp.) 进化距离更近。之后针对假 单胞菌与寡养单胞菌氧化酶反应实验的不。
18、同设计实验， 结果指出， 该菌为氧化酶反应阴性， 与寡养单胞菌 (Stenotrophomonas sp.) 反应结果一致。该菌株脂肪酸分析的结果同上述 一致。该菌株为革兰氏阴性菌， 具有极生鞭毛， 菌体为短杆状， 长约为 1m， 宽约为 0.5m， 参考图 1。 0026 该菌株已于 2010 年 12 月 31 日保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)， 其保藏 登记号为 CCTCC NO ： M 2010375。 0027 实施例 2 ： 寡养单胞菌 (Stenotrophomonas sp.)XP 对啶虫脒农药的降解 0028 在添加 1g/L 酵母粉的无机盐培养基 (pH 7.。
19、0) 中， 啶虫脒浓度 1g/L， 30， 200 转 / 分钟培养情况下， 4的接种量接种， 菌体初始浓度 OD600nm 为 0.04， 该菌在 10 小时左右 进入对数生长期， 通过液相色谱鉴定， 26 小时啶虫脒可以完全降解。在生长体系中， 随着啶 虫脒的不断降解、 减少， 其降解产物也随之生成。啶虫脒在 HPLC 中出峰时间在 5.5 分钟左 右， 降解产物出峰时间为 4.25 分钟左右， 该降解产物为终产物， 参考图 3 和图 4。 0029 无机盐培养基的配方为 ： 每1000ml去离子水中含有13.3g K2HPO4 3H2O， 4gKH2PO4， 0.2gMgSO4 7H2O。
20、， 5ml 微量金属盐溶液。其中的微量金属盐溶液配方为 1000mL 0.1M 盐酸溶 液中含有 0.05g CaCl22H2O， 0.05g CuCl22H2O， 0.008g MnSO4H2O， 0.004g FeSO47H2O， 0.1g ZnSO4， 0.1g NaMoO42H2O， 0.05g NaWO42H2O。 0030 实施例 3 ： 寡养单胞菌 (Stenotrophomonas sp.)XP 对啶虫脒农药降解产物鉴定 0031 按照实施例2中的培养方法， 培养菌株寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)XP约 1L， 5500转/分钟离心7分钟， 取上清， 使。
21、用SHB-3循环水多用真空泵真空抽滤后， 滤液使用 RE52-2 旋转蒸发器， 减压 55蒸发浓缩上述液体至约 100ml。液体浓缩后为极粘稠液体， 然后倒入约 100ml 氯仿， 摇振萃取， 以使浓缩后液体中啶虫脒代谢物最大程度溶于氯仿中。 之后， 取氯仿相 ( 分层后下层 )， 氮吹浓缩。浓缩后氯仿溶解的代谢产物使用 TLC 薄层层析 分离， 紫外灯下画出代谢产物出现的区域， 然后使用手术刀将硅胶板上有代谢产物的区域 割下。加入适量的 TLC 展层剂 ( 约 10ml)， 然后使用 KQ-100E 型超声波清洗器超声处理 30 分钟， 以使硅胶吸附的代谢产物尽可能多的溶解到展层剂中。取超声。
22、后液体上清， 做 TLC 检 测， 以确定代谢产物已溶解到展层剂中。之后 N2吹吹干， 干后粉末使用 1-2ml 氯仿溶解， 使 用 0.22m 滤膜过滤， 滤液用于气相、 气质联用及核磁共振检测。 0032 结合啶虫脒 GC-MS 标准品谱图及啶虫脒分子结构图， 由于知道啶虫脒的分子量为 222.68Da， 可以看出质谱图右侧的 222Da 处峰应为分子离子峰， 221Da 处的峰应为啶虫脒分 说 明 书 CN 103571769 A 5 4/4 页 6 子被打掉一个氢原子的结果， 参考图 5。 0033 各主要离子峰对应的啶虫脒集团为 ： 0034 Mw 222.0Da 处， 为啶虫脒分子。
23、离子峰位置 (C10H11ClN4)， 即 M+ ； 0035 Mw 221.0Da 处， 为啶虫脒分子打掉一个 H 原子结果， 即 M+-H+ ； 0036 Mw 207.0Da 处， 为啶虫脒分子打掉一个甲基后结果， 即 M+-CH3； 0037 Mw 181.0Da 处， 为啶虫脒分子打掉 CH3-CNH 之后的结果， 即 M+-CH3-CNH 0038 Mw 166.0Da 处， 为 Cl-C5H3N-CH2-N-CN+ 0039 Mw 152.0Da 处， 为 Cl-C5H3N-CH2-N-C+ 0040 Mw 141.0Da 处， 为 Cl-C5H3N-CH2-N+H+ 0041 。
24、Mw 126.0Da 处， 为 Cl-C5H3N-CH2+ 0042 Mw 112.0Da 处， 为 Cl-C5H3N+ 0043 Mw 67.0Da 处， 为 CH3-C N-C N+ 0044 Mw 42.0Da 处， 为 N-C N+2H+ 0045 由分子离子峰155Da左右可以推断， 该降解产物的分子式为Cl-C5H3N-CH2-NH-CH3， 即啶虫脒结构除掉最右端 CH3-C N-C N 结构后的产物。 0046 核磁波谱分析其各主要裂分峰如下 ： 0047 分子离子峰 ： M+156， (符合N规则)， CL37的同位素峰为158， 基本符合31 的同位素分布。 0048 M+。
25、-H 155， 126 为 M+-30， 即 Cl-C5H3N-CH2+， 113 为 Cl-C5H4N， 78 为 C5H4N， 44 为 -CH2-NH-CH3。 0049 从 H 谱的各峰归属 ： H 谱的溶剂峰不知是哪一种， 目前把无法确定的 4.6 4.9 的峰暂时划归溶剂 H.( 可能是 CH3OD)。其中 8.3， 1H 为 6- 位 ； 7.8， 1H 为 3- 位 ； 7.4， 1H 为 4- 位 ； 3.73， 2H 为 -CH2； 3.05， 1H 为 -NH ； 1.9， 3H 为 -CH3； 其他可能为 H2O 的氢峰。 0050 从 C 谱来看 ： 150 可归属为。
26、 2- 位 C ； 139 归属为 6- 位 C ； 134 归属为 5- 位 C ； 130 归属为 4- 位 C ； 124 归属为 3- 位 ； 34 归属为 -CH3的 C ； 47 左右可能为溶剂峰 ( 推测可能是 CD3OD) ； 48 为 -CH2的峰。 0051 综合以上 GC-MS 以及核磁共振的结果， 可以确定 ACE-6-8 降解啶虫脒的产物结构 的分子式为 Cl-C5H3N-CH2-NH-CH3。 说 明 书 CN 103571769 A 6 1/3 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103571769 A 7 2/3 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103571769 A 8 3/3 页 9 图 5 说 明 书 附 图 CN 103571769 A 9 。