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1、(10)申请公布号 CN 104130965 A (43)申请公布日 2014.11.05 CN 104130965 A (21)申请号 201410384340.9 (22)申请日 2014.08.06 CGMCC No.9355 2014.06.17 C12N 1/20(2006.01) A01P 3/00(2006.01) C12R 1/465(2006.01) (71)申请人 东北林业大学 地址 150040 黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴 路 26 号 (72)发明人 刘雪英 马玲 刘雪峰 (74)专利代理机构 哈尔滨市松花江专利商标事 务所 23109 代理人 侯静 (54) 发明名称。
2、 一株对杨树灰斑病菌有抑制作用的链霉菌 (57) 摘要 一株对杨树灰斑病菌有抑制作用的链霉菌， 本发明涉及一株链霉菌。 本发明提供一株链霉菌， 对杨树灰斑病菌有抑制作用， 为杨树灰斑病的生 物防治提供了有效途径。本发明对杨树灰斑病菌 有抑制作用的链霉菌为链霉菌 Syjd3， 保藏在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏地址是北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 保藏日期为 2014 年 6 月 17 日， 保藏编号为 CGMCC No.9355。 本发明链霉菌Syjd3对杨树灰斑病菌有 抑制作用， 该菌对杨树叶枯病菌、 茄病镰刀菌、 小 麦根腐病菌、 玉米弯孢病菌和水稻恶苗病。
3、菌也有 一定抑制作用。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104130965 A CN 104130965 A 1/1 页 2 1. 一株对杨树灰斑病菌有抑制作用的链霉菌， 其特征在于该菌株为链霉菌 (Streptomyces sp.)Syjd3， 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏 地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 保藏日期为2014年6月17日， 保藏。
4、编号为CGMCC No.9355。 权 利 要 求 书 CN 104130965 A 2 1/4 页 3 一株对杨树灰斑病菌有抑制作用的链霉菌 技术领域 0001 本发明涉及一株链霉菌。 背景技术 0002 杨 树 灰 斑 病 是 由 杨 树 灰 斑 病 菌 (Sporocadus populinus(Bres.) Orsenigo,Rodondi&B.Sutton CoryneumpopulinumBres.) 引起的一种危害杨树叶片叶 部病害之一， 发生面积大， 危害严重， 主要发生在幼树、 幼苗的叶片和树梢上， 使叶片提早脱 落， 干部溃疡， 嫩梢枯顶， 生长量减低， 严重时可造成植株死。
5、亡， 移栽成活率降低， 对杨树育 苗和造林威胁很大。 0003 植物病害是威胁农业生产的重要因素之一， 目前使用化学农药是控制植物病害的 主要方法， 但化学农药的长期使用不仅污染环境， 破坏生态平衡， 而且残留对人、 畜都有危 害， 并且使病原菌产生了抗药性， 因此植物病害的生物防治研究越来越受到重视。 植物内生 放线菌是生活在植物健康组织内部的微生物， 与植物宿主及和它共生的其他微生物间有密 切的关系， 是生物防治的一个新菌种。 近年来植物内生菌已引起了植物保护学家、 微生物学 家、 生态学家等的广泛关注， 逐步成为国内外研究的热点， 国内外研究均表明内生菌对防治 植物病害具有潜在的应用和开。
6、发价值， 因此寻找防治杨树灰斑病菌拮抗菌是重要的防治途 径之一。 发明内容 0004 本发明提供一株链霉菌 (Streptomyces)， 对杨树灰斑病菌有抑制作用， 为杨树灰 斑病的生物防治提供了有效途径。 0005 本发明对杨树灰斑病菌有抑制作用的链霉菌为链霉菌 (Streptomyces sp.) Syjd3， 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)， 保藏地址是北京 市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 保藏日期为 2014 年 6 月 17 日， 保藏编号为 CGMCC No.9355。 0006 本发明链霉菌Syjd3在高氏一号培养基上划线插片培养， 28。
