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1、(10)申请公布号 CN 103989689 A (43)申请公布日 2014.08.20 CN 103989689 A (21)申请号 201410242073.1 (22)申请日 2014.05.28 A61K 31/635(2006.01) A61P 11/00(2006.01) (71)申请人 滨州医学院 地址 264003 山东省烟台市莱山区观海路 346 号 (72)发明人 蒋王林 纪云霞 亢泽春 徐洋 (54) 发明名称 地瑞那韦乙醇盐在制备预防或治疗急性肺损 伤 / 急性呼吸窘迫综合征和肺纤维化的药物中的 应用 (57) 摘要 本发明提供了地瑞那韦乙醇盐的药物新用 途， 具体涉。
2、及地瑞那韦乙醇盐通过抑制 I 型肺泡 上皮细胞凋亡， 促进 I 型肺泡上皮细胞的糖基化 终产物受体(receptor for advanced glycation endproducts， RAGE) 的表达从而抑制急性肺损 伤 / 急性呼吸窘迫综合征 (ALI/ARDS) 和肺纤维 化的发生发展， 以致于预防或治疗 ALI/ARDS 和肺 纤维化。在上述应用中， 其注射使用剂量范围是 120mg2400mg ； 优选2401200mg ； 口服使用剂 量范围是 120mg 6000mg ； 优选 240 3000mg。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 (19)中华。
3、人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 (10)申请公布号 CN 103989689 A CN 103989689 A 1/1 页 2 1. 本发明提供了地瑞那韦乙醇盐在制备预防或治疗 ALI/ARDS 和肺纤维化的药物中的 应用。 2.根据权利要求1所述的应用， 地瑞那韦乙醇盐是通过抑制I型肺泡上皮细胞凋亡， 增 加 I 型肺泡上皮细胞 RAGE 表达到预防或治疗 ALI/ARDS 和肺纤维化的药物中的应用。 3. 根据权利要求 2 所述的应用， 地瑞那韦乙醇盐可预防或治疗 ALI/ARDS。 4. 根据权利要求 2 所述的应用， 地瑞那韦乙醇盐预防或治疗。
4、肺纤维化。 5. 根据权利要求 3 和 4 所述的应用， 地瑞那韦乙醇盐用于 ALI/ARDS 和肺纤维化时， 其注射使用剂量范围是 120mg 2400mg ； 优选 240 1200mg ； 其口服使用剂量范围是 120mg 6000mg ； 优选 240 3000mg。 6. 根据权利要求 5 所述的应用， 地瑞那韦乙醇盐和药学上可接受的载体或辅料组成的 药物， 该药物可以以药学常规方法制备成片剂、 胶囊剂、 薄膜包衣片、 注射液、 冻干粉针， 优 选以薄膜包衣片或冻干粉针形式存在。 权 利 要 求 书 CN 103989689 A 2 1/6 页 3 地瑞那韦乙醇盐在制备预防或治疗急性。
5、肺损伤 / 急性呼吸 窘迫综合征和肺纤维化的药物中的应用 技术领域 0001 本发明涉及地瑞那韦乙醇盐抑制急性肺损伤 / 急性呼吸窘迫综合征 (ALI/ARDS) 和肺纤维化的发生发展从而预防或治疗 ALI/ARDS 和肺纤维化 ； 具体涉及地瑞那韦乙醇盐 通过抑制 I 型肺泡上皮细胞凋亡， 促进 I 型肺泡上皮细胞的糖基化终产物受体 (receptor for advanced glycation endproducts， RAGE) 的表达， 以致于预防或治疗 ALI/ARDS 和肺纤 维化。 背景技术 0002 急性肺损伤 / 急性呼吸窘迫综合征 (ALI/ARDS) 是一种常见危重症，。
6、 病死率极高， 严重威胁重症患者的生命并影响其生存质量。 ALI/ARDS是在严重感染、 休克、 创伤及烧伤等 非心源性疾病过程中， 肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤造成弥漫性肺间质及肺泡 水肿， 导致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭， 以肺容积减少， 肺顺应性降低， 严重的通气 / 血流比例失调为病理生理特征。临床表现为进行性低氧血症和呼吸窘迫， 肺部影像学表现 为非均一性的渗出性病变。目前 ARDS 的病死率较高， 文献报道 ARDS 患者的病死率在 50 左右 中华医学会重症医学分会 . 急性肺损伤 / 急性呼吸窘迫综合征诊断和治疗指南 . 中 国危重病急救医学 .2006 ； 18(。
