野马追黄酮部位在制备抗急性肺损伤药物中的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104042658 A (43)申请公布日 2014.09.17 CN 104042658 A (21)申请号 201410222843.6 (22)申请日 2014.05.23 A61K 36/28(2006.01) A61P 11/00(2006.01) (71)申请人 苏州大学 地址 215123 江苏省苏州市工业园区仁爱路 199 号 (72)发明人 张健 褚纯隽 任慧玲 严彪 李贺然 陈韶华 陈晶磊 (74)专利代理机构 北京康盛知识产权代理有限 公司 11331 代理人 伊美年 (54) 发明名称 野马追黄酮部位在制备抗急性肺损伤药物中 的应用 (57) 。

2、摘要 本发明公开了一种野马追黄酮部位在制备 抗急性肺损伤药物中的应用。本发明中野马追 黄酮中含有棕矢车菊素和泽兰叶黄素。将野马 追黄酮部位制备成动物用药， 对小鼠体内给药， 测定诱导性急性肺损伤小鼠的肺湿 / 干重比， 肺 泡灌洗液 (BALF) 中一氧化氮 (NO) 和蛋白质含 量 ； 检测肺组织匀浆中髓过氧化酶 (MPO) 和超氧 化物歧化酶 (SOD) 活性 ； 肺泡灌洗液中肿瘤坏 死因子 -(TNF-)、 白介素 -6(IL-6) 和白介 素 -1(IL-1) 含量 ； 血清中补体 C3 和 C3c 含 量 ； 观测小鼠肺组织病理改变。结果表明， 野马追 黄酮部位具有抗急性肺损伤作用。。

3、 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 12 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 附图12页 (10)申请公布号 CN 104042658 A CN 104042658 A 1/1 页 2 1. 一种野马追黄酮部位在制备抗急性肺损伤药物中的应用。 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述野马追黄酮部位是指含棕矢车菊素 和泽兰叶黄素的野马追黄酮部位。 3. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述野马追黄酮部位的制备方法为 ： 取野 马追干燥全草， 切段 2 3cm， 加 8 15 倍体。

4、积的体积分数为 60 95乙醇水溶液， 回 流提取 1 3 小时， 重复 1 3 次， 40 60减压回收溶剂， 得野马追乙醇提取物 ； 将该 提取物溶于水中， 制备成浓度为 0.5 1g/ml 的溶液， 经弱极性大孔吸附树脂吸附， 先以水 洗脱除去大分子化合物， 然后用体积分数为 90 95乙醇水溶液洗脱， 40 60减压 回收溶剂得大孔树脂部位 ； 所得大孔树脂部位经 ODS 反相硅胶色谱柱吸附， 先以体积分数 为 50甲醇水溶液洗脱， 然后用 70 75甲醇水溶液洗脱， 40 60减压回收溶剂 后， 再经 30 60 目聚酰胺色谱柱吸附， 先以体积分数为 70 75乙醇水溶液洗脱， 后用。

5、 95 100乙醇洗脱， 40 60减压回收溶剂， 得野马追黄酮部位。 4. 根据权利要求 3 所述的应用， 其特征在于， 所述弱极性大孔吸附树脂为 AB-8、 D101、 HPD-100、 HPD-200A、 HPD-200B、 HPD-300、 HPD-700、 HPD-722 大孔吸附树脂中的一种。 5.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述ODS反相硅胶色谱柱为DAISOGEL ODS 反相硅胶填料粒径 50 70um、 Cosmsil ODS 反相硅胶填料粒径 50 70um、 YMCODS-A 反相 硅胶填料粒径 50 70um 中的一种。 6. 根据权利要求 3 所述的应。

6、用， 其特征在于， 所述水与弱极性大孔吸附树脂体积比为 8 15:1 ； 所述 90 95乙醇水溶液与大孔吸附树脂体积比为 8 15:1 ； 所述 ODS 反 相硅胶色谱柱柱体积与所得大孔树脂部位质量比为 20 30:1 ； 所述 50甲醇水溶液和 70 75甲醇水溶液与 ODS 反相硅胶色谱柱的体积比均为 5 8:1 ； 所述聚酰胺色谱柱 柱体积与吸附样品的质量比为 20 30:1 ； 所述 70 75乙醇水溶液及 95 100乙 醇与聚酰胺色谱柱体积比均为 4 10:1。 权 利 要 求 书 CN 104042658 A 2 1/8 页 3 野马追黄酮部位在制备抗急性肺损伤药物中的应用 技。

