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1、(10)申请公布号 CN 104027347 A (43)申请公布日 2014.09.10 CN 104027347 A (21)申请号 201410226494.5 (22)申请日 2014.05.26 A61K 31/724(2006.01) A61P 31/20(2006.01) (71)申请人 江苏科技大学 地址 212003 江苏省镇江市京口区梦溪路 2 号 (72)发明人 黄金山 郝碧芳 沈兴家 程晨 梁飞 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 楼高潮 (54) 发明名称 甲基-环糊精在制备防治BmNPV感染家蚕 细胞药物中的应用 (57) 摘要。
2、 甲基-环糊精在制备防治BmNPV感染家蚕 细胞药物中的应用， 提供一种以 MCD 为有效成 分， 防治BmNPV入侵细胞的药物。 该药物在深入研 究病毒入侵机制、 杆状病毒感染宿主的受体研究 方面有重要意义。当 MCD 浓度在 8mM 以上时能 完全抑制病毒感染。本发明在防治脓病的蚕用药 物研发及生产中， 具有重要的应用推广价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104027347 A CN 104027347 A 1/1 页 。
3、2 1. 甲基 - 环糊精在制备防治 BmNPV 感染家蚕细胞药物中的应用。 2. 防治 BmNPV 感染家蚕细胞的药物， 其特征在于有效成分为甲基 - 环糊精。 权 利 要 求 书 CN 104027347 A 2 1/5 页 3 甲基-环糊精在制备防治BmNPV感染家蚕细胞药物中的 应用 技术领域 0001 本 发 明 属 于 分 子 生 物 学 与 病 毒 学 领 域，涉 及 甲 基 - 环 糊 精 (Methyl-cyclodextrin， 简称 MCD， 也有表示为 MBCD， Me-CD， MeBCD) 在制备防治 BmNPV 感染家蚕细胞药物中的应用。 背景技术 0002 家蚕血。
4、液型脓病是养蚕业三大病毒病中危害最为严重的一种病害， 其传染性极 强， 近年来养蚕生产中较为普遍发生， 并不时发生部分农户或一定养蚕区域内绝产的情况。 血液型脓病是由家蚕核型多角体病毒 (Bombyx mori nucleopolyhedrovirus， BmNPV) 引起 的， 该病毒属杆状病毒科、 核型多角体病毒属， 是一种具有囊膜、 双链 DNA 病毒， 它在病毒复 制过程中会形成两种病毒粒子， 即包涵体来源病毒粒子与芽生病毒粒子， 前者随着食物进 入家蚕中肠感染部分中肠细胞， 被感染中肠细胞会产生大量芽生病毒粒子， 新生的芽生病 毒粒子进而感染其它组织导致细胞裂解， 虫体最终死亡。病蚕。
5、、 蛹、 蛾的尸体、 脓汁及被之 污染的蚕粪、 蚕具、 蚕茧， 带有大量的病毒， 具有强烈的传染性， 是血液型脓病的主要的传染 源。 0003 目前主要是通过抗血液型脓病家蚕品种的培育以及严格消毒、 良桑饱食以提高蚕 体抵抗性能来预防该病的发生。 0004 在抗病育种方面， 江苏科技大学蚕业研究所育种专家通过长期的杂交选育， 培 育出有高度抵抗性实用品种 “华康 2 号” 徐安英， 林昌麒， 钱荷英， 孙平江， 张月华， 刘明 珠， 李龙 . 耐家蚕核型多角体病毒病蚕品种 “华康 2 号” 的育成 . 蚕业科学， 2013， (39)2 ： 275-282 ； 转基因抗性育种近几年也取得一定的。
6、进展， 已有学者将抗病毒蛋白在家蚕中肠 内过量表达， 或者利用 RNAi 技术抑制病毒基因表达， 1.Jiang L.， et al.， Resistance to Bombyx mori nucleopolyhedrovirus via overexpression of an endogenous antiviral gene in transgenic silkworms.Arch Virol， 2012.157(7) ： 1323-8.2.Isobe， R.， et al.， Use ofRNAi technology to confer enhanced resistance to 。
