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1、(10)申请公布号 CN 103342665 A (43)申请公布日 2013.10.09 CN 103342665 A *CN103342665A* (21)申请号 201310241311.2 (22)申请日 2013.06.18 C07C 259/06(2006.01) C07C 235/38(2006.01) C07C 231/12(2006.01) A61K 31/165(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 西安交通大学 地址 710049 陕西省西安市咸宁西路 28 号 (72)发明人 张杰 卢闻 王芳 贺浪冲 周明瑶 李鹏飞 王琛 (74)专。
2、利代理机构 西安通大专利代理有限责任 公司 61200 代理人 汪人和 (54) 发明名称 一种具有抑制组蛋白去乙酰化酶活性的化合 物及其制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种具有抑制组蛋白去乙酰化 酶活性的化合物及其制备方法， 该化合物包括两 类异羟肟酸类和苯甲酰胺类化合物。所提供的化 合物是新型的具有抗组蛋白去乙酰化酶活性的化 合物， 其体外对组蛋白去乙酰化酶有很好的抑制 活性 ； 可用于抗肿瘤药物的制备。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 11 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书11页 附图1页 (1。
3、0)申请公布号 CN 103342665 A CN 103342665 A *CN103342665A* 1/2 页 2 1. 一种化合物， 其特征在于， 其化学结构式为 ： 其中， R1为卤素、 三氟甲基或甲氧基， R2为羟胺、 2- 氨基苯胺或 4- 甲基 -2- 氨基苯胺。 2. 如权利要求 1 所述的化合物， 其特征在于， 所述的 R1为双取代， 取代基为卤素、 三氟 甲基中的一种或两种。 3. 如权利要求 2 所述的化合物， 其特征在于， 所述的双取代的取代基相邻或相间。 4. 如权利要求 1 所述的化合物， 其特征在于， 所述的 R1为单取代， 取代基为卤素、 三氟 甲基中的一种。。
4、 5. 权利要求 1 所述的化合物的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 1） 阿魏酸与甲醇发生酯化反应， 得到阿魏酸甲酯 ； 2） 取代基为 R1的取代苯胺与氯乙酰氯反应生成取代基为 R1的取代氯乙酰苯胺 ； 3） 阿魏酸甲酯与取代氯乙酰苯胺发生成醚反应， 得到相应的取代的阿魏酸甲酯 ； 4） 将取代的阿魏酸甲酯溶于有机溶剂， 加入 NH2OK/KOH 的甲醇溶液反应制备异羟肟酸， 待充分反应后得到具有组蛋白去乙酰化酶抑制活性的异羟肟酸类化合物。 6. 如权利要求 5 所述的化合物的制备方法， 其特征在于， 具体包括以下步骤 ： 1） 将阿魏酸溶于甲醇， 在浓硫酸催化作用下发生酯化反应。
5、， 得到阿魏酸甲酯 ； 2） 在冰浴条件下， 取代基为 R1的取代苯胺与氯乙酰氯在有机溶剂中充分混匀后， 室温 搅拌充分反应 ； 反应完全后洗涤， 干燥， 过滤， 蒸除溶剂后硅胶柱色谱分离， 得到取代基为 R1 的取代氯乙酰苯胺 ； 3） 在有机溶剂中阿魏酸甲酯与取代氯乙酰苯胺充分混合， 无水碳酸钾存在条件下， 加 热回流发生成醚反应， 反应完成后洗涤， 干燥， 过滤， 蒸除溶剂后硅胶柱色谱分离， 得到相应 的取代的阿魏酸甲酯 ； 4） 将取代的阿魏酸甲酯溶于无水 N,N- 二甲基甲酰胺， 加入 NH2OK/KOH 的甲醇溶液， 室 温搅拌充分反应， 反应完全后加入冰水并调 pH 至 2.0 。
6、； 抽滤， 收集滤饼， 然后硅胶柱色谱分 离， 得到具有组蛋白去乙酰化酶抑制活性的异羟肟酸类化合物。 7. 权利要求 1 所述的化合物的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 1） 阿魏酸与邻苯二胺或 4- 甲基邻苯二胺发生缩合反应， 生成相应的苯甲酰胺 ； 2） 取代基为 R1的取代苯胺与氯乙酰氯反应生成取代基为 R1的取代氯乙酰苯胺 ； 3） 步骤 1） 制备的苯甲酰胺与取代的氯乙酰苯胺发生成醚反应， 具有组蛋白去乙酰化酶 抑制活性的苯甲酰胺类化合物。 8. 如权利要求 7 所述的化合物的制备方法， 其特征在于， 具体包括以下步骤 ： 1） 将阿魏酸溶解于有机溶剂后， 加入 N,N- 。