7、术领域 0001 本发明涉及一种野马追黄酮部位在制备抗急性肺损伤药物中的应用。 背景技术 0002 急性肺损伤 (acute lung injury,ALI) 是以弥漫性肺细胞损伤为基础， 肺血 管损伤所致的肺水肿和肺组织炎性细胞浸润为其病理特征， 临床主要表现为严重的低 氧血症、 弥漫性肺浸润和肺水肿 ； 部分患者最终将会形成急性呼吸窘迫综合征 (acute respiratory distress syndrome,ARDS)， 造成机体不可逆的急性呼吸功能衰竭和多器 官功能障碍， 病死率高达 30 -40 ； ALI 发病机制错综复杂， ALI 发病危险因素可以是 来自肺的直接损伤， 也。

8、可以是肺外因素通过全身性炎性反应对肺产生的间接损伤。( 参 见 ： Baffert F,Le T,Thurston G,et al.Angiopoietin-1decreases plasma leakage by reducing number and size of endothelial gaps in venules.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006,290(1):H107-H118 ； Ware L B,Matthay M A.Medical progress-The acute respiratory distress syndrome.N 。

9、Engl J Med,2000,342(18):1334-1349 ； Matthay M A,Zimmerman G A,Esmon C,et al.Future research directions in acute lung injury:summary of a National Heart,Lung,and Blood Institute working group.Am J Respir Crit Care Med,2003,167(7):1027-1035.) 0003 目前， 国内外公认治疗 ALI 的方案 ： (1) 去除病因 ； (2) 在积极治疗原发病的基础 上， 尽早。

10、机械通气 (Mechanical ventilation,MV) 来纠正缺氧和改善组织供氧 ； MV 是 ALI 经典治疗方式之一， 能够纠正难治性缺氧， 防治肺泡萎陷， 对抗肺水肿， 改善气体交换， 减少 自主呼吸作功， 防止呼吸肌疲劳 ； 但仅能维持机体生理呼吸， 尚不能完全解决 ALI 全部问 题 ； (3) 药物治疗 ； 临床上广泛使用肾上腺糖皮质激素、 糖皮质激素、 环磷酰胺、 甲胺蝶呤等 治疗急性肺损伤， 能减少毛细血管渗出和抑制肺纤维化的形成， 使肺功能得到快速的改善 ； 但糖皮质激素等免疫抑制剂对急性肺损伤选择性差， 长期应用会产生多种并发症和副作用 (参见 ： 杨永涛,汪正清。

11、.补体抑制剂研究进展.中国新药杂志,2008,17(24):2093 ； 徐晗, 章蕴毅 , 张建文 , 等 . 天然产物中的抗补体活性成分 . 中国天然药物 ,2007,5(5):322.)。 因此， 寻找选择性高、 毒副作用小的治疗急性肺损伤药物具有重要的临床意义。 0004 野马追是菊科植物尖佩兰 Eupatorium lindleyanum DC. 的全草， 江苏道地药材。 味苦、 性平， 归肝、 脾经， 具有化痰止咳、 清热解毒、 利尿消肿、 降压的功能， 用于感冒、 咳嗽多 痰、 头疼、 扁桃体炎、 菌痢和高血压(参见 ： 国家中医药管理局， 中华本草， 上海:上海科技出 版社 ,。

12、1999:7,6876)。 0005 江舟、 杨辉等研究表明野马追提取液对油酸型急性肺损伤大鼠具有保护作用， 能 明显降低油酸型急性肺损伤大鼠的渗出细胞数、 蛋白含量、 肺系数及肺含水量和肺血管通 透性 ( 参见 ： 江舟 , 杨辉 , 何海霞 , 等 . 野马追对大鼠急性肺损伤保护作用研究， 中国药 房 ,2007,18(27):2094 ； 杨辉 , 周远大 , 何海霞 . 野马追对急性油酸性肺损伤大鼠肺血管 通透性的影响 . 中国药业 ,2010,19(9):5.)。但上述研究均是采用制药公司直接提供的野 说 明 书 CN 104042658 A 3 2/8 页 4 马追提取液， 野马追。

13、对急性肺损伤保护作用的活性成分不明确， 作用机制不清楚。 棕矢车菊 素和泽兰叶黄素均为黄酮类化合物， 从野马追分离得到 ( 参见吴双庆， 孙群， 褚纯隽， 张健， 野马追化学成分， 中国中药杂志， 2012,37(7):937)， 棕矢车菊素和泽兰叶黄素对人结肠癌 HCT8 细胞与人肺癌 A549 细胞具有抑制作用 ( 参见 ： 黄梦初， 廖志新， 陈道峰， 沙生风毛菊的 化学成分及其细胞毒活性， 中草药， 2007,38(10):1463)。 但棕矢车菊素、 泽兰叶黄素是否具 有抗急性肺损伤作用， 未见报道， 本发明发现从野马追中制备的黄酮部位 ( 棕矢车菊素与 泽兰叶黄素的组成 ) 具有抗。

