一种多肽在制备治疗核因子ΚB异常活化疾病药物中的用途.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104043102 A (43)申请公布日 2014.09.17 CN 104043102 A (21)申请号 201410123289.6 (22)申请日 2014.03.28 A61K 38/10(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61K 38/16(2006.01) A61P 31/12(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 37/02(2006.01) (71)申请人 武汉益承生物科技股份有限公司 地址 430074 湖北省武汉市东湖开发区高新 大道 666 号光谷生物城 B1 栋 525 (72)发明人。

2、 胡俊波 夏献民 王桂华 王晶 (74)专利代理机构 武汉开元知识产权代理有限 公司 42104 代理人 胡镇西 (54) 发明名称 一种多肽在制备治疗核因子 -B 异常活化 疾病药物中的用途 (57) 摘要 本发明涉及一种多肽在治疗核因子 -B 异 常活化疾病药物中的用途， 涉及炎症和自身免疫 性疾病及其他和核因子 -B（NF-B）活化异 常有关疾病的药物的应用。该多肽具有抑制核因 子-B活化， 并阻断核因子-B介导的多个参与 炎症过程的炎症因子的表达和产生， 达到抑制炎 症细胞的增殖和炎症细胞参与的炎症过程的生物 效应。应用该多肽及衍生物， 或通过转染相应的 cDNA 在细胞内表达该多肽，。

3、 能达到有效抑制炎症 细胞增殖及炎症过程的作用， 在制备炎症， 自身免 疫病及有关疾病的治疗药物、 及诊断试剂的中具 有独特的使用价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 1 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104043102 A CN 104043102 A 1/1 页 2 1.P15 多肽在制备治疗核因子 -B 异常活化疾病药物中的用途， 所述 P15 多肽的氨基 酸序列为 ： 甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-。

4、异亮氨酸-苯 丙氨酸 - 酪氨酸 - 异亮氨酸 - 谷氨酸 - 甲硫氨酸 - 天门冬氨酸 - 脯氨酸， 该多肽通过抑制 核因子-B的活化， 从而阻断核因子-B介导的信号转导通路， 影响核因子-B结合DNA 有关基因序列而改变多个参与炎症过程的蛋白质因子的表达和产生。 2. 根据权利要求 1 所述 P15 多肽在制备治疗核因子 -B 异常活化疾病药物中的用 途， 其特征在于 ： 所述疾病包括哺乳动物的病毒感染、 炎症和自身免疫性疾病， 及其他和核 因子 -B 异常活化有关的疾病。 3.P15 多肽的核苷酸编码序列在制备治疗核因子 -B 异常活化疾病药物中的用途。 4. 根据权利要求 3 所述 P。

5、15 多肽的核苷酸编码序列在制备治疗 NF-B 异常活化疾病 药物中的用途， 其特征在于 ： 所述疾病包括哺乳动物的病毒感染、 炎症和自身免疫性疾病， 及其他和核因子 -B 异常活化有关的疾病。 5.PTD-P15 融合多肽在制备治疗核因子 -B 异常活化疾病药物中的用途， 所述 PTD-P15 融合多肽的氨基酸序列为 ： 精氨酸 - 天门冬氨酸 - 亮氨酸 - 酪氨酸 - 天门冬氨 酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-赖氨酸-天门冬氨酸-精氨酸-甲硫氨酸-脯 氨酸 - 酪氨酸 - 丝氨酸 - 苏氨酸 - 谷氨酸 - 亮氨酸 - 异亮氨酸 - 苯丙氨酸 - 酪氨酸 - 异亮 氨酸 - 谷氨。

6、酸 - 甲硫氨酸 - 天门冬氨酸 - 脯氨酸。 6. 根据权利要求 5 所述 PTD-P15 融合多肽在制备治疗核因子 -B 异常活化疾病药物 中的用途， 其特征在于 ： 所述疾病包括哺乳动物的病毒感染、 炎症和自身免疫性疾病， 及其 他和核因子 -B 活化异常有关的疾病。 权 利 要 求 书 CN 104043102 A 2 1/7 页 3 一种多肽在制备治疗核因子 -B 异常活化疾病药物中的 用途 技术领域 0001 本发明属于医学生物工程领域， 涉及一种多肽在制备治疗核因子 -B 异常活化 疾病药物中的用途。 背景技术 0002 核因子 -B（NF-B）是调节细胞基因转录的关键因子之一，。