7、羰基二咪唑作为催化剂， 然后加入邻苯二 胺或 4- 甲基邻苯二胺， 室温充分反应后， 蒸除反应溶剂后用乙酸乙酯萃取， 合并有机相， 洗 涤， 干燥， 过滤， 蒸除溶剂后硅胶柱色谱分离， 得到相应的苯甲酰胺 ； 2） 在冰浴条件下， 取代基为 R1的取代苯胺与氯乙酰氯在有机溶剂中充分混匀后， 室温 权 利 要 求 书 CN 103342665 A 2 2/2 页 3 搅拌充分反应 ； 反应完全后洗涤， 干燥， 过滤， 蒸除溶剂后硅胶柱色谱分离， 得到取代基为 R1 的取代氯乙酰苯胺 ； 3） 在有机溶剂中， 步骤 1） 制备的苯甲酰胺与取代氯乙酰苯胺充分混合， 无水碳酸钾存 在条件下， 加热回流。
8、发生成醚反应， 反应完成后洗涤， 干燥， 过滤， 蒸除溶剂后硅胶柱色谱分 离， 得到具有组蛋白去乙酰化酶抑制活性的苯甲酰胺类化合物。 9. 权利要求 1 所述的化合物在制备组蛋白去乙酰化酶抑制剂中的应用。 10. 权利要求 1 所述的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103342665 A 3 1/11 页 4 一种具有抑制组蛋白去乙酰化酶活性的化合物及其制备方 法 技术领域 0001 本发明涉及生物医药技术领域， 涉及一种抗肿瘤的化合物， 特别涉及一种具有抑 制组蛋白去乙酰化酶活性的化合物及其制备方法。 背景技术 0002 恶性肿瘤是当前严重影响人类健康， 威胁人类。
9、生命的主要疾病之一。世界卫生组 织的统计资料显示， 目前全世界每年约有数百万人死于恶性肿瘤， 其已经成为仅次于心脑 血管疾病的第二大人类疾病杀手。化学药物治疗作为治疗肿瘤的重要手段之一， 在近三十 年已经有了巨大的发展和进步， 得到了一大批具有不同作用机制的临床抗肿瘤药物。但是 抗肿瘤药仍存在许多不足之处， 例如毒副作用不可以控制， 快速产生耐药性等等， 这些都导 致化学药物无法达到预期的治疗效果。 因此新的抗肿瘤药物的研究与开发是目前药学领域 的热点和难点问题之一。 发明内容 0003 本发明解决的问题在于提供一种具有抑制组蛋白去乙酰化酶活性的化合 物及其制备方法， 包括异羟肟酸类和苯甲酰胺。
10、类， 作为组蛋白去乙酰化酶 (Histone Deacetylase,HDAC) 抑制剂， 在体外体现出很好的抗肿瘤活性， 能够应用于抗肿瘤药物的制 备。 0004 本发明是通过以下技术方案来实现 ： 0005 一种化合物， 其化学结构式为 ： 0006 0007 其中， R1为卤素、 三氟甲基或甲氧基， R2为羟胺、 2- 氨基苯胺或 4- 甲基 -2- 氨基苯 胺。 0008 所述的 R1为双取代， 取代基为卤素、 三氟甲基中的一种或两种。 0009 所述的双取代的取代基相邻或相间。 0010 所述的 R1为单取代， 取代基为卤素、 三氟甲基中的一种。 0011 所述的化合物的制备方法， 。
11、包括以下步骤 ： 0012 1） 阿魏酸与甲醇发生酯化反应， 得到阿魏酸甲酯 ； 0013 2） 取代基为 R1的取代苯胺与氯乙酰氯反应生成取代基为 R1的取代氯乙酰苯胺 ； 0014 3） 阿魏酸甲酯与取代氯乙酰苯胺发生成醚反应， 得到相应的取代的阿魏酸甲酯 ； 0015 4） 将取代的阿魏酸甲酯溶于有机溶剂， 加入 NH2OK/KOH 的甲醇溶液反应制备异羟 说 明 书 CN 103342665 A 4 2/11 页 5 肟酸， 待充分反应后得到具有组蛋白去乙酰化酶抑制活性的异羟肟酸类化合物。 0016 进一步， 具体包括以下步骤 ： 0017 1） 将阿魏酸溶于甲醇， 在浓硫酸催化作用下。
12、发生酯化反应， 得到阿魏酸甲酯 ； 0018 2） 在冰浴条件下， 取代基为 R1的取代苯胺与氯乙酰氯在有机溶剂中充分混匀后， 室温搅拌充分反应 ； 反应完全后洗涤， 干燥， 过滤， 蒸除溶剂后硅胶柱色谱分离， 得到取代基 为 R1的取代氯乙酰苯胺 ； 0019 3） 在有机溶剂中阿魏酸甲酯与取代氯乙酰苯胺充分混合， 无水碳酸钾存在条件 下， 加热回流发生成醚反应， 反应完成后洗涤， 干燥， 过滤， 蒸除溶剂后硅胶柱色谱分离， 得 到相应的取代的阿魏酸甲酯 ； 0020 4） 将取代的阿魏酸甲酯溶于无水 N,N- 二甲基甲酰胺， 加入 NH2OK/KOH 的甲醇溶 液， 室温搅拌充分反应， 反。