14、急性肺损伤的活性。 发明内容 0006 本发明目的是提供一种野马追黄酮部位 (EUP-FLA) 在制备抗急性肺损伤药物中 的应用。 0007 本发明的技术方案是 ： 本发明将野马追黄酮部位制备成动物用药， 然后对小鼠体 内给药， 测定急性肺损伤小鼠的肺湿 / 干重比， 肺泡灌洗液 (BALF) 中一氧化氮 (NO) 和蛋白 质含量 ； 检测肺组织匀浆中髓过氧化酶 (MPO) 和超氧化物歧化酶 (SOD) 活性 ； 肺泡灌洗液 中肿瘤坏死因子 -(TNF-)、 白介素 -6(IL-6) 和白介素 -1(IL-1) 含量 ； 血清中补体 C3和C3c含量 ； 观测小鼠肺组织病理改变。 小鼠急性肺损。

15、伤实验结果表明， 野马追黄酮部位 可以减轻小鼠肺部水肿症状， 降低肺泡灌洗液中一氧化氮 (NO) 和蛋白质的含量， 显著地增 强了小鼠肺组织内超氧化物歧化酶(SOD)的活性， 抑制髓过氧化酶(MPO)的活性， 降低了肿 瘤坏死因子 -(TNF-)、 白介素 -6(IL-6) 和白介素 -1(IL-1) 的含量， 减少血清中补 体 C3 和补体片段 C3c 的含量并改善补体片段 C3c 在肺组织的沉积， 对小鼠的肺组织、 肺细 胞、 毛细血管均具有保护作用。实验结果确定， 野马追中黄酮部位具有抗急性肺损伤作用。 0008 本发明中野马追黄酮部位制备方法为 ： 取野马追干燥全草， 切段 2 3cm。

16、， 加 8 15 倍体积的体积分数为 60 95乙醇水溶液， 回流提取 1 3 小时， 重复 1 3 次， 40 60减压回收溶剂， 得野马追乙醇提取物 ； 将该提取物溶于水中， 制备成浓度为 0.5 1g/ml 的溶液， 经弱极性大孔吸附树脂吸附， 先以水洗脱除去大分子化合物， 然后用 体积分数为 90 95乙醇水溶液洗脱， 40 60减压回收溶剂， 得大孔树脂部位 ； 所 得大孔树脂部位经 ODS 反相硅胶色谱柱吸附， 先以体积分数为 50甲醇水溶液洗脱， 然后 用 70 75甲醇水溶液洗脱， 40 60减压回收溶剂后， 再经 30 60 目聚酰胺色谱 柱吸附， 先以体积分数为7075乙醇。

17、水溶液洗脱， 后用95100乙醇洗脱， 40 60减压回收溶剂， 得野马追黄酮部位。 0009 进一步， 优选的， 所述弱极性大孔吸附树脂为 AB-8、 D101、 HPD-100、 HPD-200A、 HPD-200B、 HPD-300、 HPD-700、 HPD-722 大孔吸附树脂中的一种。 0010 更进一步， 优选的， 所述 ODS 反相硅胶色谱柱为 DAISOGEL ODS 反相硅胶填料粒径 50 70um、 Cosmsil ODS 反相硅胶填料粒径 50 70um、 YMCODS-A 反相硅胶填料粒径 50 70um 中的一种。 0011 更进一步， 优选的， 所述水与大孔吸附树。

18、脂体积比为 8 15:1 ； 所述 90 95 乙醇水溶液与大孔吸附树脂体积比为 8 15:1 ； 所述反相硅胶色谱柱柱体积与所得大孔树 脂部位质量比为2030:1 ； 所述50甲醇水溶液和7075甲醇水溶液与反相硅胶色 谱柱的体积比均为 5 8:1 ； 所述聚酰胺色谱柱柱体积与吸附样品的质量比 20 30:1 ； 所 说 明 书 CN 104042658 A 4 3/8 页 5 述 70 75乙醇水溶液和 95 100乙醇与聚酰胺色谱柱的体积比均为 4 10:1。 0012 经高效液相色谱分析得出， 本发明野马追黄酮部位含有棕矢车菊素和泽兰叶黄素 成分。 0013 本发明的优点是为抗急性肺损。

19、伤提供了一种新的药物来源。 附图说明 0014 下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述 ： 0015 图 1 为实施例 1 中样品 1 和 2 野马追黄酮部位高效液相色谱图的对比图 0016 其中 1(a)， 1(b) 分别对应为样品 1、 样品 2 的色谱图 ； 0017 图 2 为实施例 1 对照品泽兰叶黄素的高效液相色谱图 ； 0018 图 3 为实施例 1 对照品棕矢车菊素的高效液相色谱图 ； 0019 图 4 为实施例 2 各实验组肺湿干重比 W/D ratio 的对比 ； 0020 图 5 为实施例 2 各实验组肺泡灌洗液中一氧化氮 (NO) 含量对比 ； 0021 图 6 为实。