7、12) ： 706-710。肺泡 I 型上皮细胞又称膜性肺泡细胞， 是肺泡上皮中最多的细胞， 其形态扁平， 细胞核呈扁圆形， 略向肺泡腔突出。 I型肺泡上皮细 胞几乎覆盖着全部肺泡腔， 与邻近的毛细血管壁紧密相贴， 是进行气体交换的基本场所。 在 ALI/ARDS 中， I 型肺泡上皮细胞发生明显凋亡， 增加无效的上皮化 ( 由于 I 型肺泡上皮细胞 无增殖能力， 即死亡的I型肺泡上皮细胞的位置由增殖的II型肺泡上皮细胞填补)， 使肺泡 壁受损， 影响通气。糖基化终产物受体 (receptor for advanced glycation endproducts， RAGE) 在 I 型肺泡上。
8、皮细胞高表达， 抑制 RAGE 的降低可减少肺的炎症反应， 减轻肺实质性 损伤 Zhang H， Tasaka S， Shiraishi Y.Role of soluble receptor for advanced glycation end-products on endotoxin-induced lung injury.Am J Respir Crit Care Med2008 ； 178 ： 356-362.。 0003 特发性肺纤维化 (idiopathic pulmonary fbrosis， IPF) 又称为隐源性致纤维化 性肺泡炎 (cryptogenicfi brosing。
9、 alveolitis， CFA)， 是一种慢性炎症性间质性疾病， 以普 通型间质性肺炎 (usual interstitialpneumonia， UIP) 为特征性病理改变且病因不明。主 要表现为成纤维细胞灶 (fi broblastic foci) 的出现致大量细胞外基质 (extracellular matrix， ECM) 沉， 胶原积聚， 肺泡 结构破坏， 最终导致正常肺组织结构的破坏， 是一种慢性、 进行性、 不可逆转也是最常见的一种致命性肺疾病King TJ， Pardo A， Selman M.Idiopathic pulmonary fi brosisJ.Lancet， 2。
10、011， 378(9807) ： 1949-1961.。临床表现为进行性呼吸困 难并伴有刺激性干咳， 肺功能为限制性通气障碍， 病情一般持续恶化， 最终因呼吸衰竭而死 亡。流行病学研究显示， I PF 发病率呈不断上升趋势， 目前约为 16.3/100,000， 且 3 年内急 性恶化发生率为 20.7 Navaratnam V， Fleming KM， West J et al.The rising incidence 说 明 书 CN 103989689 A 3 2/6 页 4 of idiopathic pulmonary fi brosis in the UKJ.Thorax， 201。
11、1， 66(6) ： 462-467. ； Song JW， Hong SB， Lim CM et al.Acute exacerbation of idiopathic pulmonary fi brosis ： incidence， risk factors and outcomeJ.Eur Respir J， 2011， 37(2) ： 356-363.。已知肺纤维化主要 是肺组织受损后修复调节失控、 重建异常所引起的病变， 在这过程中， 一系列细胞因子和生 长因子等表达异常、 炎症反应参与肺纤维化的发病过程。 由此造成上皮细胞缺损、 成纤维细 胞增生和 ECM 积聚等主要病变， 最终结。