7、BmNPV on transgenic silkworms. Arch Virol， 2004.149(10) ： 1931-40.， 但由于转基因操作复杂、 低效性导致研究困难， 而 且转基因的品种后代不稳定性都限制了其在实际生产应用。传统的抗病育种周期很长， 并且目前生产上蚕农饲养的经济性状良好的一代杂交种的血液型脓病的抗性很弱， 家蚕的 BmNPV 抗性品种培育在近期难于满足实际生产的需求， 还需加强对抗性品种培育的遗传学、 基因组学尤其是抗性相关基因与经济性状相关基因间的相关关系的研究， 提高抗 NPV 品种 的经济性状和实用价值。 0005 生产上主要是通过加强养蚕前严格的消毒尽量杜。
8、绝 BmNPV 的感染， 消毒剂主要成 分是氯制剂， 但该类消毒剂的强腐蚀性、 酸碱度和溶解性一直是困扰其发展的问题 ； 还有 一些复合氯制剂， 溶解性得到了一定的改善， 复合后溶液的消毒效果和强碱性的稳定性又 有减弱 ； 生产上还有使用甲醛熏蒸蚕具、 蚕室达到预防的效果， 但是无论碱性消毒剂还是甲 说 明 书 CN 104027347 A 3 2/5 页 4 醛， 都有强的刺激性， 因此， 在生产上通过使用治疗药物， 解决家蚕血液型脓病的流行和暴 发问题是蚕农或部分技术人员非常迫切的期望， 已有试验研究证明 B- 丙内酯等化学物品 对家蚕 BmNPV 感染后的发病具有明显的抑制效果 吕鸿声 。
9、. 昆虫病毒与昆虫病毒病 M. 北京 ： 科学出版社， 1982， 405-407， 我们前期大量实验结果表明 ： MCD 可以防治 BmNPV 入 侵家蚕细胞， 病毒感染细胞过程包括吸附、 进入、 复制以及病毒粒子包装及释放 George F Rohrmann.Baculovirus Molecular Biology ： Third Edition.2013 ： Bethesda(MD)， 所以病 毒进入宿主细胞是病毒感染的关键起始点， 如果能够限制病毒的入侵， 则可以在源头上防 治家蚕脓病的发生， 达到防治的效果。目前 MCD 应用于病毒及 BmNPV 防治方面尚无专利 和文献报道。 发。
10、明内容 0006 解决的技术问题 ： 本发明提供一种化学药物 -MCD 的新用途， 可应用于防治 BmNPV 感染家蚕细胞， 另一目的是提供使用 MCD 用于防治 BmNPV 感染家蚕细胞的合适浓 度。 0007 技术方案 ： 甲基 - 环糊精在制备防治 BmNPV 感染家蚕细胞药物中的应用。 0008 防治 BmNPV 感染家蚕细胞的药物， 有效成分为甲基 - 环糊精。 0009 具体防治方法为 ： 0010 1.MCD 对携带 egfp 报告基因的 BmNPV 感染的防治 0011 (1) 用 1PBS 溶解 MCD， 配制浓度为 38mM 的储存液。 0012 (2) 分别在 35mm 。
11、细胞培养皿中接种约 105个 / 皿的细胞， 贴壁后， 用配制好的 MCD 储存液加入合细胞培养液贴壁细胞中， 使终浓度分别为 4mM-20mM， 孵育 10-120min， 孵育细胞温度为 20-29， 以 0mM MCD( 即等体积 1PBS) 孵育液作为对照。 0013 (3) 孵育后， 分别去除 1PBS 和不同浓度的 MCD 孵育液， 用无血清的 TC-100 培 养基轻轻冲洗细胞 2 次， 分别用 MOI 10 携带绿色荧光蛋白基因的 BmNPV 病毒感染细胞， 27感染 1h 后， 用无血清的 TC-100 培养基轻洗 2 遍， 放置于 27培养箱培养， 培养 6h。 0014 。
12、2. 防治效果的观察与统计分析 0015 6 小时后， 细胞培养皿放置于激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白表达， 并统计有 荧光表达的细胞数量及总细胞数， T 测验分析不同浓度 MCD 孵育细胞后， 防治病毒入侵细 胞的效率。 0016 有益效果 ： 提供一种以 MCD 为有效成分， 防治 BmNPV 入侵细胞的药物。该药物在 深入研究病毒入侵机制、 杆状病毒感染宿主的受体研究方面有重要意义。当 MCD 浓度在 8mM以上时能完全抑制病毒感染。 本发明在防治脓病的蚕用药物研发及生产中， 具有重要的 应用推广价值。 附图说明 0017 图 1 是携带绿色荧光蛋白基因的 BmNPV 重组病毒 BmB。
