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1、(10)申请公布号 CN 102845614 A (43)申请公布日 2013.01.02 CN 102845614 A *CN102845614A* (21)申请号 201210334412.X (22)申请日 2012.09.11 A23K 1/16(2006.01) (71)申请人 重庆市畜牧科学院 地址 402460 重庆市荣昌县昌州大道 770 号 (72)发明人 杨金龙 刘作华 黄勇 付利芝 郑华 张素辉 杨睿 沈克飞 (74)专利代理机构 北京元本知识产权代理事务 所 11308 代理人 秦力军 (54) 发明名称 一种生产产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添 加剂用菌液的方法 (57。
2、) 摘要 本发明属于生物领域， 特别涉及产乳酸枯草 芽孢杆菌发酵工艺及配方， 按重量份计具体由以 下组分组成 ： 蛋白胨 1-5 份， 牛肉膏 1-3 份， 酵母 提取物 1-10 份， 氯化钠 5-15 份， 果寡糖 10-100 份 ； 发酵工艺为 ： 将生产产乳酸枯草芽孢杆菌种 子液接种到装有所述培养基的发酵罐中进行发 酵， 发酵条件为 ： 30-37连续培养 24-72 小时后 静置培养 96-120 小时， 得产乳酸枯草芽孢杆菌合 生元饲料添加剂用菌液 ； 基于所述培养基的培养 方法， 可用于规模化生产产乳酸枯草芽孢杆菌合 生元饲料添加剂用菌液， 其工艺稳定， 益生菌含量 高， 生产。
3、成本低。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 1/1 页 2 1. 产乳酸枯草芽孢杆菌的培养基配方， 其特征在于， 按重量份计具体由以下组分组成 ： 蛋白胨 1-5 份， 牛肉膏 1-3 份， 酵母提取物 1-10 份， 氯化钠 5-15 份， 果寡糖 10-100 份。 2. 根据权利要求 1 所述的培养基配方， 其特征在于， 按重量份计具体由以下组分组成 ： 蛋白胨 3 份， 牛肉膏 2 份， 酵母提取物 7 份， 氯化钠 11 份， 果寡糖 75 份。 3.权利要求1或。
4、2所述的培养基配方制备培养基的方法， 其特征在于， 取配方量的蛋白 胨、 牛肉膏、 酵母提取物及氯化钠， 加入适量的水使蛋白胨的质量体积分数为 1-5g/L， 并使 各组分充分溶解， 得混合液体 ； 将所述混合液体灭菌， 加入配方量的果寡糖混合均匀， 得培 养基。 4. 权利要求 3 所述的方法制备的培养基。 5. 基于权利要求 4 所述的培养基生产产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液 的方法， 其特征在于， 具体包括以下步骤 ： 将产乳酸枯草芽孢杆菌种子液接种到装有所述培 养基的发酵罐中进行动态发酵， 发酵条件为 ： 30-37条件下连续培养 24-72 小时， 通气量 为0.1-0.5。
5、V/V min， 再静置培养96-120小时， 得产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用 菌液。 6. 根据权利要求 5 所述的方法， 其特征在于， 所述动态发酵条件为在 2-20 转 / 分钟条 件下动态搅拌发酵。 7. 根据权利要求 5 所述的方法， 其特征在于， 所述种子液和所述培养基的体积比为 1-4 10， 所述发酵罐的装液量为 10-20mL/100mL， 所述种子液的浓度为 3-15108cfu/mL。 8. 根据权利要求 5 所述的方法， 其特征在于， 所述种子液为二级种子液。 9. 根据权利要求 8 所述的方法， 其特征在于， 所述二级种子液的获得方法具体包括以 下步骤 ： A。
6、 一级种子液的获得 将产乳酸枯草芽孢杆菌菌种接入营养肉汤， 371培养 24 小时 ； 然后划线接种在营 养琼脂平板上， 在生化培养箱中， 在 371条件下培养 24-48 小时， 选典型菌落接种营养 琼脂斜面， 置 371、 生化培养箱中培养 24 小时， 作为一级种子 ； B 二级种子液的获得 取一级种子接种于营养肉汤， 置 371生化培养箱中培养 24 小时， 得二级种子。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于， 在所述步骤A或/和所述步骤B中， 营养 肉汤替换为所述培养基。 权 利 要 求 书 CN 102845614 A 2 1/5 页 3 一种生产产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲。
7、料添加剂用菌液的 方法 技术领域 0001 本发明属于生物领域， 特别涉及产乳酸枯草芽孢杆菌的培养方法。 背景技术 0002 随着国民经济的快速发展和人民生活水平的日益提高， 人们对养殖环境及安全、 健康的动物产品提出了更高、 更新的要求。而近些年来， 频频曝光的动物食品安全事件， 如 “瘦肉精事件” 、“三聚氰胺奶事件” 等等， 无一不对动物养殖业造成了沉重地打击， 引发了严 重的信任危机。 中国作为世界第一动物养殖大国， 动物产品出口在国民经济中举足轻重， 但 近年来欧洲、 日本等一些国家以食品安全问题为壁垒， 拒绝中国动物产品的部分进入， 给我 国经济造成不应有的损失。这一系列的问题都是。