12、果是成纤维细胞替代了行使正常功能的肺泡上皮细 胞 (alveolar epithelial cells， AECs)， 导致了纤维化的发生。 0004 地瑞那韦乙醇盐 (darunavir ethalolate， 又称 “达如那韦” ， 商品名 prezista) 适 用于与小剂量利托那韦或其它抗 HIV 药合用治疗其它抗 HIV 药治疗无效的成人 HIV 感染， 是一种新的 HIV-1 蛋白酶抑制药， 其作用机制是选择性抑制感染细胞内的编码 Gag-Pol 多 蛋白 HIV 卵裂， 继而抑制形成成熟的病毒粒， 但地瑞那韦乙醇盐在预防或治疗 ALI/ARDS 和 肺纤维化的药理作用未见报道。 。
13、本发明人通过大量的研究发现地瑞那韦乙醇盐可以通过抑 制 I 型肺泡上皮细胞的凋亡， 增加 I 型肺泡上皮细胞的 RAGE 表达从而在预防或治疗 ALI/ ARDS 和肺纤维化方面有明显的作用。基于此， 本发明人发明了地瑞那韦乙醇盐通过抑制 I 型肺泡上皮细胞的凋亡， 增加 I 型肺泡上皮细胞的 RAGE 表达从而抑制 ALI/ARDS 和肺纤维 化的发生发展， 以致于预防或治疗 ALI/ARDS 和肺纤维化。 发明内容 0005 本发明提供了地瑞那韦乙醇盐在制备预防或治疗 ALI/ARDS 和肺纤维化的药物中 的应用。 0006 本发明提供了地瑞那韦乙醇盐在制备预防或治疗 ALI/ARDS 的。
14、药物中的应用。 0007 本发明提供了地瑞那韦乙醇盐在制备预防或治疗肺纤维化的药物中的应用。 0008 本发明提供了地瑞那韦乙醇盐在抑制急慢性肺损伤中 I 型肺泡上皮细胞凋亡的 药物中的应用。 0009 本发明提供了地瑞那韦乙醇盐在增加急慢性肺损伤中 I 型肺泡上皮细胞 RAGE 表 达的药 物中的应用。 0010 本发明还提供的地瑞那韦乙醇盐可以和药学上可接受的载体或辅料组成的药物， 该药物可以以药学常规方法制备成片剂、 胶囊剂、 薄膜包衣片， 优选以薄膜包衣片形式存 在。 0011 发明提供的地瑞那韦乙醇盐在用于 ALI/ARDS 和肺纤维化时， 其注射使用剂量范 围是 60mg 2400。
15、mg ； 优选 60 1200mg ； 其口服使用剂量范围是 120mg 6000mg ； 优选 240 3000mg。 具体实施方式 0012 实施例 1 地瑞那韦乙醇盐冻干粉针制备 0013 取地瑞那韦乙醇盐 60.0g， 加注射用水 2000ml 使其溶解， 加甘露醇 8g， 搅拌溶解， 超滤， 得到无热源的澄清液， 灌入 10ml 西林瓶中， 2ml/ 只， 按冻干粉针工艺冻干， 制成每支 含地瑞那韦乙醇盐 60.0mg 的冻干粉针。 0014 实施例 2 地瑞那韦乙醇盐薄膜包衣片制备 说 明 书 CN 103989689 A 4 3/6 页 5 0015 称取 200.0g 地瑞那韦。
16、乙醇盐、 和 100.0g 羧甲基淀粉钠充分混合均匀后过 100 目 筛， 加入适量的 3 PVPK30水溶液适量制软材， 20 目筛制粒， 60干燥 3 小时， 18 目筛整粒， 加入 2.0g 硬脂酸镁， 混合均匀后压片。制备包衣液， 在不锈钢容器中加入纯水， 后加入物 料， 持续搅拌， 脱泡。 包衣将压好的片子装入包衣锅中， 预热后进行喷雾包衣， 待喷雾结束后 继包衣锅至片子干燥。将干燥的片子进行冷却， 加入巴西棕搁蜡进行打光， 片重约 300mg。 0016 具体实施例 0017 试验例 1 地瑞那韦乙醇盐对人 I 型肺泡上皮细胞细胞株凋亡和 RAGE 表达的影响 0018 1.1 实。
17、验材料 0019 DMEM 培养基为 Gibco 公司产品， 新生牛血清为杭州四季青公司产品， TGF-1 购 自PeproTech公司， 人I型肺泡上皮细胞细胞株(AT I)购自中国典型培养物保藏中心， 用含 10胎牛血清 (Hyclone 公司 ) 的低糖 DMEM 培养基 (GIBCO 公司 )， 常规培养于 5的 CO2， 37人工培养箱中， 细胞呈贴壁生长。 0020 RAGE 一抗购买于 sigma 公司。 0021 地瑞那韦乙醇盐 ( 纯度 99.5， 购买于上海翰香生物科技有限公司 ) 0022 1.2 试验方法 0023 当细胞生长融合至 70 -80， 用无血清培养基饥饿 。