13、应完全后加入冰水并调 pH 至 2.0 ； 抽滤， 收集滤饼， 然后硅胶柱色 谱分离， 得到具有组蛋白去乙酰化酶抑制活性的异羟肟酸类化合物。 0021 所述的化合物的制备方法， 包括以下步骤 ： 0022 1） 阿魏酸与邻苯二胺或 4- 甲基邻苯二胺发生缩合反应， 生成相应的苯甲酰胺 ； 0023 2） 取代基为 R1的取代苯胺与氯乙酰氯反应生成取代基为 R1的取代氯乙酰苯胺 ； 0024 3） 步骤 1） 制备的苯甲酰胺与取代的氯乙酰苯胺发生成醚反应， 具有组蛋白去乙酰 化酶抑制活性的苯甲酰胺类化合物。 0025 进一步， 具体包括以下步骤 ： 0026 1） 将阿魏酸溶解于有机溶剂后， 加。
14、入 N,N- 羰基二咪唑作为催化剂， 然后加入邻 苯二胺或 4- 甲基邻苯二胺， 室温充分反应后， 蒸除反应溶剂后用乙酸乙酯萃取， 合并有机 相， 洗涤， 干燥， 过滤， 蒸除溶剂后硅胶柱色谱分离， 得到相应的苯甲酰胺 ； 0027 2） 在冰浴条件下， 取代基为 R1的取代苯胺与氯乙酰氯在有机溶剂中充分混匀后， 室温搅拌充分反应 ； 反应完全后洗涤， 干燥， 过滤， 蒸除溶剂后硅胶柱色谱分离， 得到取代基 为 R1的取代氯乙酰苯胺 ； 0028 3） 在有机溶剂中， 步骤 1） 制备的苯甲酰胺与取代氯乙酰苯胺充分混合， 无水碳酸 钾存在条件下， 加热回流发生成醚反应， 反应完成后洗涤， 干燥。
15、， 过滤， 蒸除溶剂后硅胶柱色 谱分离， 得到具有组蛋白去乙酰化酶抑制活性的苯甲酰胺类化合物。 0029 所述的化合物在制备组蛋白去乙酰化酶抑制剂中的应用。 0030 所述的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。 0031 与现有技术相比， 本发明具有以下有益的技术效果 ： 0032 本发明提供的具有抑制组蛋白去乙酰化酶活性的化合物， 包括两类 ： 异羟肟酸类 和苯甲酰胺类化合物， 所提供的化合物是新型的具有抗组蛋白去乙酰化酶活性的化合物， 其体外对组蛋白去乙酰化酶有很好的抑制活性 ； 而鉴于组蛋白去乙酰化酶在许多种癌症 中过度表达及其在癌细胞的周期、 分化、 凋亡、 侵袭和转移和血管生成过程中发挥。
16、的重要作 用， 以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂的抗肿瘤作用， 而且所提供的化合物表现出了相应的抗 肿瘤作用， 所提供的化合物可用于抗肿瘤药物的制备。 0033 本发明提供的具有抑制组蛋白去乙酰化酶活性的化合物的制备方法， 具有原料来 源易得， 反应条件温和， 反应过程操作简单， 所用试剂便宜易得的优点。 说 明 书 CN 103342665 A 5 3/11 页 6 附图说明 0034 图 1 为异羟肟酸类组蛋白去乙酰化酶抑制剂的合成路线图 ； 0035 图中标注的具体为 ： a: 无水甲醇 , 浓硫酸 ； b: 无水二氯甲烷 , 三乙胺 ;c: 无水碳 酸钾 , 无水丙酮 ； d: 羟胺钾 / 。
17、氢氧化钾 , 无水甲醇， 无水 N,N- 二甲基甲酰胺。 0036 图 2 为苯甲酰胺类组蛋白去乙酰化酶抑制剂的合成路线图 ； 0037 图中标注的具体为 ： e:N,N- 羰基二咪唑 , 无水四氢呋喃 , 邻苯二胺或 3,4- 二氨 基甲苯 , 三氟乙酸 ;f: 无水二氯甲烷， 三乙胺 ； g: 无水碳酸钾， 无水丙酮。 0038 其中， 化合物 1 为阿魏酸， 化合物 2 为阿魏酸甲酯， 化合物 3 为取代的苯胺， 化合 物 4 为氯乙酰氯， 化合物 5 为取代氯乙酰胺， 化合物 6 为取代的丙烯酸酯， 化合物为 7 为 异羟肟酸。化合物 8 为 (2E)-N-(2- 氨基苯基 )-3-(。
18、4- 羟基 -3- 甲氧基苯基 ) 丙烯酰胺或 (2E)-N-(2- 氨基 -4- 甲基苯基 )-3-(4- 羟基 -3- 甲氧基苯基 ) 丙烯酰胺， 化合物 9 为苯甲 酰胺系列目标化合物。 具体实施方式 0039 本发明提供一种具有抗肿瘤活性的组蛋白去乙酰化酶抑制剂， 包括异羟肟酸类和 苯甲酰胺类， 这些化合物在体外体现出组蛋白去乙酰化酶抑制活性， 能够应用于抗肿瘤药 物的制备。下面结合附图和实施例对本发明做详细的说明， 所述是对本发明的解释而不是 限定。 0040 本发明提供的具有组蛋白去乙酰化酶抑制活性的化合物， 其化学结构式为 ： 0041 0042 其中， R1为卤素、 三氟甲基或。