7、 活化后的核因 子 -B（NF-B） 可直接启动和调节众多参与炎症反应、 免疫反应相关基因的转录， 调控大 量细胞因子、 黏附分子的表达， 在机体的炎症、 免疫反应等方面发挥重要作用。免疫功能失 调引起的炎症和炎症相关性疾病 （病毒感染， 休克， 过敏性疾病， 炎症和自身免疫病） 严重危 害人类健康。大量研究表明， 这些疾病的发生与发展和 NF-B 的活化有密切关系， 因此研 究表明， 通过调控 NF-B 的活化， 从而对多种疾病的临床治疗发挥良好的干预作用， 寻找 有效抑制 NF-B 活化的化合物和药物就意味着寻找这些疾病的治疗手段。然而目前现代 医学和药物所应用的抑制 NF-B 活性的多种。

8、措施， 由于效价、 特异性、 副反应、 可行性等多 方面的问题， 临床应用往往受到限制。目前人们正加紧研发以 NF-B 和它介导的信号转导 通路为药物靶点的新化合物用于治疗多种疾病特别是炎症性疾病药物。 0003 NF-B 是一种能与免疫球蛋白轻链基因的增强子 B 序列 (GGGACTYrcc) 特异性结 合的核蛋白， 因首先发现其参与 B 细胞免疫球蛋白的 K 轻链转录调控而命名。NF-B 家族 成员中， 由 p50 p65 亚基形成的二聚体具有 NF-B 分子主要的生物活性。在细胞未受刺 激的状态下， NF-B 与一类被称为 NF-KB 抑制因子 (IKB) 的家族抑制蛋白结合， 使 NF。

9、-B 二聚体无法从细胞质向细胞核内转移， 阻止 NF-B 结合到相关基因序列， 从而抑制 NF-B 的调节蛋白质表达的生物活性。 当细胞受到各种内源性、 外源性的配体以及机械性、 化学性 等刺激后， IKB不再和NF-B结合， NF-B从胞质移位到核内， 并经过多个蛋白质激酶的磷 酸化激活， 激活后的NF-B并结合到靶基因的启动子或增强子区域的NF-B结合序列， 调 节 （增加或减少） 靶基因转录和蛋白合成。 0004 NF-B 可诱导许多因子转录， 如细胞因子、 趋化因子、 黏附分子、 生长因子、 免疫受 体、 促抑凋亡蛋白、 补体、 病毒、 iNOS、 COX-2 等， 特别是 NF-KB。

10、 和多种炎症性因子的表达和 产生密切相关， 比如 ： 白介素1(IL-1)， 白介素2(IL-2)， 白介素6(IL-6)， 白介素8(IL-8)， 肿 瘤坏死因子 A(TNF-A)， 内皮细胞黏附分子如自细胞黏附分子 -1(ELAM-1) 和细胞间黏附分 子 -1(ICAM-1)， 趋化因子如单核细胞趋化蛋白 -1(MCP-1) 等。所以， NF-B 对免疫功能的 调节非常关键， 而 NF-B 的活化在这一过程中起着至关重要的作用。 0005 虽然目前炎症发病的详细机制仍不明确， 多数研究认为免疫功能紊乱在炎症疾病 发病中起关键作用， 同时也发现 NF-B 的活化在大多数炎症疾病中存在， 所。

11、以 NF-B 的 活化过程目前已成为治疗炎症疾病的靶点， 而能阻断 NF-B 生物活性的抑制剂具有良好 的调节炎症过程的作用。细胞内外的多种刺激可通过多种信号通路激活 NF-B， 活化的 NF-B 可以调节多种基因的表达， 对多种细胞内过程特别是机体免疫反应起着非常重要 说 明 书 CN 104043102 A 3 2/7 页 4 的作用， 我们可以通过调节这些信号通路来抑制 NF-B 的活化， 从而调节多种炎症因子的 产生和分泌， 使炎症反应减轻或消除， 从而达到治疗多种疾病的目的。所以， 开发具有以 NF-B 激活的信号通路中任何一个环节为靶点的细胞内阻断剂， 以此来获得靶向性强、 副 作。