20、施例 2 各实验组肺泡灌洗液中总蛋白含量的对比 ； 0022 图 7 为实施例 2 各实验组肺泡灌洗液中炎症因子 TNF- 水平的对比 ； 0023 图 8 为实施例 2 各实验组肺泡灌洗液中炎症因子 IL-6 水平的对比 ； 0024 图 9 为实施例 2 各实验组肺泡灌洗液中炎症因子 IL-1 水平的对比 ； 0025 图 10 为实施例 2 各实验组肺组织中 MPO 的活性对比 ； 0026 图 11 为实施例 2 各实验组肺组织中 SOD 的活性对比 ； 0027 图 12 为实施例 2 各实验组血清中 C3 含量对比 ； 0028 图 13 为实施例 2 各实验组血清中 C3c 含量。

21、对比 ； 0029 其中图 4-13 中， 对应的 Control 为空白组， EUP-FLA 为对照组， LPS 为模型组， LPS+EUP-FLA 组为不同剂量的药物组， LPS+DXM 为阳性组 ； 0030 图 14 为实施例 2 各实验组肺组织 H&E 染色后的切面图 (X400) 的对比图 ； 0031 图 15 为实施例 2 各实验组肺组织 C3c 沉积免疫组化的切面图 (X400) 的对比图 ； 0032 图 16 为实施例 3 各实验组肺湿干重比 W/D ratio 的对比 ； 0033 图 17 为实施例 3 各实验组肺泡灌洗液中总蛋白含量的对比 ； 0034 图 18 为。

22、实施例 3 各实验组肺泡灌洗液中炎症因子 TNF- 水平的对比 ； 0035 图 19 为实施例 3 各实验组血清中补体 C3 含量的对比 ； 0036 图 20 为实施例 3 各实验组血清中补体片段 C3c 含量的对比 ； 0037 其中图 16-20 中， 对应的 Control 为空白组， LPS 为模型组， EtOH 为野马追乙醇提 取物组， FLA 为野马追黄酮部位组， LPS+DXM 为阳性组 ； 具体实施方式 0038 实施例 1 ： 0039 野马追黄酮部位 (EUP-FLA) 的制备及活性成分的检测 0040 (1) 野马追黄酮部位 (EUP-FLA) 的制备 0041 样品。

23、1 ： 称取300g野马追干燥全草， 切段23cm， 加10倍体积的体积分数为80 乙醇水溶液， 回流提取2小时， 重复2次， 40减压回收溶剂， 得野马追乙醇提取物45g， 将该 说 明 书 CN 104042658 A 5 4/8 页 6 乙醇提取物溶于约 90ml 水中， 经 D101 大孔吸附树脂 500ml 吸附， 先以 5000ml 水洗脱除去 大分子化合物， 后用 5000ml 体积分数为 95乙醇水溶液洗脱， 减压回收溶剂， 得 17g 大孔 树脂部位 ； 所得大孔树脂部位经350mlYMCODS-A反相硅胶填料粒径60um反相硅胶色谱柱吸 附， 先以 1750ml 体积分数为。

24、 50甲醇水溶液洗脱， 然后 1750ml70甲醇水溶液洗脱， 40 减压回收溶剂， 得6g提取物， 该提取物再经150ml3060目聚酰胺色谱柱吸附， 先以600ml 体积分数为 70乙醇水溶液洗脱， 后用 600ml95乙醇洗脱， 40减压回收溶剂， 得野马追 黄酮部位 (EUP-FLA)0.8g。 0042 样品 2 ： 称取 1000g 野马追干燥全草， 切段 2 3cm， 加 15 倍体积的体积分数为 80乙醇水溶液， 回流提取 2 小时， 重复 2 次， 60减压回收溶剂， 得野马追乙醇提取物 158g， 溶于约 150ml 水中， 经 1800ml AB-8 大孔吸附树脂吸附， 。

25、先以 20000ml 水洗脱除去大 分子化合物， 后用 20000ml 体积分数 95乙醇水溶液洗脱， 60减压回收溶剂， 得 61g 大孔 树脂部位 ； 所得大孔树脂部位经1500ml Cosmsil ODS反相硅胶填料粒径70um反相硅胶色谱 柱吸附， 以 10000ml 体积分数为 50甲醇水溶液洗脱， 然后 10000ml70甲醇水溶液洗脱， 60减压回收溶剂， 得 20g 提取物， 该提取物再经 600ml30 60 目聚酰胺色谱柱吸附， 先以 4000ml70乙醇水溶液洗脱， 后用 4000ml100乙醇洗脱， 60减压回收溶剂， 得野马追黄 酮部位 (EUP-FLA)2.8g。 。