19、甲氧基， R2为羟胺、 2- 氨基苯胺或 4- 甲基 -2- 氨基苯 胺。 0043 具体的 R1为单取代或双取代， 当 R1为双取代时取代基相邻或相间。 0044 根据取代基的不同上述的化合物可以分为异羟肟酸类和苯甲酰胺类， 下面分别对 其制备和活性进行具体的说明。 0045 实施例 1 0046 该化合物的结构式中的 R1、 R2分别为 3， 5- 二三氟甲基和羟胺， 通过以下步骤制备 （参见图 1） ： 0047 1) 阿魏酸通过酯化反应制备阿魏酸甲酯 0048 将 6.8g(35mmol) 阿魏酸置于 250mL 的圆底烧瓶中， 加入 80mL 无水甲醇， 冰浴条 件下缓慢滴加 2mL。
20、 浓硫酸， 加热回流反应 ； 待反应完全后， 减压蒸除溶剂， 加入 100mL 冰水， 用固体碳酸氢钠调 pH 至 6， 用乙酸乙酯提取， 合并有机相， 饱和氯化钠洗涤， 无水硫酸钠干 燥， 过滤， 减压蒸除乙酸乙酯， 称取等量的硅胶拌样， 柱色谱分离， 得白色固体阿魏酸甲酯 6.54g， 产率 89.7。理化性质为 ： mp ： 62 63。 0049 2)3， 5-二三氟甲基苯胺和氯乙酰氯制备2-氯-N-(3,5-二三氟甲基苯基)乙酰胺 说 明 书 CN 103342665 A 6 4/11 页 7 0050 将 3， 5- 二三氟甲基苯胺 9.2g(40mmol) 置于 250mL 圆底。
21、烧瓶中， 加入 70mL 无水二 氯甲烷， 20mL无水三乙胺， 冰浴搅拌30min后， 逐滴加入3.84mL(48mmol)氯乙酰氯的无水二 氯甲烷溶液， 撤掉冰浴， 室温搅拌反应 ； 待反应完全后， 加入 150mL 二氯甲烷溶液稀释， 分别 用饱和氯化钠， 2mol/L 盐酸溶液， 水， 饱和碳酸氢钠洗涤， 无水硫酸钠干燥， 过滤， 减压蒸去 二氯甲烷， 称取等量的硅胶拌样， 柱色谱分离， 得浅黄色固体 2- 氯 -N-(3,5- 二三氟甲基苯 基 ) 乙酰胺 9.75g， 产率 76.87%。 0051 3) 阿魏酸甲酯与 2- 氯 -N-(3,5- 二三氟甲基苯基 ) 乙酰胺通过成醚。
22、反应制备 N-(3,5- 二三氟甲基苯基 )-2-2- 甲氧基 -4-(1E)-3- 氧代丁烯基 苯氧基 乙酰胺 0052 将阿魏酸甲酯 2.08g(10mmol) 置于 250mL 的圆底烧瓶中， 加入 70mL 无水丙酮将 其溶解， 加入 4.14g(30mmol) 无水碳酸钾， 再加入化合物 N-(3,5- 二三氟甲基苯基 )-2- 氯 乙酰胺 3.36g(11mmol)， 加热回流反应 ； 待反应完全后， 过滤除去无水碳酸钾， 减压蒸去 丙酮， 用乙酸乙酯提取， 饱和食盐水洗涤， 无水硫酸钠干燥， 过滤， 减压蒸去乙酸乙酯， 称 取等量的硅胶拌样， 柱色谱分离， 得白色固体 N-(3,。
23、5- 二三氟甲基苯基 )-2-2- 甲氧 基 -4-(1E)-3- 氧代丁烯基 苯氧基 乙酰胺 3.55g， 产率 72.75%。 0053 理化性质为 ： mp ： 167-168 C， MS(EI)M+:m/z=477.1。 0054 氢谱核磁共振数据 ： 1H NMR(400MHz,CDCl 3)ppm:8.13(s,2H),7.68(s,1H),7.66( d,J=8Hz,1H),7.17(d,J=8Hz,1H),7.15(s,1H),7.02(d,J=8Hz,1H),6.39(d,J=16Hz,1H),4. 73(s,2H),4.03(s,3H),3.84(s,3H). 0055 4。
24、)N-(3,5- 二三氟甲基苯基 )-2-2- 甲氧基 -4-(1E)-3- 氧代丁烯基 苯氧基 乙酰胺制备 (2E)-3-(4-2-(3,5- 二三氟甲基苯基 ) 氨基 -2- 氧代乙氧基 -3- 甲氧基苯 基 )-N- 羟基丙烯酰胺 0056 将化合物 N-(3,5- 二三氟甲基苯基 )-2-2- 甲氧基 -4-(1E)-3- 氧代丁烯基 苯 氧基乙酰胺2.39g(5mmol)置于圆底烧瓶中， 加入7mL无水DMF溶解， 加入新配制的NH2OK/ KOH 的甲醇溶液 （其配制为 ： 将盐酸羟胺 1.74g(25mmol) 溶于 9.8mL 的无水甲醇中， 再加入 氢氧化钾 2.8g(50m。