12、用小的药物， 为治疗多种疾病新药开发新的途径。 0006 目前研究已证实 PI3K（三磷酸肌醇 -3- 激酶） 参与了 NF-B 的活化和免疫反应 过程， 所以抑制 PI3K 的活性是一个切实可行的抑制 NF-B 信号转导从而达到治疗 NF-B 活化异常引起的疾病特别是炎症相关疾病的方法， 目前也有多种 PI3K 抑制剂正在进行临 床前或临床研究应用于治疗 NF-B 异常激活比如炎症性疾病， 但是， 由于目前开发的 PI3K 抑制剂存在抑制特异性低等问题， 体内毒性和副作用大， 严重影响了 PI3K 抑制剂应用于治 疗 NF-kB 异常活化相关疾病药物中。 0007 PI3K 由多个亚型成员构。

13、成， 其中 p55PIK 就是 PI3K 家族成员， 以前研究结果证明 p55PIK 参与了激活 NF-B 信号转导， 特别是高表达 p55PIK 促进了 NF-B 信号转导活化， 比如 p65 蛋白质的磷酸化。所以， 如果能阻断 p55PIK 信号转导是可以阻断 NF-B 活化， 从 而影响 NF-B 介导的生物学功能。 发明内容 0008 本发明的目的提供一种抑制 NF-B 活化的信号通路的多肽， 该多肽具备抑制 NF-B 活化的信号通路特别是降低 NF-B 中 p65 亚基的磷酸化的生物学功能， 从而调节 NF-B转录因子结合目的基因的能力， 影响NF-B目的基因产物蛋白质的转录和表达。。

14、 由 于 NF-B 参与了多种疾病过程， 所以该多肽可以有效治疗由于 NF-B 异常活化相关疾病 特别是炎症。除炎症外， 该多肽还可以用于治疗其他由于 NF-B 参与的疾病比如 ： 病毒感 染， 休克， 神经退化性疾病， 过敏性疾病和自身免疫病等。 0009 上述抑制NF-B活化的信号通路的多肽的氨基酸序列为 ： 甲硫氨酸-脯氨酸-酪 氨酸 - 丝氨酸 - 苏氨酸 - 谷氨酸 - 亮氨酸 - 异亮氨酸 - 苯丙氨酸 - 酪氨酸 - 异亮氨酸 - 谷 氨酸 - 甲硫氨酸 - 天门冬氨酸 - 脯氨酸， 简称 P15 多肽。P15 多肽具备抑制 NF-B 活化的 信号通路特别是降低 NF-B 中 p。

15、65 亚基的磷酸化的生物学功能， 从而调节 NF-B 转录因 子结合目的基因的能力， 影响 NF-B 目的基因产物蛋白质的转录和表达。由于 NF-B 参 与了多种疾病过程， 所以该多肽可以有效治疗由于 NF-B 异常活化相关疾病特别是炎症。 除炎症外， 该多肽还可以用于治疗其他由于 NF-B 参与的疾病比如 ： 病毒感染， 休克， 过敏 性疾病和自身免疫病等。 0010 本发明提供的是P15多肽在治疗NF-B异常活化疾病 （如病毒感染， 休克， 过敏性 疾病和自身免疫病） 的药物中的应用， 和 P15 多肽现已公开的阻断 PCNA 结合 DNA 聚合酶， 从 而阻止细胞 DNA 合成抑制细胞增。

16、殖的用途并不相同。 （建议保留， 这点很重要， 审查员百分 百可以查到原来的 P15 专利， 此处先行说明， 对以后答辩可以埋下伏笔） 0011 在研究中， 我们发现了一个多肽片段在细胞中抑制了NF-B中p65亚基蛋白质的 磷酸化。该多肽片段的序列为 ： 甲硫氨酸脯氨酸酪氨酸丝氨酸苏氨酸谷氨酸 亮氨酸异亮氨酸苯丙氨酸酪氨酸异亮氨酸谷氨酸甲硫氨酸-天门冬氨酸-脯 氨酸 ；（见 氨基酸和核苷酸序列表 ） ， 在以后该多肽称为 P15， 由于 NF-B 的 p65 蛋白质的 磷酸化改变了 NF-B 转录因子和其目的基因的结合及 NF-B 的目的基因的转录水平， 从 说 明 书 CN 10404310。