13、ac-egfp 示意图 ： 0018 BmBacJS13 是 一 株 与 BmNPV 具 有 相 同 感 染 特 性 的 BacmidHuang JS et al.Construction of the Bac-to-Bac System of Bombyx mori Nucleopolyhedroviru. Virologica Sinica.2007， 22(3) ： 218-225。为了便于观察及统计本专利所述的防治效果， 说 明 书 CN 104027347 A 4 3/5 页 5 将hsp70操纵下的报告基因egfp转座到BmBacJS13的Tn7转座插入位点， 命名BmBac-eg。
14、fp， 提取 DNA， 转染家蚕细胞， 收获出芽病毒后， 继续用于感染家蚕细胞， 荧光显微镜下观察到强 烈的绿色荧光， 70 小时后收获病毒， 终点稀释法测定病毒滴度。 0019 图 2 是利用不同浓度 MCD 处理细胞后病毒感染细胞荧光图 ： 0020 细胞培养皿中预先接种约 105家蚕细胞， 分别用不同浓度 MCD 孵育细胞 30min 后， 对照细胞加入相应剂量 1PBS， 用 MOI 10 携带绿色荧光蛋白基因的 BmNPV 病毒感染 1h， 用无血清 TC100 培养基洗三遍， 27正常培养， 感染后 6 小时候观察细胞荧光。 0021 图 3 是不同浓度 MCD 处理后细胞感染病毒。
15、百分率比较图 ： 0022 细胞培养皿中预先接种约105BmN细胞， 分别用3种不同浓度MCD处理30min后， 对照细胞加入相应剂量 1PBS， 用 MOI 10 携带绿色荧光蛋白基因的 BmNPV 感染 1h， 用无 血清 TC100 培养基洗两遍， 27正常培养， 感染后 6 小时候观察细胞荧光变化， 计算细胞被 感染百分率， 台酚蓝细胞染色计算细胞存活率， 图中数据为三次重复结果。 具体实施方式 0023 实施例 1 0024 1. 携带 egfp 报告基因的 BmNPV 的构建 0025 将 hsp70-egfp 片段克隆至 pFastBacDual(Invitrogen) 的 Ba。
16、mH I(Takara) 和 Not I(Takara) 位点， 构建供体质粒 pFastBacDual-hsp70-egfp， 通过转座获得 BmBac-egfp( 示 意图见图 1)， 将 BmBac-egfp DNA 转染 BmN( 家蚕卵巢细胞 ) 细胞后， 在荧光显微镜下可观察 到绿色荧光表达。将其细胞上清用于感染 BmN 细胞， 感染 72 小时后收获病毒， 用终点稀释 法测定病毒滴度， 病毒 4冰箱避光保存。 0026 2. 细胞的接种及 MCD(Sigma) 的储存液配制 0027 (1) 分别在 35mm 的细胞培养皿 (Corning) 中各接种约 105BmN 细胞每个细。
17、胞皿中 合 2mL 的 10 FBS 的 TC100 昆虫细胞培养基。 0028 (2)27培养约 12h-24h， 待细胞贴壁后， 用于以下实验。 0029 (3)MCD(Sigma) 的储存液配制 0030 用 1PBS 配制浓度为 38mM 的 MCD 储存液。 0031 3. 当 MCD 的终浓度为 0mM， 即对照组细胞， 携带 egfp 报告基因的 BmNPV 对细胞 感染效率 0032 (1) 取各接种好 105细胞的 3 个培养皿， 每个细胞皿中合 2mL 的 10 FBS 的 TC100 昆虫细胞培养基。移去旧的培养基， 分别加入 210.4L1PBS 与 789.6L10 。
18、FBS 的 TC100 培养基， 27培养 30min， 移去合 PBS 的培养基， 用无血清的 TC100 培养基洗 2 遍， 轻 轻晃动， 每次 3min。 0033 (2) 细胞冲洗完成后， 去除冲洗液， 加入 MOI 10 的 BmBac-egfp 病毒， 感染细胞 27 1h。 0034 (3)1h 后， 用无血清的 TC100 培养基洗两遍， 轻轻晃动， 每次 3min， 去除冲洗液， 加 入 2mL10 FBS 的 TC100 培养基， 27培养 6h。 0035 (4)6h后， 将3个皿放置于荧光共聚焦显微镜(Leica SP8)， 观察绿色荧光蛋白表达 情况见图 2 左上 (。
19、 对照组 )， 并统计带有荧光的细胞数量。 说 明 书 CN 104027347 A 5 4/5 页 6 0036 实施例 2 0037 MCD 的终浓度为 4mM 时， 对携带 egfp 报告基因的 BmNPV 感染的防治 ： 0038 (1) 取各接种好 105细胞的 3 个培养皿， 移去旧的培养基， 在 3 个细胞培养皿中分 别加入 105.2LMCD 储存溶液和 894.8L10 FBS 的 TC100 培养基， 使培养皿中 MCD 的终浓度为 4mM， 27培养 30min， 移去合有 MCD 的培养基， 用无血清的 TC100 培养基洗 2 遍， 轻轻晃动， 每次 3min。 00。