25、mol) 的 7.5mL 甲醇溶液） ， 室温搅拌反应 72 小时， 待反应完全后， 加入冰 水， 用 2mol/L 的盐酸溶液调 pH 至 2， 有黄色固体析出， 抽滤， 滤饼烘干， 滤液用乙酸乙酯提 取， 无水硫酸钠干燥， 过滤， 减压蒸出溶剂， 与滤饼合并， 称取等量的硅胶拌样， 柱色谱分离， 得浅黄色固体 1.2g， 产率 49.18%。 0057 所得化合物的结构如图所示 ： 0058 0059 其理化性质为 ： mp ： 183-185， MS(EI)M+:m/z=478.1。 0060 氢谱核磁共振数据 ： 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)ppm:8.17(s,1H。
26、),8.04(s,1H),7.6 9(s,1H),7.41(d,J=16Hz,1H),7.23(s,1H),7.11(d,J=8Hz,1H),6.96(d,J=8Hz,1H),6.37(d ,J=16Hz,1H),4.78(s,2H),3.84(s,3H). 说 明 书 CN 103342665 A 7 5/11 页 8 0061 实施例 2 0062 该化合物的结构式中的 R1、 R2分别为 3- 氯 -4- 氟和羟胺， 制备方法为 ： 0063 将实施实例 1 中的 3， 5- 二三氟甲基苯胺用 3- 氯 -4 氟甲基苯胺替换， 其他制备方 法相同。 0064 所得中间体为 N-(3- 氯。
27、 -4- 氟苯基 )-2-2- 甲氧基 -4-(1E)-3- 氧代丁烯基 苯 氧基 乙酰胺， 该化合物的结构如图所示 ： 0065 0066 理化性质 ： mp ： 156-158 C， MS(EI)M+:m/z=393.1。 0067 氢谱核磁共振数据 ： 1H NMR(400MHz,CDCl 3)ppm:7.80(d,J=8Hz,1H),7.66(d,J=1 6Hz,1H),7.43(d,J=12Hz,1H),7.29(s,1H),7.17(s,1H),7.14(d,J=8Hz,1H),6.98(d,J=8Hz ,1H),6.39(d,J=16Hz,1H),4.69(s,2H),4.00(。
28、s,3H),3.84(s,3H). 0068 目标化合物为 (2E)-3-(4-2-(3- 氯 -4- 氟苯基 ) 氨基 -2- 氧代乙氧基 -3- 甲 氧基苯基 )-N- 羟基丙烯酰胺， 化合物的结构如图所示 ： 0069 0070 理化性质 ： mp ： 177-179， MS(EI)M+:m/z=394.1。 0071 氢谱核磁共振数据 ： 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)ppm:7.95(d,J=8Hz,1H),7.54(d,J =8Hz,1H),7.41(d,J=8Hz,1H),7.38(s,1H),7.22(s,1H),7.11(d,J=8Hz,1H),6.97(d,。
29、J=8Hz ,1H),6.37(d,J=16Hz,1H),4.74(s,2H),3.84(s,3H). 0072 实施例 3 0073 该化合物的结构式中的 R1、 R2分别为 3- 溴 -5- 三氟甲基和 2- 氨基苯胺， 通过以下 步骤制备 （参见图 2） ： 0074 1) 阿魏酸与邻苯二胺通过缩合反应制备 (2E)-N-(2- 氨基苯基 )-3-(4- 羟 基 -3- 甲氧基苯基 ) 丙烯酰胺 0075 将 5.83g(30mmol) 阿魏酸置于 250mL 的圆底烧瓶中， 加入 120mL 的无水四氢呋喃 溶解， 逐滴加入溶于无水四氢呋喃的 N,N- 羰基二咪唑 （CDI， 作为催化。
30、剂） 5.35g(33mmol)， 室温搅拌 1h， 再加入邻苯二胺 25.96g(240mmol)， 室温反应 16h ； 待反应完全后， 减压蒸除 溶剂， 用 300mL 乙酸乙酯提取， 合并有机相， 分别用水， 饱和碳酸氢钠， 饱和氯化钠洗涤， 无 水硫酸钠干燥， 过滤， 减压整除乙酸乙酯， 称取等量的硅胶拌样， 柱色谱分离， 得白色固体 6.87g， 产率 80.53。 0076 理化性质为 ： mp ： 164-166， MS(EI)M+:m/z=284.1。 说 明 书 CN 103342665 A 8 6/11 页 9 0077 氢谱核磁共振数据 ： 1 H N M R ( 4 。