17、2 A 4 3/7 页 5 而改变了这些目的基因编码的蛋白质的表达和产生。 由于这些蛋白质很多参与了多种细胞 过程特别是免疫过程和炎症过程， 所以 P15 多肽片段是 NF-B 信号通路的抑制剂。根据这 一结果， 我们设想， 如果在细胞中表达 P15， 这一多肽能抑制 NF-B 的 p65 和 / 或其他蛋白 的磷酸化， 从而抑制了 NF-B 介导的信号转导通路。 0012 证明上述模型的关键之处在于把 P15 多肽导入细胞中， 再观察 P15 多肽对 NF-B 介导的信号转导通路 （比如 p65 磷酸化）和 NF-B 调节目的基因 （比如肿瘤坏死因子 A， TNF-） 表达和产生的影响。为达。

18、到这一目的， 我们采用分子生物学的手段， 制造一个 DNA 构建体， 这一构建体编码含有 P15 多肽片段的融合蛋白， 再把这种构建体转入培养的人细 胞中， 然后观察表达 P15 多肽片段的细胞中 NF-B 中 p65 亚基的磷酸化和细胞中编码 TNF 蛋白质的信使 RNA 量的变化。另外， 我们还通过人工合成的方式， 生产一个由具有穿透细 胞膜的多肽片段和 P15 多肽构成的 PTD-P15 融合多肽 ； PTD 的序列为 ： 精氨酸 - 天门冬氨 酸 - 亮氨酸 - 酪氨酸 - 天门冬氨酸 - 天门冬氨酸 - 天门冬氨酸 - 天门冬氨酸 - 赖氨酸 - 天 门冬氨酸 - 精氨酸。在培养的细。

19、胞中加入 PTD-P15 融合多肽， 再观察进入细胞的 P15 多肽 对 NF-B P65 亚基的磷酸化和细胞产生和分泌的 TNF- 的影响。为了观察 P15 多肽对动 物模型中炎症发生和发展的影响， 我们通过注射PTD-P15融合多肽， 观察PTD-P15融合多肽 能否抑制动物模型中炎症的发生和发展。 0013 实验结果表明， 在几种不同的培养细胞系中表达 P15 多肽或加入 PTD-P15 融合多 肽， P15 降低了 NF-B p65 亚基的磷酸化， 导致这些细胞的 NF-B 转录因子结合目的基因 （比如NF-B的一个主要目的基因TNF-） ， 抑制了NF-B的活化其他几个证明NF-B活。

20、 化的观察指标都显著降低， 证 明了P15多肽具有抑制NF-B活化能力， 是一个NF-B信号 通路抑制剂 ； 同时， 注射 PTD-P15 融合多肽能够抑制动物模型中炎症的发生和发展。 0014 P15 多肽在应用时， 可采用能穿膜的融合多肽的形式， 制成注射剂、 外用喷剂， 外用 涂抹液， 外用膏剂等， 或制备成脂质体包裹融合多肽的口服药剂， 此外， 还可将 P15 多肽的 核酸序列与质粒构建载体、 或插入病毒内， 然后制备成可以直接在细胞内表达的注射剂。 0015 需要说明的是， P15 多肽在制备成穿膜融合多肽时， 不限于和 PTD 这一种多肽片段 进行构建， 还可以采用其他具有穿膜功能。

21、的多肽片段， 都属于 P15 多肽的应用范围。 0016 本发明的有益效果 ： 与现有抑制 NF-B 激活的方法相比， 本发明的优点如下 ： 0017 P15 降低了 NF-B p65 的活化， 从而抑制了 NF-B 结合目的基因的作用， 导致 NF-B 调节的目的基因的转录水平的改变， 由于 NF-B 调节的目的基因编码的蛋白质参 与了多种生物过程和多种疾病的发生和发展， P15 的发明为治疗肿瘤和其他细胞生长异常 疾病新药的设计和筛选， 提供了一种新的方法和途径。同时， PTD-P15 融合多肽能有效地抑 制炎症， 证明 P15 多肽在穿透细胞膜后仍具有抑制 NF-B 激活的生物学效应， 。

22、也说明具有 穿膜功能的多肽或分子也可能用于帮助具有生物学活性 P15 穿透细胞膜。 0018 P15多肽毒副作用低， 抗原性弱， 实验结果也发现P15多肽对细胞凋亡没有明显 的影响， 所以对正常细胞没有明显的杀伤作用。由 PTD-P15 融合多肽加入培养细胞和应用 于动物体内， 也没有观察到明显的毒性。 0019 在细胞中表达P15多肽和PTD-P15融合多肽能有效抑制多种人类和鼠类肿瘤细 胞中 NF-B 的激活和动物模型中炎症疾病， 证明 P15 在由于 NF-B 异常激活导致疾病特 别是炎症的治疗方面具有高效、 广谱等优点。 说 明 书 CN 104043102 A 5 4/7 页 6 0。