26、0043 (2) 野马追黄酮部位 (EUP-FLA) 活性成分检测 0044 本 实 施 例 采 用 高 效 液 相 色 谱 分 析 法 测 定 其 成 分。 高 效 液 相 色 谱 仪 (Agilent1260Infi nity， 美国安捷伦公司 )， 其高效液相色谱条件为 ： 流动相 A 为乙腈 ( 含 0.1甲酸 ) ； 流动相 B 为水 ( 含 0.1甲酸 ) ； 流动相条件 ： 见表 1 ； 色谱柱 ： YMC-PACK ODS-A(4.6mm250mm,5m) ； 柱 温 ： 28 ； 检 测 波 长 ： 365nm ； 进 样 量 ： 20l ； 流 速 ： 1mlmin-1。 。

27、0045 表 1HPLC 色谱分析条件 0046 时间 (min)流动相 A( ) 流动相 B( ) 03664 153664 309010 0047 分别精密称取对照品泽兰叶黄素 4.67mg 和棕矢车菊素 8.17mg ； 并用流动相 A 定 容至 10ml， 作为储备液， 加流动相 A 对倍稀释配成 1:2、 1:4、 1:8、 1:16 和 1:32， 用 0.22m 滤膜过滤， 滤液备用。取 5 个浓度的对照品进行色谱的测定， 并绘制标准曲线， 每个浓度点 平行分析 3 次。记录各色谱峰峰面积， 以对照品峰面积 (y) 对其浓度 (x) 进行线性回归， 得 到对照品的标准曲线， 泽兰。

28、叶黄素 y 52964x+19.30， 棕矢车菊素 y 55161x+210.79。 0048 精密称取实施例 1 中制备的野马追黄酮部位 EUP-FLA 样品 1、 样品 2 各 6mg， 并用 流动相 A 定容至 10ml 容量瓶， 0.22m 滤膜过滤， 滤液备用， 分别取滤液进行色谱测定。 0049 如图1-3为得到的样品1和2野马追黄酮部位 ； 对照品泽兰叶黄素、 对照品棕矢车 菊素的高效液相色谱图。 说 明 书 CN 104042658 A 6 5/8 页 7 0050 经过高效液相色谱分析方法分析得出两组野马追黄酮部位样品中均含有泽兰叶 黄素和棕矢车菊素， 将样品1和2的色谱信号。

29、值代入标准曲线， 进一步得出各组分的具体含 量， 如表 2 所示。 0051 表 2 野马追黄酮部位中 2 种黄酮的含量 0052 样品泽兰叶黄素 ( ) 棕矢车菊素 ( )总比例 ( ) 125.265.790.9 226.066.192.1 0053 实施例 2 ： 0054 野马追黄酮部位 (EUP-FLA) 的抗小鼠急性肺损伤实验 0055 1、 实验药品与试剂 ： 野马追黄酮部位 (EUP-FLA) ； 0.5羧甲基纤维素钠 ； 脂多糖 (LPS)， 美国 Sigma-Aldrich 公司 ； 对照药， 醋酸地塞米松片， 浙江仙琚制药股份有限公司 ； 多抗兔抗人 C3c 补体， 上海。

30、瑞齐生物技术有限公司 ； 蒸馏水 ； 生理盐水 ； 20乌拉坦 - 生理 盐水 ； 4福尔马林， H-E 染色液等。 0056 2、 实验小鼠 ： Balb/c 小鼠， 雄性， 体重 20 24 克， 由苏州大学实验动物中心提 供， 实验动物生产许可证 ： XCYK( 苏 )2002-0008。实验动物饲养在温度 241， 相对湿度 40 80的环境下， 自由采食和饮水。在实验前， 适应性饲养 7 天。 0057 3、 其 他 材 料 ： 小 鼠 肿 瘤 坏 死 因 子 -(TNF-)、 白 介 素 -6(IL-6) 和 白 介 素 -1(IL-1) 试剂盒， 上海船夫贸易有限公司 ； 一氧化。

31、氮 (NO)、 BCA、 超氧化物歧化酶 (SOD)和髓过氧化酶(MPO)试剂盒， 南京建成生物工程研究所 ； 小鼠Complement3(C3)ELISA 试剂盒， 苏州赛德生物技术有限公司， 小鼠补体片段 C3c ELISA 试剂盒， 上海源叶生物技术 有限公司 ； 手术刀片、 注射器、 滤纸、 匀浆机等。 0058 4、 实验方法 ： 0059 Balb/c 小鼠随机分组为空白组、 对照组、 模型组、 样品大剂量组、 样品中剂量组、 样品小剂量组和阳性组， 每组 20 只， 样品大剂量组、 样品中剂量组、 样品小剂量组统称为药 物组。空白组和模型组连续给予蒸馏水 7 天， 剂量为 0.5。