31、0 0 M H z , C D C l 3) ppm:7.70(d,J=16Hz,1H),7.35(s,1H),7.127.09(m,2H),7.08(d,J=12Hz,1H),6.95(d, J=8Hz,1H),6.86(d,J=4Hz,2H),6.49(d,J=8Hz,1H),3.96(s,3H). 0078 2)3- 溴 -5- 三氟甲基苯胺制备 2- 氯 -N-(3- 溴 -5- 三氟甲基苯基 ) 乙酰胺 0079 将 3- 溴 -5- 三氟甲基苯胺 9.6g(40mmol) 置于 250mL 圆底烧瓶中， 加入 70mL 无水 二氯甲烷， 20mL无水三乙胺， 冰浴搅拌30min后，。
32、 逐滴加入3.84mL(48mmol)氯乙酰氯的无水 二氯甲烷溶液， 撤掉冰浴， 室温搅拌反应 ； 待反应完全后， 加入 150mL 二氯甲烷溶液稀释， 分 别用饱和氯化钠， 2mol/L 盐酸溶液， 水， 饱和碳酸氢钠洗涤， 无水硫酸钠干燥， 过滤， 减压蒸 去二氯甲烷， 称取等量的硅胶拌样， 柱色谱分离， 得白色固体 2- 氯 -N-(3- 溴 -5- 三氟甲基 苯基 ) 乙酰胺 10.54g， 产率 83.26。 0080 3)(2E)-N-(2- 氨 基 苯 基 )-3-(4- 羟 基 -3- 甲 氧 基 苯 基 ) 丙 烯 酰 胺 与 2- 氯 -N-(3- 溴 -5- 三氟甲基苯基。
33、 ) 乙酰胺发生成醚反应， 制备 (2E)-N-(2- 氨基苯 基 )-3-3- 甲氧基 -4-(2- 氧 -2-3- 溴 -5- 三氟甲基苯基 氨基 乙氧基 ) 苯基 丙烯 酰胺 0081 将 1) 中 所 得 (2E)-N-(2- 氨 基 苯 基 )-3-(4- 羟 基 -3- 甲 氧 基 苯 基 ) 丙 烯 酰胺 1.43g(5mmol) 置于 250mL 的圆底烧瓶中， 加入 70mL 无水丙酮将其溶解， 加入 2.07g(15mmol) 无水碳酸钾， 再加入 2) 所得化合物， 加热回流反应 ； 待反应完全后， 过滤除 去无水碳酸钾， 减压蒸去丙酮， 用乙酸乙酯提取， 饱和食盐水洗涤。
34、， 无水硫酸钠干燥， 过滤， 减压蒸去乙酸乙酯， 称取等量的硅胶拌样， 柱色谱分离， 得白色固体 1.67g， 产率 56.41。 0082 所得化合物的结构如图所示 ： 0083 0084 理化性质 ： mp ： 209-211 C， MS(EI)M+:m/z=563.0。 0085 氢谱核磁共振数据 ： 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)ppm:8.18(s,1H),8.05(s,1H),7.6 9(s,1H),7.51(d,J=16Hz,1H),7.32(d,J=16Hz,2H),7.16(s,1H),7.016.92(m,2H),6.79( d,J=16Hz,2H),6.5。
35、8(d,J=4Hz,1H),4.81(s,2H),3.87(s,3H). 0086 实施例 4 0087 该化合物的结构式中的 R1、 R2分别为 4- 甲氧基和 2- 氨基苯胺， 制备方法为 ： 0088 将实施实例 3 中的 3- 溴 -5- 三氟甲基苯胺用 4- 甲氧基苯胺替换， 其他制备方法 相同。 0089 所得化合物为 (2E)-N-(2- 氨基苯基 )-3-3- 甲氧基 -4-(2- 氧 -2-4- 甲氧基苯 基 氨基 乙氧基 ) 苯基 丙烯酰胺， 结构如图所示 ： 0090 说 明 书 CN 103342665 A 9 7/11 页 10 0091 理化性质 ： 189-191。
36、 C， MS(EI)M+:m/z=447.1. 0092 氢谱核磁共振数据 ： 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)ppm:7.54(d,J=12Hz,2H),7.51(d, J=12Hz,1H),7.35(d,J=8Hz,1H),7.28(s,1H),7.18(d,J=8Hz,1H),7.016.95(m,2H),6.91 (d,J=8Hz,2H),6.80(d,J=16Hz,2H),6.65(d,J=8Hz,1H),4.72(s,2H),3.88(s,3H),3.73(s, 3H). 0093 实施例 5 0094 该化合物的结构式中的 R1、 R2分别为 3- 三氟甲基和 4-。