23、020 PTD-P15 融合多肽分子量小， 能化学合成， 便于大规模直接应用于临床， 同时也 可用其他的方法 （比如用质粒及病毒载体） 把 P15 多肽投人到细胞内， 以达到治疗 NF-B 活 化相关疾病的目的。 附图说明 0021 图 1 为 P15 减少 NF-B 信号通路中 p65 蛋白质磷酸化的免疫印迹照片。 0022 图 2a 2f 为 P15 多肽抑制 TNF-， 白介素 1（IL-1） 和白介素 6（IL-6） 炎症 因子表达的对比数据图 ； 0023 图 2a 为 TNF-mRNA 的表达水平对比图 ； 0024 图 2b 为 IL-1mRNA 的表达水平对比图 ； 0025 。

24、图 2c 为 IL-6mRNA 的表达水平对比图 ； 0026 图 2d 为 TNF- 的浓度对比图 ； 0027 图 2e 为 IL-1 的浓度对比图 ； 0028 图 2f 为 IL-6 的浓度对比图。 0029 图 3 为小鼠注射 LPS 诱导的死亡试验中小鼠存活率对比图。 0030 图 4 为小鼠鼻炎试验中鼻腔组织病理切片的对比图。 具体实施方式 0031 下面借助具体实验及其数据结果对本发明进行论证说明， 但应该说明的是， 这些 例子并不对本发明加以限制。 P15多肽在下列实验中证明其抑制NF-B信号转导和激活的 生物学作用和 P15 在制备治疗 NF-B 活化相关疾病 （如炎症等）。

25、 药物的用途， 包括但不限于 下列实验。 0032 试验例 1 ： 在 pEGFP 质粒中引入编码 P15 多肽的 cDNA， DNA 构建体表达 P15-GFP 融 合蛋白的检测 0033 pEGFP-N1 质粒载体购于美国 Clontech 公司， 质粒包含编码绿色荧光蛋白 （GFP） 的 cDNA， 用 EcoRI-BamHI（购于美国 Promega 公司） 酶切质粒， 酶切后的质粒在琼脂糖胶中分 离、 纯化， 用于以后的连接反应。从胶中回收 DNA 片段的试剂盒来自德国 Qiagen 公司。 0034 编码 P15 多肽的 cDNA 来源于人工合成的双链 DNA， 其序列为 ： 00。

26、35 单链 1 ： 0036 5 TTTTGAATTCATGCCCTATTCGACAGAACTGATATTTTATATTGAAATGGATCCTGGATCC ； 0037 单链 2 ： 0038 5 TTTTGGATCCAGGATCCATTTCAATATAAAATATCTGTTCTGTCGAATAGGGCATGAATTC。 0039 两个单链混合后， 结合成双链 DNA， 产物经过纯化后 （纯化用的试剂盒来自德 国 Qiagen 公司） ， 用 EcoRI-BamHI 酶切 ； 再用琼脂糖胶纯化， 然后和酶切纯化后的载体 pEGFP-N1 进行连接反应 （连接试剂盒来自美国 Promega 公。

27、司） 。转化细菌后 （感受态细菌来 自美国 Promega 公司） ， 选出阳性克隆， 其 cDNA 序列的正确性通过核酸序列测定得到证实 后， 大规模纯化制备质粒 （大规模纯化试剂盒来自美国 Promega 公司） ， 用于以后的实验。这 种质粒在真核细胞分别表达一个 P15 和 GFP 的融合蛋白， 表达的 P15 连接在 GFP 的 N 未端， 该融合蛋白称为 P15-GFP。 说 明 书 CN 104043102 A 6 5/7 页 7 0040 转染试剂盒购于美国 Invitrogen（目录号为 11668） ， 转染实验也按照生产厂家提 供的使用说明完成。COS7 细胞培养在 10。