32、ml/25g ； 阳性组连续给予蒸馏水 6 天， 剂量为 0.5ml/25g ； 对照组和药物组按照剂量给予野马追黄酮部位配制的药品， 连续灌 胃给药 7 天， 其中， 野马追黄酮部位 (EUP-FLA) 具体剂量 ： 对照组 40mg/kg、 野马追黄酮部位 (EUP-FLA) 小、 中、 大剂量组分别为 10mg/kg、 20mg/kg、 40mg/kg。阳性组在第 7 天给予地塞 米松 5mg/kg ； 第 7 天药物组和阳性组在给药后 2h， 模型组给予蒸馏水后 2h， 药物组、 阳性组 与模型组， 以20乌拉坦-生理盐水(4ml/kg)腹腔注射轻微麻醉小鼠， 打开颈部， 往气管内 注。

33、入 LPS(2ml/kg， 1mg/ml LPS- 生理盐水 )， 空白组和对照组同法气管注入生理盐水 (2ml/ kg)。6h 后， 过量麻醉小鼠， 收集右肺的肺泡灌洗液 (BALF) 用于测定一氧化氮 (NO) 和蛋白 质含量， 收集左肺用于测定肺湿 / 干重比 W/D ratio， 收集小鼠血液样本用于测定血清中 C3 和 C3c 含量。24h 后， 过量麻醉小鼠， 收集右肺下叶于 4福尔马林中固定， 待做病理和免疫 组化观察， 收集右肺上叶 BALF， 用于测定炎症因子含量， 收集左肺制成做组织匀浆， 用于测 定 MPO 和 SOD 活性。 说 明 书 CN 104042658 A 7。

34、 6/8 页 8 0060 上述肺泡灌洗液 (BALF) 的制备方法为 ： 分离气管， 自环状软骨下方用手术刀片 作斜向切口， 将自制的平头针插入气管， 用缝合线固定， 分离心肺， 结扎左侧支气管， 分离右 肺， 用注射器吸取 0.8ml 生理盐水缓慢注入右肺再缓慢抽出往复多次灌洗， 重复 3 次， 得总 量为 1.5ml 的肺泡灌洗液 BALF。 0061 肺湿干重比 W/D ratio 的测定方法为 ： 造模后 6h， 过量麻醉处死小鼠， 收集左肺， 用滤纸吸干其表面的组织液和血液， 称重， 重量为 “湿重” ， 然后将其置于 80干燥箱内， 48h 后取出， 称重， 重量为 “干重” 。。

35、以肺 “湿重” 和 “干重” 的比值即肺湿干重比 W/D 大小用来评 估肺水肿的情况。 0062 肺泡灌洗液中一氧化氮 (NO) 和总蛋白含量的测定方法为 ： 造模后 6h， 过量麻醉处 死小鼠， 收集 BALF， 离心 (4， 1400g， 10min)， 吸取上清液， 按照一氧化氮 NO 和总蛋白含 量 BCA 试剂盒说明要求， 测定一氧化氮 (NO) 和总蛋白含量。 0063 肺泡灌洗液中炎症因子含量水平的测定方法为 ： 造模后 24h， 过量麻醉处死小鼠， 收集BALF， 离心(4， 1400g， 10min)， 吸取上清液， 按照ELISA试剂盒说明要求， 测定炎症 因子 TNF-，。

36、 IL-6 和 IL-1 含量水平。 0064 肺组织中 MPO 和 SOD 活性的测定为 ： 造模后 24h， 过量麻醉处死小鼠， 收集左肺， 用 匀浆器制成10组织匀浆， 按照MPO试剂盒说明要求， 测定MPO活性 ； 将10组织匀浆离心 (4， 1400g， 20min)， 吸取上清液， 按照 SOD 试剂盒说明要求， 测定 SOD 活性。 0065 血清中补体 C3 和补体片段 C3c 含量的测定为 ： 造模后 6h， 过量麻醉处死小鼠， 收 集的小鼠血液样本， 室温(25)下静置10min， 离心(4， 1400g， 20min)， 吸取血清， 按照 ELISA 试剂盒说明要求， 测。