7、培养7-14d后， 分别 用光学显微镜和电子显微镜观察插片上的气生菌丝、 基生菌丝及孢子的形态特征。菌丝体 初期白色， 后变为浅黄褐色。 菌落表边干燥、 粉状、 正反面颜色一致。 气生菌丝丰富， 多分枝。 基内菌丝有分支、 无横隔、 无断裂。孢子丝柔曲型偶尔螺旋性， 孢子杆状， 表面光滑。 0007 本发明链霉菌 Syjd3 在高氏一号培养基上气生菌丝生长旺盛， 粉状， 浅黄褐色， 无 可溶性色素。在淀粉琼脂培养基上气生菌丝暗黄褐色， 气生菌丝旺盛， 无可溶性色素。燕麦 粉琼脂培养基上气生菌丝暗灰色， 旺盛， 基内菌丝灰色， 无可溶性色。 0008 所述淀粉琼脂培养基由 10g 可溶性淀粉、 。
8、1g 硫酸镁、 1g 硝酸钾、 0.3g 磷酸氢二钾、 2g酵母浸粉、 0.5g氯化钠、 15g琼脂和1000mL蒸馏水组成， pH为7.2-7.6， 121， 灭菌20分 钟。 0009 所述燕麦粉琼脂培养基由20g燕麦粉、 0.001g七水硫酸铁、 0.001g氯化锰、 0.001g 硫酸锌、 18g 琼脂和 1000mL 蒸馏水组成， pH 为 7.2-7.6， 121， 灭菌 20 分钟。 说 明 书 CN 104130965 A 3 2/4 页 4 0010 参照 链霉菌鉴定手册 对链霉菌 Syjd3 分别进行明胶液化、 牛奶凝固与胨化、 淀 粉水解、 纤维素上生长、 H2S 产生及。
9、碳源利用。链霉菌 Syjd3 能使明胶液化、 牛奶凝固、 胨化 慢、 淀粉水解强。在纤维素上不生长。产生 H2S。利用葡萄糖、 L- 阿拉伯糖、 L- 鼠李糖、 D- 果 糖， 不利用 D- 木糖、 蔗糖、 棉子糖、 D- 甘露醇、 肌醇。 0011 本发明链霉菌 Syjd3 通过 16SrDNA 序列比对分析， 与 Streptomyces cavourensis KC178676.1 的相似度为 99。通过结合菌体形态特征、 生长条件、 生理生化鉴定结果确定 链霉菌 Syjd3 属于链霉菌属 (Streptomyces)。 0012 本发明链霉菌 Syjd3 对杨树灰斑病菌有抑制作用， 该。
10、菌对杨树叶枯病菌、 茄病镰 刀菌、 小麦根腐病菌、 玉米弯孢病菌和水稻恶苗病菌也有一定抑制作用。 0013 本发明链霉菌(Streptomyces sp.)Syjd3， 属于链霉菌属(Streptomyces)， 保藏在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)， 保藏地址是北京市朝阳区北辰 西路 1 号院 3 号， 保藏日期为 2014 年 6 月 17 日， 保藏编号为 CGMCCNo.9355。 附图说明 0014 图1为本发明链霉菌Syjd3画线培养的菌落形态照片 ； 图2为本发明链霉菌Syjd3 与杨树灰斑病菌的对峙筛选图 ； 图 3 为本发明链霉菌 Syjd3 和。
11、相近菌株进行同源性比对构 建的系统发育树。 具体实施方式 0015 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式， 还包括各具体实施方式间的 任意组合。 0016 具体实施方式一 ： 本实施方式对杨树灰斑病菌有抑制作用的链霉菌为链霉 菌 (Streptomyces sp.)Syjd3， 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)， 保藏地址是北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 保藏日期为 2014 年 6 月 17 日， 保 藏编号为 CGMCC No.9355。 0017 本实施方式链霉菌Syjd3在高氏一号培养基上划线插片培养， 28培养7-14d后， 分别用光。
12、学显微镜和电子显微镜观察插片上的气生菌丝、 基生菌丝及孢子的形态特征 ( 如 图 1)。菌丝体初期白色， 后变为浅黄褐色。菌落表边干燥、 粉状、 正反面颜色一致。气生菌 丝丰富， 多分枝。基内菌丝有分支、 无横隔、 无断裂。孢子丝柔曲型偶尔螺旋性， 孢子杆状， 表面光滑。 0018 本实施方式链霉菌 Syjd3 在高氏一号培养基上气生菌丝生长旺盛， 粉状， 浅黄褐 色， 无可溶性色素。 在淀粉琼脂培养基上气生菌丝暗黄褐色， 气生菌丝旺盛， 无可溶性色素。 燕麦粉琼脂培养基上气生菌丝暗灰色， 旺盛， 基内菌丝灰色， 无可溶性色。 0019 参照 链霉菌鉴定手册 对链霉菌 Syjd3 分别进行明胶。
13、液化、 牛奶凝固与胨化、 淀 粉水解、 纤维素上生长、 H2S 产生及碳源利用。链霉菌 Syjd3 能使明胶液化、 牛奶凝固、 胨化 慢、 淀粉水解强。在纤维素上不生长。产生 H2S。利用葡萄糖、 L- 阿拉伯糖、 L- 鼠李糖、 D- 果 糖， 不利用 D- 木糖、 蔗糖、 棉子糖、 D- 甘露醇、 肌醇。 0020 具体实施方式二 ： 本实施方式链霉菌 (Streptomyces sp.)Syjd3 从黑龙江省哈尔 滨市第三苗圃的 3 年生银中杨中分离得到。分离方法按以下步骤进行 ： 说 明 书 CN 104130965 A 4 3/4 页 5 0021 (1)从黑龙江省哈尔滨市第三苗圃的。