28、% 小牛血清 DMEM 营养液中。转染 48 小时后， COS7 细胞用生理盐水 （PBS） 洗两次， 加入细胞裂解液裂解细胞， 用超声波破坏 DNA 后， 加入适量 的 2- 巯基乙醇和溴酚蓝， 于沸水中处理 5 分钟， 置于冰上保存， 随后上样于质量浓度为 12% 的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离后的蛋白转移到尼龙膜上， 此膜用抗 GFP 抗体 （购于美 国 Invitrogen， 目录号为 R970） 检测融合蛋白的产生， 结果证实了 P15-GFP 在细胞中的表 达。 0041 试验例 2 ： P15 多肽的表达减少 NF-B 中 p65 的磷酸化 0042 因为 NF-B 中 p。

29、65 蛋白质 536 位丝氨酸的磷酸化增加 p65 调控多个炎症因子的 转录和表达， p65 的第 536 位丝氨酸磷酸化 （p-p65Ser536） 是 NF-B 活化的标志， 所以测定 NF-B p65 磷酸化水平是常用的检查 NF-B 信号转 导通路活化的指标之一。用 THP1 细 胞 （人单核白血病细胞系， 购自美国ATCC） 检测P15多肽对细胞中NF-B p65蛋白质磷酸化 （p-p65Ser536） 的影响。THP1 细胞在含质量浓度为 10% 胎牛血清 （FBS） 的 RPMI1640 培养液， 37、 5%（体积） C02/95%（体积） 空气培养条件下培养于 10 厘米细胞。

30、培养皿中。能识别 p65 蛋白质中 536 位丝氨酸磷酸化位点 （p-p65Ser536） 的特异性抗体和识别 p65 蛋白质的对照抗 体均来自 Santa Cruz biotechnology， inc. 0043 实验质粒 ： pEGFP-P15（表达 P15-GFP 融合蛋白） 0044 对照质粒 ： pEGFP-N1 0045 试验步骤 ： 将用于转染的质粒和脂质体转染试剂 （购自购于美国 Invitrogen） 混 合后， 室温放置 15 分钟， 分别加入培养于 RPMI1640 营养液的 THP1 细胞中 （细胞密度约为 50%） 在 37中培养 5 小时， 再加质量浓度为 10%。

31、 胎牛血清， 继续培养 48 小时。我们用上述 质粒转染 THP1 细胞， 两天后， 采用流式细胞仪把转染了 DNA 的 GFP 阳性细胞挑选出来， 分析 这些细胞的中 NF-B 中 p65 磷酸化的水平 （p-p65Ser536） 。 0046 试验结果表明 ： 表达 P15 能抑制细胞中 NF-B 中 p65 磷酸化水平。 0047 试验例 3 ： 人工合成由具有穿膜功能的多肽和 P15 多肽组成的 PTD-P15 融合多肽 0048 P15 多肽并不能自由通透细胞膜， 为了进一步观察 P15 对 NF-B 介导的信号转导 通路及多个炎症因子合成和产生的影响， 我们人工合成能穿透细胞膜的 。

32、P15 融合多肽。该 融合多肽被称为 PTD-P15 融合多肽， 0049 PTD-P15 融合多肽的氨基酸序列为 ： 精氨酸 - 天门冬氨酸 - 亮氨酸 - 酪氨酸 - 天 门冬氨酸 - 天门冬氨酸 - 天门冬氨酸 - 天门冬氨酸 - 赖氨酸 - 天门冬氨酸 - 精氨酸 - 甲硫 氨酸 - 脯氨酸 - 酪氨酸 - 丝氨酸 - 苏氨酸 - 谷氨酸 - 亮氨酸 - 异亮氨酸 - 苯丙氨酸 - 酪氨 酸 - 异亮氨酸 - 谷氨酸 - 甲硫氨酸 - 天门冬氨酸 - 脯氨酸 ； 0050 其中， P15片段的氨基酸序列为 ： 甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷 氨酸 - 亮氨酸 - 异亮氨酸。

33、 - 苯丙氨酸 - 酪氨酸 - 异亮氨酸 - 谷氨酸 - 甲硫氨酸 - 天门冬氨 酸 - 脯氨酸 ； 0051 具有穿透细胞膜功能的 PTD 多肽片段氨基酸序列为 ： 精氨酸 - 天门冬氨酸 - 亮氨 酸 - 酪氨酸 - 天门冬氨酸 - 天门冬氨酸 - 天门冬氨酸 - 天门冬氨酸 - 赖氨酸 - 天门冬氨 酸 - 精氨酸。 0052 同时设计和合成一个对照多肽， 其氨基酸序列为 ： 天门冬氨酸 - 精氨酸 - 精氨 说 明 书 CN 104043102 A 7 6/7 页 8 酸 - 天门冬氨酸 - 亮氨酸 - 酪氨酸 - 天门冬氨酸 - 天门冬氨酸 - 天门冬氨酸 - 天门冬氨 酸 - 赖氨。