37、定 C3 和 C3c 含量。 0066 肺部组织切片病理观察 ： 造模后 24h， 过量麻醉处死小鼠， 收集右肺下叶， 置 于 4福尔马林中固定 3 天， 常规方法石蜡固定， 切片， H-E 染色 ； 采用辣根过氧化物酶 (horseradishperoxidase,HRP) 系统来检测组织上的补体 C3c 沉积。5m 肺部石蜡切片经 二甲苯中脱蜡、 酒精梯度水化， 与兔抗人补体C3c在4下过夜孵育， 然后3,3-二氨基联苯 胺 (DAB) 显色， 显微镜放大 400 倍观察拍照。 0067 5、 实验结果 0068 所有数据用平均数 标准差 (meanS.D.) 表示， 应用 SPSS19 。

38、软件对数据进行单 因素方差分析， 组间比较采用 Fisher s PLSD 法， 当 P0.05 认为有显著性差异。 0069 实验数据采用上述方法进行处理后， 对各实验组之间， 评定急性肺损伤的指标进 行了对比， 如图 4-15 所示。 0070 从图 4-6 中可以看出， 相对于空白组， 模型组的 W/D 重比、 肺泡灌洗液 (BALF) 中一 氧化氮(NO)和蛋白质的含量均有显著升高， 其差异具有统计学意义(P0.01)。 比较对照组 (40mg/kg) 与空白组， 发现野马追黄酮部位 (EUP-FLA) 对正常小鼠在这三方面无显著影响。 EUP-FLA 在 20mg/kg 和 40mg。

39、/kg 剂量下对肺部水肿、 BALF 中 NO 和蛋白质的含量有显著的 抑制和减少的效果 (P0.01)。其中 # 表示相较于空白组， P0.01 ； * 表示相较于模型组， P0.01 ； * 表示相较于模型组， P0.05 0071 从图 7-9 中可以看出， 相对于空白组， 模型组肺泡灌洗液 (BALF) 中 BTNF-、 IL-6 和 IL-1 水平均有显著升高， 其差异具有统计学意义 (P0.01)。比较对照组 (40mg kg-1) 与空白组， 发现 EUP-FLA 对正常小鼠在这两方面无显著影响。EUP-FLA 在 40mgkg-1剂量 说 明 书 CN 104042658 A 。

40、8 7/8 页 9 下对 BALF 中炎症因子 TNF-、 IL-6 和 IL-1 水平有显著的抑制效果 (P0.01)。其中 # 表示相较于空白组， P0.01 ； * 表示相较于模型组， P0.01 ； * 表示相较于模型组， P0.05 0072 从图 10-11 中可以看出， 相对于空白组， 模型组肺组织中的 MPO 有显著升高， SOD 有显著的降低， 其差异具有统计学意义 (P0.01)。比较对照组 (40mgkg-1) 与空白组， 发 现 EUP-FLA 对正常小鼠在这些方面无显著影响。EUP-FLA 在 40mgkg-1剂量下对肺组织中 MPO 有显著的抑制效果 (P0.01)。

41、， EUP-FLA 在 20mgkg-1 剂量下对肺组织中 SOD 有显著的 提高效果 (P0.01)。其中 # 表示相较于空白组， P0.01 ； * 表示相较于模型组， P0.01 ； * 表示相较于模型组， P0.05。 0073 从图 12-13 中可以看出， 相对于空白组， 模型组血清中 C3 和 C3c 水平均有显著升 高， 其差异具有统计学意义 (P0.01)。比较对照组 (40mgkg-1) 与空白组， 发现 EUP-FLA 对正常小鼠在这些方面无显著影响。EUP-FLA 在 20mgkg-1和 40mgkg-1剂量下对血清中 补体 C3 和补体片段 C3c 水平均有显著的抑制。

42、效果 (P0.01)。其中 # 表示相较于空白组， P0.01 ； * 表示相较于模型组， P0.01 ； * 表示相较于模型组， P0.05。 0074 从图 14-15 中可以看出， 相对于空白组， 模型组的肺组织不完整， 细胞变大、 破裂， 毛细管内壁增厚， 肺纤毛中空变形， 细胞内部充斥着介质， 伴有褐色补体沉淀斑点 ( 见图 15 中棕色斑点 )。然而药物组的情况有所改善， EUP-FLA 在 20mgkg-1和 40mgkg-1剂量下 肺部情况与对照组 (40mgkg-1) 和空白组差异甚小。其中 # 表示相较于空白组， P0.01 ； * 表示相较于模型组， P0.01 ； * 。

43、表示相较于模型组， P0.05。 0075 上述实验结果表明， 在脂多糖 LPS 诱导的急性肺损伤实验模型中， 野马追黄酮 部位 (EUP-FLA) 具有显著减轻了小鼠肺部水肿症状， 降低小鼠肺泡灌洗液 (BALF) 中一 氧化氮 (NO) 和蛋白质的含量， 增强了小鼠肺组织内超氧化物歧化酶 (SOD) 的活性， 抑制 髓过氧化酶 (MPO) 的活性， 降低了肿瘤坏死因子 -(TNF-)、 白介素 -6(IL-6) 和白介 素 -1(IL-1) 的含量， 减少血清中补体 C3 和补体片段 C3c 的含量并改善补体片段 C3c 在肺组织的沉积。 0076 实施例 3 ： 0077 野马追黄酮部位。