18、24h， 换新鲜培养液， 将传代 的 AT I 细胞分为 2 部分， 均包括 ： (1) 阴性对照组 ； (2)TGF-1 处理组 (3g/L 作用时间 24h) ； (3) TGF-1处理组(3g/L作用时间24h)+地瑞那韦乙醇盐0.3M ； (4)TGF-1处 理组 (3g/L 作用时间 24h)+ 地瑞那韦乙醇盐 1M ； (5)TGF-1 处理组 (3g/L 作用时间 24h)+ 地瑞那韦乙醇盐 3M ； (6)TGF-1 处理组 (3g/L 作用时间 24h)+ 地瑞那韦乙醇盐 10M。第一部分培养的细胞以流式细胞仪测定细胞凋亡， 第一部分培养的细胞细胞裂解， BCA 蛋白测定试剂。
19、盒 (Pierce 公司 ) 测定蛋白浓度后， 取 50g 样品蛋白进行 10的十二 烷基磺酸钠 2 聚丙烯酰胺 (SDS-PAGE) 凝胶变性电泳、 然后转至聚偏二氟乙烯 (PVDF) 膜， 加 入 RAGE 一抗， -actin 作内参， Western blot 检测细胞 RAGE 蛋白的表达。以 TGF-1 未 刺激组作为对照， 计为相应蛋白的100， 分析各浓度药物与单纯TGF-1刺激组对RAGE蛋 白的表达差异。组间进行 T 检验。 0024 表 1 地瑞那韦乙醇盐对 TGF-1 刺激 AT I 细胞的凋亡和 RAGE 表达影响 (n 5) 0025 0026 *， P 0.05，。
20、*， P 0.01， 与单纯 TGF-1 刺激组比较 0027 表 1 结果可以看出， TGF-1 刺激 AT I 细胞 24 小时， AT I 细胞凋亡明显增加， 而 RAGE 表达明显下降， 而加地瑞那韦乙醇盐 0.3-10M 后 24 小时， AT I 细胞凋亡明显下降， 说 明 书 CN 103989689 A 5 4/6 页 6 而 RAGE 表达明显上升。说明地瑞那韦乙醇盐可抑制 ATI 细胞凋亡， 减轻急性肺损伤 / 急性 呼吸窘迫综合征中因 AT I 细胞的耗竭导致的损伤。 0028 实验例2地瑞那韦乙醇盐对盲肠结扎穿孔导致的急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合 征 (ALI/ARDS。
21、) 模型大鼠的影响 0029 2.1 药品与试剂 0030 地瑞那韦乙醇盐 ( 纯度 99.5， 购买于上海翰香生物科技有限公司 ) 0031 鲎试剂试剂盒 ( 福建省福州新北生化工业有限公司， 批号 ： 080430) 0032 Anti-Aquaporin5 抗体 (abcam 公司， ab104751) 0033 RAGE 一抗购买于 sigma 公司。 0034 实验动物 ： SPF 级 Sprague Dawley 大鼠， 雄性， 体重 150g-200g， 山东绿叶制药股份 有限公司实验动物中心提供， 动物合格证号为 ： SYXK( 鲁 )20030020。 0035 2.2 实验。
22、方法与结果 0036 2.2.1 盲肠结扎穿孔 (CLP) 大鼠的制备 0037 手术当天清晨大鼠禁食， 乙醚麻醉后取仰卧位， 75乙醇消毒腹部， 沿腹白线中段 作一长 1.5cm 的切口， 剪开皮肤和肌层， 探查腹腔分离盲肠 ； 1 号丝线距盲端 1cm 处 ( 回盲 瓣远端)结扎， 16号穿刺针在结扎处远端贯穿盲肠3次(呈三角形)， 针孔间距约3mm， 并挤 出少许内容物 ； 盲肠回纳腹腔， 逐层缝合关闭腹腔。 0038 2.2.2 分组给药 0039 CLP 大鼠 90 只， 随机分为 8 组， 即模型组、 地瑞那韦乙醇盐静脉注射 6mg/kg、 12mg/kg、 120mg/kg、 2。
23、40mg/kg 组及地瑞那韦乙醇盐灌胃给药 12mg/kg， 24mg/kg、 300mg/kg、 600mg/kg组。 另外取10只正常大鼠作为对照组。 CLP手术1小时各组给予相应药物。 CLP手 术 24 小时取血， 测定血清内毒素， 血清内毒使用素鲎试剂试剂盒测定。取肺， 称重， 测定肺 系数， 取新鲜一叶肺， 均浆， BCA 蛋白测定试剂盒 (Pierce 公司 ) 测定蛋白浓度后， 取 50g 样品蛋白进行10的十二烷基磺酸钠2聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶变性电泳、 然后转至聚 偏二氟乙烯 (PVDF) 膜， 加入 RAGE 一抗， -actin 作内参， Westem bl。