34、酸 - 天门冬氨酸 - 精氨酸 - 甲硫氨酸 - 丙氨酸 - 甘氨酸 - 苏氨酸 - 甲硫氨酸。 0053 试验例 4 ： PTD-P15 融合多肽抑制 NF-Bp65 蛋白质的磷酸化。 0054 因为NF-B中p65蛋白质536位丝氨酸的磷酸化增加p65调控多个炎症因子的转 录和表达， p65 蛋白质中 563 位丝氨酸磷酸化 (p-p65Ser536) 是 NF-B 活化的标志， 所以测定 NF-B p65 磷酸化水平是常用的检查 NF-B 信号转导通路活化的指标之一。人外周血白 细胞 （采集用正常志愿者） 培养于培养皿中， 分别加入试验例 3 中合成的对照多肽、 PTD-P15 融合多肽。

35、， 细胞培养过夜后， 收集细胞， 用免疫印迹法检查细胞中 NF-B 中 p65 蛋白质中 536 位的丝氨酸磷酸化水平， 免疫印迹照片如图 1 所示， 纵向来看 ： a 为空白对照、 b 为对照 多肽、 c 为 P15 多肽 ； 横向来看 ： X 为磷酸化 p65（p-p65Ser536） 水平、 Y 为 p65 蛋白质水平、 Z 为 GAPDH（甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶） 水平。结果显示 PTD-P15 融合多肽能减少 p65 磷酸化， 所以， PTD-P15融合多肽能抑制细胞中NF-B的活化， 而已阻断了NF-B介导的信号转导。 0055 试验例 5 ： PTD-P15 融合多肽影响多个。

36、炎症因子的产生和表达的实验。 0056 因为 NF-B 调节血液白细胞中多个炎症因子的转录和表达， 所以测定血液白细 胞产生和分泌炎症因子是常用的检查 NF-B 信号转导通路活化的指标之一。 0057 收集健康人外周血 5 毫升， 分离其中的白细胞， 采用脂多糖 （LPS） 刺激人外周白细 胞表达多种炎症因子， 再加入 PTD-P15 融合多肽， 检测其对多个炎症因子 （TNF-， 白介素 1 和白介素 6） 表达 （mRNA） 和产生的影响。 0058 试验步骤 ： 分离的外周白细胞分成 6 组， 分别在含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培养 液， 37， 5%（体积） CO2/95。

37、%（体积） 空气培养条件下培养于 10 厘米细胞培养皿， 其中一组 培养细胞中加入对照多肽 （空白对照组） 用以对照， 另外5组分别添加融合多肽、 融合多肽及 LPS、 LPS、 对照多肽及 LPS。添加融合多肽的时机为加入 LPS（100 微克 / 毫升） 2 小时后， 加入 PTD-P15 融合多肽 （浓度 100 微克 / 毫升） ， 培养 24 小时收取细胞培养液和细胞， 测定 培养液中的炎症因子 （TNF-， 白介素1和白介素6） ， 收集细胞的mRNA， 利用定量RT-PCR分 析细胞中 mRNA 表达。结果如图 2a 2f 所示， 图中编号及对应的组别为， 01 为对照、 02 。

38、为 融合多肽、 03 为融合多肽 +LPS、 04 为 LPS、 05 为对照多肽 +LPS、 06 为对照多肽。 0059 结果表明 ： PTD-P15 融合多肽抑制细胞中 LPS 诱导的炎症因子的表达和产生。 0060 试验例 6 ： PTD-P15 融合多肽抑制 LPS 诱导的炎症小鼠死亡的实验。 0061 因为脂多糖 （LPS） 可以激活炎症细胞的增殖和炎症因子的产生和分泌， 引起动物 的炎症反应， 大剂量的脂多糖注射动物腹腔可以导致动物严重的全身炎症反应， 从而导致 动物的死亡。取 6-8 周雌性 BABL/c 小鼠随机分为 3 组， 各组小鼠分别通过尾静脉注射 0.2 毫升溶剂， 。