44、与野马追乙醇提物抗急性肺损伤效果对比实验 0078 野马追乙醇提取物的制备 ： 称取野马追干燥全草， 切段 2 3cm， 加 10 倍体积的 80乙醇水溶液， 回流提取 2 小时， 重复 2 次， 减压回收溶剂， 得野马追乙醇提取物 (EtOH)。 0079 此对比实验， 实验试剂、 实验小鼠以及实验材料同实施例 2。 0080 实验小鼠随机分为空白组、 模型组、 野马追乙醇提取物 EtOH 组、 野马追黄酮部 位 EUP-FLA 组和阳性组共 5 组， 每组 10 只。野马追乙醇提取物 EtOH 组给药 EtOH， 剂量为 30mgkg-1； 野马追黄酮部位 EUP-FLA 组给予 EUP-。

45、FLA， 剂量为 30mgkg-1； 阳性组给予地塞 米松， 剂量 2mgkg-1， 0081 所有实验小鼠先用20乌拉坦-生理盐水(4ml kg-1)腹腔注射轻微麻醉小鼠， 打 开颈部， 除空白组外其余 5 组往小鼠气管内注入 LPS(2mlkg-1， 1mgml-1LPS- 生理盐水 ) ； 而空白组同法气管注入生理盐水 2mlkg-1。造模 0.5h 后， 分别按上述剂量进行第一次给 药， 空白组给予等体积蒸馏水 ； 造模 1h 后 EtOH 组和 EUP-FLA 组按上述剂量进行第二次给 药， 阳性组、 空白组和模型组给予等体积蒸馏水。造模 6h 后， 过量麻醉小鼠， 眼球取血， 每只。

46、 小鼠约 1ml 血液样本， 同实施例 2 方法收集右肺的肺泡灌洗液 (BALF)， 收集左肺。 说 明 书 CN 104042658 A 9 8/8 页 10 0082 实验数据处理同实施例 2， 其结果如图 16-20 所示。 0083 从图 16 中可以看出， 相对于空白组， 模型组的 W/D 重比有显著升高， 其差异具有 统计学意义 (P0.01) ； 与模型组相比， 野马追 EtOH、 EUP-FLA 组和阳性组的肺水肿情况均 有显著改善 (P0.05) ； 相较于野马追 EtOH 组， EUP-FLA 组小鼠的肺部水肿得到显著抑制 (P0.01)。野马追黄酮部位 (EUP-FLA)。

47、 比野马追醇提取物 (EtOH) 具有更好的抑制小鼠肺 水肿作用。其中 # 表示相较于空白组， P0.01 ； * 表示相较于 EtOH 组， P0.01 ； EtOH、 FLA 和阳性组分别与模型组比较， P 值均小于 0.05 具有显著性差异， 图中未作标示。 0084 从图 17-18 中可以看出， 如图 2 所示， 相对于空白组， 模型组小鼠 BALF 中总蛋白和 TNF- 含量均有显著升高， 其差异具有统计学意义 (P0.01) ； 与模型组相比， 野马追 EtOH、 FLA组和阳性组的总蛋白以及TNF-含量均有显著改善(P0.05) ； 相较于野马追EtOH组， FLA 组显著抑制。

48、 BALF 中总蛋白含量 (P0.01) ； 相较于野马追 EtOH 组， FLA 组显著抑制 BALF 中 TNF- 含量 (P0.01)。野马追黄酮部位 (FLA) 比野马追醇提取物 (EtOH) 能更好的抑 制小鼠 BALF 中总蛋白和 TNF- 含量。其中 # 表示相较于空白组， P0.01 ； * 表示相较于 EtOH 组， P0.01 ； EtOH、 FLA 和阳性组分别与模型组比较， P 值均小于 0.05 具有显著性差异， 图中未作标示。 0085 从图 19-20 中可以看出， 相对于空白组， 模型组小鼠血清中 C3 和 C3c 含量均有显 著升高， 其差异具有统计学意义 (P0.01) ； 与模型组相比， 野马追 EtOH、 FLA 组和阳性组的 C3以及C3c含量均有显著改善(P0.05) ； 相较于野马追EtOH组， FLA组的C3以及C3c含量 得到显著抑制 (P0.05)。野马追黄酮部位 (FLA) 比野马追醇提取物 (EtOH) 能更好的降。