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1、(10)申请公布号 CN 104174019 A (43)申请公布日 2014.12.03 CN 104174019 A (21)申请号 201410324895.4 (22)申请日 2014.09.23 A61K 39/385(2006.01) A61K 39/116(2006.01) A61K 47/48(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (71)申请人 成都康华生物制品有限公司 地址 610100 四川省成都市国家经济技术开 发区北京路 182 号 (72)发明人 侯文礼 (54) 发明名称 四价脑膜炎球菌多糖载体蛋白结合疫苗 (57) 摘要 本发明公开了一种四价。
2、脑膜炎球菌多糖载体 蛋白结合疫苗， 包括 ： 脑膜炎球菌荚膜多糖与载 体蛋白的化学偶联物、 免疫活化剂和佐剂， 该免疫 活性剂为寡聚脱氧核苷酸， 其序列中含有两个拷 贝的 5 CGTTCGAG3 ； 所述寡聚脱氧核苷酸的 长度为 1838 个核苷酸。本发明可以提高疫苗的 免疫效果、 降低疫苗抗原的用量、 减少免疫针次和 降低疫苗成本的脑膜炎球菌疫苗。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104174019 A CN 104174019。
3、 A 1/1 页 2 1. 一种四价脑膜炎球菌多糖载体蛋白结合疫苗， 包括 ： A 群脑膜炎球菌荚膜多糖与载体蛋白的化学偶联物 ； C 群脑膜炎球菌荚膜多糖与载体蛋白的化学偶联物 ； Y 群脑膜炎球菌荚膜多糖与载体蛋白的化学偶联物 ； W135 群脑膜炎球菌荚膜多糖与载体蛋白的化学偶联物 ； 免疫活性剂， 该免疫活性剂为寡聚脱氧核苷酸， 其序列中含有两个拷贝的 5 CGTTCGAG3 ； 所述寡聚脱氧核苷酸的长度为 1838 个核苷酸 ； 其中 CpG 是非甲基化的 ； 佐剂， 该佐剂包括氢氧化铝和乳糖。 2. 如权利要求 1 所述的疫苗， 其特征在于 ： 所述化学偶联物是脑膜炎球菌血清群 A。
4、 群、 C群、 Y群和W135群中的一种或多种荚膜多糖与破伤风类毒素、 白喉类毒素或其它任何适用 于人用疫苗的载体蛋白的化学偶联物。 3. 如权利要求 1 所述的疫苗， 其特征在于 ： 所述免疫活性剂的核苷酸序列为 5 TCGC CGTTCGAG CCTA CGTTCGAG CTTG3 。 4. 如权利要求 1 所述的疫苗， 其特征在于 ： 所述免疫活性剂的核苷酸序列为 5 TTCTGAC CGTTCGAG TGCACTA CGTTCGAG CAGTTG3 。 5. 如权利要求 1 所述的疫苗， 其特征在于 ： 每支疫苗中脑膜炎球菌加膜多糖与载体蛋 白的化学偶联物总含量为 10ug100ug，。
5、 每支疫苗中佐剂中含量为 1mg100mg。 6. 如权利要求 1 所述的疫苗， 其特征在于 ： 进一步包括药学上可接受的赋形剂。 权 利 要 求 书 CN 104174019 A 2 1/3 页 3 四价脑膜炎球菌多糖载体蛋白结合疫苗 技术领域 0001 本发明涉及生物接种疫苗， 具体涉及到一种四价脑膜炎球菌多糖载体蛋白结合疫 苗。 背景技术 0002 流行性脑脊髓膜炎， 是由脑膜炎双球菌感染脑膜或者脑脊髓膜引起的呼吸道传染 病， 临床表现主要有高烧、 头痛、 喷射状呕吐、 脖子发硬。也可引起败血症， 皮肤出现紫色淤 血、 瘀斑， 脑膜炎会引起脑部损伤而遗留听力下降或耳聋、 智力低下等后遗症。
6、。病死率在 5% 10%。流脑冬春季节病例高发， 一般 11 12 月份病例开始增多， 第二年的 2 5 月份 为发病高峰期。该病是发病率高， 危险性大， 是严重危害儿童健康的传染病。根据荚膜多糖 的化学结构， 脑膜炎球菌可分为十几个血清群， 其中A、 B、 C、 Y和W135是最主要的流行菌群。 接种疫苗是预防流脑的主要途径。 0003 用脑膜炎球菌荚膜多糖制备的疫苗具有一定的预防效果， 但它是一种 T 细胞非依 赖性抗原， 对 2 岁以下的婴幼儿免疫效果很差， 而且不能诱生免疫记忆。与载体蛋白偶联可 以将多糖抗原转变为 T 细胞依赖性抗原， 不但对婴幼儿有效， 而且能诱生免疫记忆。但是这 。