39、对照多肽、 PDT-P15 多 肽 （多肽注射量为 75 毫克 / 公斤体重） ， 24 小时后， 每组的 半数动物 （10 只） 通过腹腔注射脂多糖 （LPS， 50 毫克 / 公斤体重， 购自 Sigma 公司， 从大肠 杆菌菌株 Escherichia coli0111:B5 中分离纯化， 活性为 1105EU/mg） ， 组中的其他动物不 做任何处理， 2 小时后， 取 250 微升小鼠血液用作有关血液中炎症因子 （TNF-a） 浓度测定， 动 物放回动物房， 每天观测各组动物存活情况， 共观测 10 天， 小鼠存活结果用相应的计算机 统计软件分析。小鼠注射成分、 注射量及生存率见表 。

40、1。 0062 表 1 小鼠注射成分、 注射量及生存率表 0063 说 明 书 CN 104043102 A 8 7/7 页 9 0064 结果表明， 注射 PDT-P15 多肽对小鼠的血液炎症因子和生存无明显影响， 注射 LPS 后， 小鼠血液炎症因子浓度明显升高， 同时小鼠死亡频繁发生， 显示 LPS 可以在小鼠体内引 起严重的炎症反应导致小鼠死亡， 相比， 注射 PTD-P15 多肽的小鼠血液炎症因子浓度比较 低， 同时， 小鼠的死亡减少， 注射 PTD-P15 多肽对小鼠注射 LPS 诱导的死亡试验影响的结果 见图3， 图中横轴代表LPS注射后的时间 （hour） ， 纵轴代表小鼠存活。

41、率 （%） ， 11为对照， 12为 PTD-P15多肽， 13为对照多肽， 14为空白对照+LPS， 15为PTD-P15+LPS， 16为对照多肽+LPS。 结果显示， 与对照组相比， 注射 PTD-P15 治疗的小鼠 LPS 注射导致的死亡减少， PTD-P15 降 低 LPS 诱导的 TNF-a 产生， 减少 LPS 引起动物死亡。 0065 试验例7 ： PTD-P15多肽抑制小鼠鼻炎模型中发炎部位的TNF-a水平和炎症细胞侵 润的实验。 0066 炎症疾病中， 发炎部位炎症因子(比如TNF-a)的产生和炎症细胞的聚集是炎症反 应的标志。为观察 PTD-P15 多肽对炎症模型中的炎症。

42、的影响， 我们首先在小鼠中建立鼻炎 的疾病模型， 再应用多肽于小鼠鼻腔后， 检测炎症部位的 TNF-a 的量和炎症细胞的侵润。取 6-8 周雌性 BABL/c 小鼠通过皮下注射 0.2 毫升含有佐剂 ( 氢氧化铝 ) 和卵清白蛋白溶剂， 注射每两星期重复一次， 4个星期后， 在小鼠的鼻腔滴入2滴0.2卵清白蛋白溶液， 每天两 次， 2个星期后， 可以观察到小鼠鼻腔严重的炎症症状。 此时， 动物分为2组， 分别滴入0.1 对照多肽和 0.1 PTD-P15 多肽溶液， 每天 3 次， 连续处理 7 天， 处死动物， 采集小鼠鼻腔组 织， 做病理切片， 检测炎症部位的TNF-a量和炎症细胞的侵润，。

43、 切片照片如图4所示， 图中 为对照多 肽处理组的 TNF-a 染色切片照片， 为 PTD-P15 多肽处理组的 TNF-a 染色切片照 片， 为对照多肽处理组的白细胞染色切片照片， PTD-P15 多肽处理组的白细胞染切片 色照片。 0067 结果表明， 对照多肽处理组小鼠鼻炎的发炎部位中含有大量的 TNF-a， 并伴随大量 的炎症细胞的侵润， 而应用PTD-P15多肽溶液的小鼠炎症部位的TNF-a明显减少， 炎症细胞 的侵润也明显减少。结果证实 PTD-P15 治疗炎症的良好效果。 说 明 书 CN 104043102 A 9 1/1 页 10 序列表 序 列 表 CN 104043102 A 10 1/3 页 11 图 1 图 2a 图 2b图 2c 图 2d 图 2e 说 明 书 附 图 CN 104043102 A 11 2/3 页 12 图 2f 图 3 说 明 书 附 图 CN 104043102 A 12 3/3 页 13 图 4 说 明 书 附 图 CN 104043102 A 13 。