20、39 (2) 细胞冲洗完成后， 去除冲洗液， 加入 MOI 10 的 BmBac-egfp 病毒， 感染细胞 27 1h。 0040 (3)1h 后， 用无血清的 TC100 培养基洗两遍， 轻轻晃动， 每次 3min， 去除冲洗液， 加 入 2mL10 FBS 的 TC100 培养基， 27培养 6h。 0041 (4)6h后， 将3个皿放置于荧光共聚焦显微镜(Leica SP8)， 观察绿色荧光蛋白的表 达 ( 见图 2 右上 )， 统计带有荧光的细胞数量， 并运用 T 测验和对照组细胞荧光做比较见图 3。结果显示 4mM MCD 处理细胞时， BmNPV 的感染细胞比率仅为对照的 69。。
21、 0042 实施例 3 0043 MCD 的终浓度为 6mM 时， 对携带 egfp 报告基因的 BmNPV 感染的防治 ： 0044 (1) 取各接种好 105细胞的 3 个培养皿， 移去旧的培养基， 在 3 个细胞培养皿中分 别加入 157.8L MCD 储存溶液和 842.2L10 FBS 的 TC100 培养基， 使培养皿中 MCD 的终浓度为 6mM， 27培养 30min， 移去合有 MCD 的培养基， 用无血清的 TC100 培养基洗两 遍， 轻轻晃动， 每次 3min。 0045 (2) 细胞冲洗完成后， 去除冲洗液， 加入 MOI 10 的 BmBac-egfp 病毒， 感染。
22、细胞 27 1h。 0046 (3) 感染 1h 后， 用无血清的 TC100 培养基洗两遍， 轻轻晃动， 每次 3min， 去除冲洗 液， 加入 2mL10 FBS 的 TC100 培养基， 27培养 6h。 0047 (4)6h后， 将3个皿放置于荧光共聚焦显微镜(Leica SP8)， 观察绿色荧光蛋白的表 达 ( 见图 2 左下 )， 并统计带有荧光的细胞数量， 并运用 T 测验和对照组细胞荧光做比较见 图 3。结果显示 6mM MCD 处理细胞时， BmNPV 感染的细胞效率仅为对照 4.8。 0048 实施例 4 0049 MCD 的终浓度为 8mM 时， 对携带 egfp 报告基。
23、因的 BmNPV 感染的防治 ： 0050 (1) 取各接种好 105 细胞的 3 个培养皿， 移去旧的培养基， 在 3 个细胞培养皿中分 别加入 210.4LMCD 储存溶液与 789.6L10 FBS 的 TC100 培养基， 使培养皿中 MCD 的终浓度为 8mM， 27培养 30min， 移去合有 MCD 的培养基， 用无血清的 TC100 培养基洗两 遍， 轻轻晃动， 每次 3min。 0051 (2) 细胞冲洗完成后， 去除冲洗液， 加入 MOI 10 的 BmBac-egfp 病毒， 感染细胞 27 1h。 0052 (3)1h 后， 用无血清的 TC100 培养基洗两遍， 轻轻。
24、晃动， 每次 3min， 去除冲洗液， 加 入 2mL10 FBS 的 TC100 培养基， 27培养 6h。 0053 (4)6h后， 将3个皿放置于荧光共聚焦显微镜(Leica SP8)， 观察绿色荧光蛋白的表 达 ( 见图 2 右下 )， 并统计带有荧光的细胞数量， 运用 T 测验和对照组细胞荧光做比较见图 3。结果显示 8mM MCD 处理细胞时， 无荧光表达， 表明 BmNPV 的感染完全被抑制了。 说 明 书 CN 104027347 A 6 5/5 页 7 0054 最后应当说明的是 ： 以上所述的实施例和实施方式所述的 MCD 浓度和处理时间 仅用于说明性目的而非限制， 但本领域的普通技术人员应当理解， 在细胞状态或者细胞培 养基理化性质比如酸碱度等等微小的差异， 可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改 变， 而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围， 并被包括在本申请的精神和 范围之内。 说 明 书 CN 104027347 A 7 1/2 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104027347 A 8 2/2 页 9 图 3 说 明 书 附 图 CN 104027347 A 9 。