24、ot 检测细胞 RAGE 蛋白 的表达。 另外取一叶肺， 制备病理片， 行Aquaporin5(I型肺泡上皮细胞的特征标志)免疫组 化染色， 200倍光镜拍照， 计算每个视野下Aquaporin5阳性细胞数， 以正常组的Aquaporin5 阳性细胞数计为 100， 比较各给药组与模型组的差异。组间进行 T 检验。 0040 2.2.3 实验结果 0041 表 2 结果显示地瑞那韦乙醇盐静脉 6mg/kg、 12mg/kg、 120mg/kg、 240mg/kg 组及地 瑞那韦乙醇盐灌胃给药 12mg/kg， 24mg/kg、 300mg/kg、 600mg/kg 组明显降低 ALI/ARDS。
25、 大 鼠血清内毒素水平， 抑制肺组织 RAGE 表达下降， 抑制 Aquaporin5 阳性细胞数量下降 (p 0.05 或 p 0.01)。地瑞那韦乙醇盐静脉注射 120mg/kg 组抑制 ALI/ARDS 大鼠血清内 毒素升高， 抑制肺组织RAGE表达下降， 抑制Aquaporin5阳性细胞数量下降水平与地瑞那韦 乙醇盐静脉注射 240mg/kg 组比较无显著性差异 ； 地瑞那韦乙醇盐灌胃给药 300mg/kg 组抑 制 ALI/ARDS 大鼠血清内毒素升高， 抑制肺组织 RAGE 表达下降， 抑制 Aquaporin5 阳性细胞 数量下降水平与地瑞那韦乙醇盐灌胃给药 600mg/kg 组。
26、比较无显著性差异。 0042 表 2 地瑞那韦乙醇盐给药对盲肠结扎穿孔导致的 ALI/ARDS 大鼠的影响 (n 6) 0043 说 明 书 CN 103989689 A 6 5/6 页 7 0044 *， p 0.05，*， p 0.01， 与模型组比较 0045 试验例 3 地瑞那韦乙醇盐对博莱霉素 (BLM) 诱导的肺纤维化模型大鼠的影响 0046 3.1 实验材料 0047 博莱霉素购于上海拜力生物科技有限公司 0048 羟脯氨酸检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所 0049 实验动物 ： SPF 级 Sprague Dawley 大鼠， 雄性， 体重 150g-200g， 山东绿叶制。
27、药股份 有限公司实验动物中心提供， 动物合格证号为 ： SYXK( 鲁 )20030020。 0050 地瑞那韦乙醇盐 ( 纯度 99.5， 购买于上海翰香生物科技有限公司 ) 0051 3.2 试验方法 0052 60 只大鼠， 10水合氯醛麻醉 (350mg/kg， ip)， 采用支气管内注射博莱霉素 (5mg/ kg) 诱导肺纤维化模型。造模型 21 天后分组， 分为模型组、 地瑞那韦乙醇盐灌胃给药 20mg/ kg、 地瑞那韦乙醇盐灌胃给药 40mg/kg、 地瑞那韦乙醇盐灌胃给药 200mg/kg、 地瑞那韦乙醇 盐灌胃给药组 600mg/kg， 连续给药 3 周。处死动物， 取肺，。
28、 称重， 计算肺指数， 形态学改变 分级肺泡炎和肺纤维化分级按文献 Szapiel S V， Elson N A， Fulmur J D， et al.Bleomycin induced interstitial pulmonary disease in the nude， athymic mouseJ.Am Rev Respir Dis， 1979， 120 ： 893-899， 将肺泡炎和肺纤维化的程度分为 4 级 ： 0 级无明显改变 ； 1 级轻度 改变， 病变范围小于全肺的 20 ； 2 级中度改变， 病变范围占全肺的 20 50 ； 3 级重度 改变， 病变范围占全肺的 50以上。测定体重和肺重量， 计算肺指数， 取肺， 水解， 测定肺组 织羟脯氨酸含量。 0053 表 3 结果显示地瑞那韦乙醇盐灌胃给药 12、 24、 300 和 600mg/kg 连续给药 3 周可 以明显 降低肺指数， 降低纤维化分级， 降低肺组织羟脯氨酸含量， 说明地瑞那韦乙醇盐灌 胃给药可抑制肺纤维化的发生发展。 0054 表 3 地瑞那韦乙醇盐对博莱霉素 (BLM) 诱导的肺纤维化模型大鼠的影响 说 明 书 CN 103989689 A 7 6/6 页 8 0055 *， P 0.05，*， P 0.01， 与模型组比较。 说 明 书 CN 103989689 A 8 。