7、种多糖蛋白结合疫苗的生产工艺比较复杂， 产量较低， 价格较贵， 远远不能满足计划免疫的 大规模需求。因此， 有必要研制一种新型的脑膜炎球菌疫苗。 0004 为了解决现有技术中的上述不足， 本发明提出了一种新的解决方案。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种四价脑膜炎球菌多糖载体蛋白结合疫苗。 0006 为达上述目的， 本发明所采用的技术方案是 ： 提供一种四价脑膜炎球菌多糖载体 蛋白结合疫苗， 包括 ： A群脑膜炎球菌荚膜多糖与载体蛋白的化学偶联物 ； C群脑膜炎球菌 荚膜多糖与载体蛋白的化学偶联物 ； Y 群脑膜炎球菌荚膜多糖与载体蛋白的化学偶联物 ； W135 群脑膜炎球菌荚膜多糖与。
8、载体蛋白的化学偶联物 ； 免疫活性剂， 该免疫活性剂为寡聚脱氧核苷酸， 其序列中含有两个拷贝的 5 CGTTCGAG3 ； 所述寡聚脱氧核苷酸的长度为 1838 个核苷酸 ； 其中 CpG 是非甲基化的 ； 佐 剂， 该佐剂包括氢氧化铝和乳糖。 0007 本发明的一个实施方案中， 提供了一种可以提高疫苗的免疫效果、 降低疫苗抗原 的用量、 减少免疫针次和降低疫苗成本的脑膜炎球菌疫苗。 附图说明 0008 图 1 为实验例 1 中 A1 疫苗和 B1 疫苗产生特异性抗体的抗体滴度 ； 图 2 为实验例 2 中 A2 疫苗和 B2 疫苗产生特异性抗体的抗体滴度 ； 图 3 为实验例 1 和实验例 。
9、2 中疫苗产生的特异性抗体的特异性 ； 其中， 带有三角形的曲线为实验例 2 中 B2 组疫苗产生的特异性抗体的特异性曲线， 带 说 明 书 CN 104174019 A 3 2/3 页 4 有正方形的曲线为实验例 1 中 B1 组疫苗产生的特异性抗体的特异性曲线。 具体实施方式 0009 本发明的一个实施方案中， A 群、 C 群、 Y 群和 W135 群脑膜炎球菌， 这四种脑膜炎球 菌的荚膜多糖与载体蛋白的结合是通过以下方法来实现的 ： 步骤 1 ： 分别将四种脑膜炎球菌多糖进行活化反应与衍化反应， 在反应时， 首先使用溴 化氰活化脑膜炎球菌多糖， 然后用乙二胺衍化溴化氰活化的脑膜炎球菌多。
10、糖， 最后用试剂 衍化多糖。 0010 步骤 2 ： 载体蛋白的巯基化， 所用到的巯基化试剂包括但不限于 2- 亚氨基硫烷。 0011 步骤 3 ： 衍化的脑膜炎球菌多糖与巯基化的载体蛋白结合。 0012 脑膜炎球菌加膜多糖与载体蛋白的偶联方法已经被多个文献公开， 因此， 该耦联 方法不仅限于本发明公开的方法， 采用其他偶联方法同样可以达到本发明的实施目的。 0013 在本发明的另一个实施方案中， 脑膜炎球菌荚膜多糖与载体蛋白的化学偶联物优 选是脑膜炎球菌血清群 A 群、 C 群、 Y 群和 W135 群中的一种或多种荚膜多糖与破伤风类毒素 或白喉类毒素或其它任何适用于人用疫苗的载体蛋白的化学。
11、偶联物。 此处的破伤风类毒素 或白喉类毒素均是示意性地说明本发明的， 并不构成对本发明的任何限制， 任何适用于人 用疫苗的载体蛋白都适用于本发明 本发明的一个实施方案中， 免疫活性剂为寡聚脱氧核苷酸， 其序列中含有两个拷贝 的 5CGTTCGAG3 ； 所述寡聚脱氧核苷酸的长度为 1838 个核苷酸 ； 其中 CpG 是非甲 基化的。优化的， 免疫活性剂的核苷酸序列为 5TCGC CGTTCGAG CCTA CGTTCGAG CTTG3 。进一步优化的， 免疫活性剂的核苷酸序列为 5 TTCTGAC CGTTCGAG TGCACTA CGTTCGAG CAGTTG3 。在实施本方案时， 可以按。
12、照现有的任一方法制备四价脑膜炎球菌 加膜多糖， 然后与可以接收的载体蛋白结合， 结合和可以将偶联物与免疫活性剂和佐剂简 单混合， 制得疫苗。 0014 本发明的一个实施方案中， 每支疫苗中脑膜炎球菌加膜多糖与载体蛋白的化学偶 联物总含量为 10ug100ug， 每支疫苗中佐剂中含量为 1mg100mg。 0015 本发明的一个实施方案中， 每支疫苗中还包括药学上可接受的赋形剂， 比如冻干 赋形剂、 成型剂等。 0016 实验例 1 结合疫苗对小鼠 A 群脑膜炎球菌免疫应答的增强效果研究 通过现有技术制备四价脑膜炎球菌多糖与破伤风内毒素的化学偶联物， 以下简称该偶 联物为疫苗 A1， 在疫苗 A。