37、 甲基 -2- 氨基苯胺， 制备方 法为 （参见图 2） ： 0095 1) 阿魏酸与 4- 甲基邻苯二胺通过缩合反应制备 (2E)-N-(2- 氨基 -4- 甲基苯 基 )-3-(4- 羟基 -3- 甲氧基苯基 ) 丙烯酰胺 0096 将 5.83g(30mmol) 阿魏酸置于 250mL 的圆底烧瓶中， 加入 120mL 的无水四氢呋喃 溶解， 逐滴加入溶于无水四氢呋喃的 N,N- 羰基二咪唑 （CDI， 作为催化剂） 5.35g(33mmol)， 室温搅拌 1h， 再加入 4- 甲基邻苯二胺 29.4g(240mmol)， 室温反应 16h ； 待反应完全后， 减压 蒸除溶剂， 用300。
38、mL乙酸乙酯提取， 合并有机相， 分别用水， 饱和NaHCO3， 饱和氯化钠洗涤， 无 水硫酸钠干燥， 过滤， 减压整除乙酸乙酯， 柱色谱分离， 得白色固体 7.1g， 产率 79.32。 0097 理化性质为 ： mp ： 174-176 C， MS(EI)M+:m/z=298.1。 0098 氢谱核磁共振数据 ： 1H NMR(400MHz,CDCl 3)ppm:7.44(d,J=16Hz,1H),7.19(d,J= 8Hz,1H),7.18(s,1H),7.05(d,J=8Hz,1H),6.82(d,J=8Hz,1H),6.69(d,J=16Hz,1H),6.56(s ,1H),6.39。
39、(d,J=8Hz,1H),3.83(s,3H),2.17(s,3H). 0099 2)3- 三氟甲基苯胺和氯乙酰氯制备 2- 氯 -N-(3- 三氟甲基苯胺苯基 ) 乙酰胺 0100 将 3- 三氟甲基苯胺 6.5g(40mmol) 置于 250mL 圆底烧瓶中， 加入 70mL 无水二氯甲 烷， 20mL无水三乙胺， 冰浴搅拌30min后， 逐滴加入3.84mL(48mmol)氯乙酰氯的无水二氯甲 烷溶液， 撤掉冰浴， 室温搅拌反应 ； 待反应完全后， 加入 150mL 二氯甲烷溶液稀释， 分别用饱 和氯化钠， 2mol/L 盐酸溶液， 水， 饱和碳酸氢钠洗涤， 无水硫酸钠干燥， 过滤， 减。
40、压蒸去二氯 甲烷， 称取等量的硅胶拌样， 柱色谱分离， 得白色固体 2- 氯 -N-(3- 三氟甲基苯基 ) 乙酰胺 7.81g， 产率 82.36。 0101 3)(2E)-N-(2- 氨基 -4- 甲基苯基 )-3-(4- 羟基 -3- 甲氧基苯基 ) 丙烯酰胺与 2- 氯 -N-(3- 三氟甲基苯基 ) 乙酰胺发生成醚反应， 制备 (2E)-N-(2- 氨基 -4- 甲基苯 基 )-3-(4-2-(3- 三氟甲基苯基 ) 氨基 -2- 氧代乙氧基 -3- 甲氧基苯基 ) 丙烯酰胺 0102 将 1) 中所得 (2E)-N-(2- 氨基 -4- 甲基苯基 )-3-(4- 羟基 -3- 甲氧。
41、基苯基 ) 丙烯酰胺 1.50g(5mmol) 置于 250mL 的圆底烧瓶中， 加入 70mL 无水丙酮将其溶解， 加入 2.07g(15mmol) 无水碳酸钾， 再加入 2) 所得化合物， 加热回流反应 ； 待反应完全后， 过滤除 去无水碳酸钾， 减压蒸去丙酮， 用乙酸乙酯提取， 饱和食盐水洗涤， 无水硫酸钠干燥， 过滤， 减压蒸去乙酸乙酯， 称取等量的硅胶拌样， 柱色谱分离， 得白色固体 1.36g， 产率 54.31。 说 明 书 CN 103342665 A 10 8/11 页 11 0103 所得化合物的结构如图所示 ： 0104 0105 理化性质为 ： mp ： 200-202。
42、 C， MS(EI)M+:m/z=499.1。 0106 氢谱核磁共振数据 ： 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)ppm:7.84(d,J=8Hz,1H),7.77(d,J =8Hz,1H),7.60(d,J=8Hz,1H),7.58(d,J=8Hz,1H),7.51(s,1H),7.28(s,1H),7.17(d,J=12H z,1H),7.087.05(m,1H),7.00(d,J=8Hz,1H),6.78(d,J=16Hz,1H),6.56(s,1H),6.39(d,J =8Hz,1H),4.76(s,2H),3.85(s,3H),2.17(s,3H). 0107 实施例 6。