14、3年生银中杨上随机挑选5株树， 每株随机采 集 30 片叶子， 在超净工作台内用 75酒精将叶子进行表面消毒。 0022 (2) 将消毒好的叶子 10 克用研钵研碎， 后放入装有玻璃珠和无菌水的三角瓶中， 在 150 转 / 分的摇床上摇 30 分钟， 静止 30 秒后， 依次稀释 10 倍， 制备 10-1、 10-2、 10-3、 10-4稀 释液， 吸取稀释液 0.2ml 滴加到高氏一号培养基平板上， 涂抹均匀， 将培养皿放在 28培养 箱内倒置培养。 0023 高氏一号培养基由 20g 可溶性淀粉、 1gKNO3、 0.5gNaCl、 0.5gK2HPO4、 0.5gMgSO4、 0.。
15、01gFeSO4、 20g 琼脂和 1000mL 水组成， pH 为 7.2-7.6。 0024 (3) 采用平板对峙法筛选对杨树灰斑病菌有抑制作用的菌株 0025 将步骤(2)培养得到的菌株， 用高氏一号培养基培养， 将杨树灰斑病菌在PDA培养 基上培养 10-15d 后， 将步骤 (2) 培养得到的菌株用打孔器取 7mm 直径的菌块， 接种于杨树 灰斑病菌对称两侧， 两者相距为 7mm， 培养 10-12d 后观察测量抑菌圈直径， 选择拮抗作用最 佳的菌株 ( 如图 2)， 即为本实施方式的链霉菌 Syjd3。 0026 对分离筛选得到的链霉菌 Syjd3 进行分子鉴定， 提取菌株的基因组。
16、 DNA， 应用常规 PCR 扩增该菌株的 16SrDNA 并测序， 其序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。链霉菌 (Streptomyces sp.)Syjd3 的 16SrDNA 序列长度为 1488bp， 其序列提交至 GenBank 获得的序列号为 KJ918749， 测序结果与GenBank中的16SrDNA序列进行同源性比对， 构建的系统发育树如图 3 所示， 以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明， 与 Streptomyces cavourensis KC 178676.1 的相似度为 99。通过结合菌体形态特征、 生长条件、 生理生化鉴定结果确定链 霉菌 Syjd3 。
17、属于链霉菌属 (Streptomyces)。 0027 采用平板对峙法检测链霉菌 Syjd3 对杨树灰斑病菌的抑制作用， 可形成明显的抑 菌带， 抑菌带宽度为 6.5mm， 抑菌率达到 95.83。 0028 采用平板对峙法检测链霉菌 Syjd3 对其他植物病原菌的抑制作用， 发现对杨 树叶枯病菌 (Alternaria alternata)、 茄病镰刀菌 (Fusarium solani)、 小麦根腐病 菌 (Drechslera sorokiniana)、 玉米弯孢病菌 (Curvularia lunata)、 水稻恶苗病菌 (Fusarium moniliforme) 也有一定的抑制作用。
18、， 实验结果如下。 0029 指示菌抑菌率 ( ) 杨树叶枯病菌72.13 榆树枯萎病菌52.04 小麦根腐病菌62.29 玉米弯孢病菌61.35 水稻恶苗病菌69.77 0030 所述杨树灰斑病菌 (S.populinus) 已在 5 种药用植物提取液对杨树灰斑病抑 菌活性研究 ( 刘莹， 辽宁林业科技， 2012 年第 3 期 ) 中公开， 杨树叶枯病菌 (Alternaria 说 明 书 CN 104130965 A 5 4/4 页 6 alternata) 已在 绒白乳菇发酵液提取物对杨树叶枯病菌几种重要酶活性的影响 ( 计红 芳等， 北京林业大学学报， 2009 年 7 月 ) 中公。
19、开， 茄病镰刀菌 (Fusarium solani) 已在 新 疆榆树小蠹虫伴生真菌的研究 ( 朱晓梅， 东北林业大学学位论文， 2011 年 ) 中公开， 以上 3 株菌分别由文章的作者处获得。 0031 所述小麦根腐病菌 (Drechslera sorokiniana)、 玉米弯孢病菌 (Curvularia lunata)、 水稻恶苗病菌 (Fusarium moniliforme) 购买自黑龙江省农业科学院植物保护研 究所。 0032 本专利是在 “中央高校基本科研业务费专项资金资助 ( 项目编号 ： 2572014AA20)” 完成的。 说 明 书 CN 104130965 A 6 1/2 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 104130965 A 7 2/2 页 8 序 列 表 CN 104130965 A 8 1/2 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104130965 A 9 2/2 页 10 图 3 说 明 书 附 图 CN 104130965 A 10 。