13、1 中加入佐剂氢氧化铝和免疫活性剂， 得到疫苗 B1。疫苗 A1 中， A 群、 C 群、 Y 群和 W135 群的多糖含量相同， 且多糖总含量为 80ug/ml ； 疫苗 B1 中多糖总含 量为 80ug/ml， 佐剂氢氧化铝的含量为 5mg/ml。疫苗 B1 中的免疫活性剂序列为 5TCGC CGTTCGAG CCTA CGTTCGAG CTTG3 。 经过人工合成， 并进行全链硫代修饰， 聚丙烯酰胺 凝胶电泳纯化， 溶于生理盐水， 零下 20的条件下保存备用。 0017 选取试验小鼠， 分成两组， 即疫苗 A1 组和疫苗 B1 组 ； 分别注射 80ul 进行免疫应 答实验， 在注射 3。
14、 周后， 以同样方式和同等剂量进行再免疫， 此时采集小鼠采集血液分离血 清， 并在再免疫 2 周后再次采集血液分离血清。将分离的血清分别采用 PBS 溶液对血清进 说 明 书 CN 104174019 A 4 3/3 页 5 行 3 倍稀释， 采用 ELISA 方法来检测抗体滴度。 0018 如图 1 所示， 在注射疫苗 3 周和再免疫注射 2 周后， 注射疫苗 A1 的疫苗 A1 组产生 的抗多糖 IgG 滴度在注射 3 周后和 2 周后均较弱。相反的， 注射加入疫苗活性剂和佐剂的 疫苗 B1 组的抗多糖 IgG 滴度明显增加， 与疫苗 A1 组相比， 在注射 3 周后的疫苗 B1 组的 I。
15、gG 滴度与同期的疫苗 A1 相比增加了 15.2 倍 ； 再免疫注射两周后， 疫苗 B1 组的 IgG 滴度相比 同期的疫苗 A1 的 IgG 滴度增加了 10.5 倍。这表明， 在注射疫苗后， 疫苗 B1 能够快速产生 免疫应答， 并可以诱导产生较高的抗体滴度， 免疫效果增强。 0019 实验例 2 结合疫苗对小鼠 C 群脑膜炎球菌免疫应答的增强效果研究 通过现有技术制备四价脑膜炎球菌多糖与白喉内毒素的化学偶联物， 以下简称该偶联 物为疫苗 A2， 在疫苗 A2 中加入佐剂氢氧化铝和免疫活性剂， 得到疫苗 B2。疫苗 A2 中， A 群、 C 群、 Y 群和 W135 群的多糖含量相同， 。
16、且多糖总含量为 100ug/ml ； 疫苗 B2 中多糖总含量为 100ug/ml， 佐剂氢氧化铝的含量为 5mg/ml。疫苗 B2 中的免疫活性剂序列为 5TTCTGAC CGTTCGAG TGCACTA CGTTCGAG CAGTTG3 。经过人工合成， 并进行全链硫代修饰， 聚丙 烯酰胺凝胶电泳纯化， 溶于生理盐水， 零下 20的条件下保存备用。 0020 选取试验小鼠， 分成两组， 即疫苗 A2 组和疫苗 B2 组 ； 分别注射 80ul 进行免疫应 答实验， 在注射 3 周后， 以同样方式和同等剂量进行再免疫， 此时采集小鼠采集血液分离血 清， 并在再免疫 2 周后再次采集血液分离血。
17、清。将分离的血清分别采用 PBS 溶液对血清进 行 3 倍稀释， 采用 ELISA 方法来检测抗体滴度。 0021 如图 2 所示， 在注射疫苗 3 周和再免疫注射 2 周后， 注射疫苗 A2 的疫苗 A2 组产生 的抗多糖 IgG 滴度在注射 3 周后和 2 周后均较弱。相反的， 注射加入疫苗活性剂和佐剂的 疫苗 B2 组的抗多糖 IgG 滴度明显增加， 与疫苗 A2 组相比， 在注射 3 周后的疫苗 B2 组的 IgG 滴度与同期的疫苗 A2 相比增加了 15.2 倍 ； 再免疫注射两周后， 疫苗 B2 组的 IgG 滴度相比 同期的疫苗 A2 的 IgG 滴度增加了 10.5 倍。这表明。
18、， 在注射疫苗后， 疫苗 B2 能够快速产生 免疫应答， 并可以诱导产生较高的抗体滴度， 免疫效果增强。 0022 实验例 3 多糖特异性抗体的特异性 将接种 B1 疫苗的疫苗组和 B2 疫苗的疫苗组的小鼠血浆稀释 200 倍。向 2 种稀释的小 鼠血浆分别加入 A 群脑膜炎多糖和 C 群脑膜炎多糖， 用 ELISA 方法检测小鼠血浆中抗多糖 的抗体水平。如图 3 所示， 随着多糖加入量的增加， 多糖特异性抗体结合 96 孔板中包被多 糖的能力逐渐降低。当加入的多糖达到 15 微克时， 两组血浆的抗体结合多糖的能力丧失。 这表明小鼠产生的抗多糖抗体能够特异性地结合多糖。 说 明 书 CN 104174019 A 5 1/2 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104174019 A 6 2/2 页 7 图 3 说 明 书 附 图 CN 104174019 A 7 。