43、 0108 该化合物的结构式中的 R1、 R2分别为 2- 氟和 4- 甲基 -2- 氨基苯胺， 制备方法为 ： 将实施实例 5 中的 3- 三氟甲基苯胺用 2- 氟苯胺替换， 其他制备方法相同。 0109 所得目标化合物为 (2E)-N-(2- 氨基 -4- 甲基苯基 )-3-(4-2-(2- 氟苯基 ) 氨 基 -2- 氧代乙氧基 -3- 甲氧基苯基 ) 丙烯酰胺， 结构如图所示 ： 0110 0111 理化性质 ： mp ： 187-189 C， MS(EI)M+:m/z=449.1。 0112 氢谱核磁共振数据 ： 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)ppm:7.96(s,1。
44、H),7.49(d,J=16Hz,2H), 7.337.28(m,2H),7.20(d,J=8Hz,2H),7.18(d,J=8Hz,1H),7.03(d,J=8Hz,1H),6.79(d,J= 16Hz,1H),6.56(s,1H),6.39(d,J=8Hz,1H),4.83(s,2H),3.88(s,3H),2.17(s,3H). 0113 实施例 7 测定化合物对组蛋白去乙酰化酶的抑制活性 ： 0114 测定方法具体如下 ： 0115 选用Enzo Life Sciences公司的HDAC抑制活性紫外检测试剂盒(Color-de-LysTM HDAC colorimetric activ。
45、ity assay kit-BML-AK501)检测目标化合物的抑酶活性， 操作方 法按照试剂盒说明进行。首先将酶， 底物和显色剂用缓冲液分别稀释 2 倍， 100 倍， 40 倍以 备使用。将样品和阳性对照药 (SAHA) 用缓冲液分别制备 20g/mL， 4g/mL， 0.8g/mL， 0.16g/mL 的浓度梯度。于 96 孔板上每孔依次加入 10L 缓冲液， 10L 样品溶液， 5L 酶溶液和25L底物溶液;空白孔加25L缓冲液和25L底物溶液 ； 对照孔加20L缓冲 液， 5L 酶溶液和 25L 底物溶液。加毕， 37下孵育 30min ； 加入显色剂 50L， 再在 37 下孵育1。
46、5min， 静置后在酶标仪上波长为405nm下读取吸光值， 计算化合物对HDAC的抑制率 和 IC50。 0116 化合物对组蛋白去乙酰化酶抑制活性的结果， 如表 1 所示 ： 0117 表 1. 目标化合物对组蛋白去乙酰化酶的抑制活性结果 (IC50) 说 明 书 CN 103342665 A 11 9/11 页 12 0118 0119 0120 0121 HDACs 各亚型在许多种癌症中过度表达及其在癌细胞的周期、 分化、 凋亡、 侵袭和 转移和血管生成过程中发挥的重要作用， 证明 HDACs 与癌症的发生发展密切相关。组蛋白 去乙酰化酶抑制剂通过抑制 HDACs 的活性能够有效地抑制癌。
47、细胞的增殖， 诱导癌细胞分化 和凋亡， 从而达到治疗肿瘤的目的。 说 明 书 CN 103342665 A 12 10/11 页 13 0122 实施例 8 组蛋白去乙酰化酶抑制剂抗肿瘤活性筛选 0123 采用 MTT 法检验待测组蛋白去乙酰化酶抑制剂对肿瘤细胞的生长抑制活性 ： 0124 本发明提供的组蛋白去乙酰化酶抑制剂具有抗肿瘤作用， 对肿瘤细胞有体外抑制 增殖活性， 在乳腺癌细胞(MDA-MB-231)， 乳腺癌细胞(MCF-7)， 宫颈癌细胞(Hela)细胞系中 具有抑制肿瘤细胞的增殖活性， 可以用于对这些癌症的治疗 ； 与阳性药 SAHA 相比， 个别化 合物显示了更高的抑制肿瘤细。
48、胞增殖活性。 0125 将处于对数生长期的乳腺癌细胞 (MDA-MB-231)， 乳腺癌细胞 (MCF-7)， 宫颈癌细 胞 (Hela)， 用 0.25% 的胰酶消化 3 5 分钟， 吹打均匀后稀释成浓度为 5103 1104个 /mL 的单细胞悬液， 平行接种于 96 孔培养板中， 每孔接种体积为 200L ； 于 37， 5%CO2培 养箱中培养 24 个小时 ； 0126 孔中加入 20uL 不同浓度化合物的培养基， 使孔中化合物的终浓度为 ： 200ug/ mL;50ug/L;12.5ug/L;3.125ug/L， 每个浓度设 3 个复孔， 加细胞不加化合物的孔作对照孔， SAHA 作化合物阳性对照， 继续培养 48 个小时 ； 0127 洗掉孔中培养基， 向孔中加入100uLMTT， 使孔中MTT的终浓度0.5mg/mL， 37培养 箱孵育4小时后取出， 小心吸弃培养液， 每孔加入150LDMSO， 振荡15min， 酶联免疫法检测 仪测量各孔490nm处紫外吸收值(OD值)， 然后计算细胞抑制率， 并根据抑制率求出IC50值 ； 细胞抑制率的计算公式为 ： 0128。