8、 “动物产品安全” 问题所致， 已成为制约中 国养殖业科学健康和可持续发展的瓶颈。 0003 国际上目前普遍认为， 微生态制剂在未来的动物养殖中将有巨大的应用前景， 对 解决动物产品安全性将起到较大的作用。 0004 我国虽然在微生态制剂的研究和开发方面比欧美起步晚， 但近 20 年来发展相当 迅速。生产微生态制剂的厂家由 2000 年的十几家发展到 2004 年的 1600 家。据不完全统 计， 到 2004 年止， 我国的各种微生态制剂的产量已达到 15 万吨。产业化程度高、 规模较大 的有四川何明清用芽孢杆菌研制的 8501、 8701、 8801、 8901、 901 系列， 分别用于。
9、仔猪、 育肥 猪、 鱼、 禽、 肉鸡。大连医学院研制剂的 “促菌生” ， 南京农大研的 “促康生” ， 松江制药厂生产 的 DM423 菌粉， 黑龙江兽医研究所生产的 “痢康粉剂” ， 北京营养研究所生产的 “增菌素” ， 杭 州商学院生产的乳酸菌复合剂等等。市场上应用较多、 效果较好的大多是以芽孢杆菌和乳 酸杆菌为主的复合益生菌口服制剂。对产乳酸枯草芽孢杆菌进行发酵生产， 综合枯草芽孢 杆菌和乳酸杆菌的优点， 可以使微生态制剂性能得到质的飞跃， 达到更新换代的目的。 大规 模发酵生产乳酸枯草芽孢杆菌菌液是新型微生态制剂生产的基础和关键之一， 但目前未有 工厂化大规模发酵生产乳酸枯草芽孢杆菌菌。
10、液的发酵工艺。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种培养基配方、 培养基制备方法及其获得的培养基， 该 配方及培养基成本低， 取材方便， 适用于产乳酸枯草芽孢杆菌的培养 ； 该培养基的制备方法 简单， 适用于大规模制备。 0006 为实现上述目的， 本发明的技术方案为 ： 0007 产乳酸枯草芽孢杆菌的培养基配方， 按重量份计具体由以下组分组成 ： 蛋白胨 1-5 份， 牛肉膏 1-3 份， 酵母提取物 1-10 份， 氯化钠 5-15 份， 果寡糖 10-100 份。 0008 进一步， 产乳酸枯草芽孢杆菌的培养基配方， 按重量份计具体由以下组分组成 ： 蛋 白胨 3 份， 牛肉膏 。
11、2 份， 酵母提取物 7 份， 氯化钠 11 份， 果寡糖 75 份。果寡糖， 又称为果聚 糖、 低聚果糖、 藤果三糖族低聚糖， 分子式为 G-F-Fn( 其中 G 为葡萄糖， F 为果糖， n 13)。 说 明 书 CN 102845614 A 3 2/5 页 4 0009 所述的培养基配方制备培养基的方法， 取配方量的蛋白胨、 牛肉膏、 酵母提取物及 氯化钠， 加入适量的水使蛋白胨的质量体积分数为 1-5g/L， 并使各组分充分溶解， 得混合液 体 ； 将所述混合液体灭菌， 加入配方量的果寡糖混合均匀， 得培养基。 0010 所述的方法制备的培养基。该培养基为产乳酸枯草芽孢杆菌的专用培养基。
12、， 在特 定的发酵条件下， 可得到较好的发酵效果。 0011 本发明的目的之二在于提供生产产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液 的方法， 该方法操作简单， 稳定性高， 产率高。 0012 为实现上述目的， 本发明的技术方案为 ： 0013 所述的培养基生产产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液的方法， 具体包 括以下步骤 ： 将生产产乳酸枯草芽孢杆菌种子液接种到装有所述培养基的发酵罐中进行动 态发酵， 动态发酵条件为 ： 30-37条件下连续培养24-72小时， 通气量为0.1-0.5V/V min， 静置培养 96-120 小时， 得产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液。 0014。
13、 进一步， 所述动态发酵条件为在 2-20 转 / 分钟条件下动态搅拌发酵。 0015 作为优选， 所述种子液和培养基的体积比为 1-4 10， 所述发酵罐的装液量 为 10-20ml/100mL， 所述种子液的浓度为 3-15108cfu/mL， 发酵罐的装液量优选为 20mL/100mL。 0016 其中， 所述种子液为二级种子液。 0017 其中， 所述二级种子液的获得方法具体包括以下步骤 ： 0018 A 一级种子液的获得 0019 将产乳酸枯草芽孢杆菌菌种接入营养肉汤， 37培养 24 小时 ； 然后划线接种在营 养琼脂平板上， 在生化培养箱中， 经 37、 24-48 小时培养后选。
14、典型菌落接种营养琼脂斜面 若干支， 置 37、 生化培养箱中培养 24 小时， 作为一级种子 ； 产乳酸枯草芽孢杆菌菌种接入 营养肉汤时， 接种量优选 1ml/100mL ； 0020 B 二级种子液的获得 0021 取一级种子接种于营养肉汤， 置 37生化培养箱中培养 24 小时， 得二级种子， 一 级种子接种于营养肉汤接种量优选 2ml/100mL ； 0022 营养肉汤的制备方法为 ： 蛋白胨10g， 牛肉膏3g， 氯化钠5g， 蒸馏水至1000mL， 调节 pH7.4 ； 按上述成分混合， 溶解后校正 pH， 分装烧瓶， 每瓶 225mL， 121高压灭菌 15min， 得营 养肉汤。。
15、 0023 本发明的有益效果在于 ： 基于所述培养基的培养方法， 可用于规模化生产产乳酸 枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液， 其工艺稳定， 益生菌含量高， 生产成本低。 具体实施方式 0024 以下结合具体实施例， 对本发明进行详细说明。 0025 实施例中， 产乳酸枯草芽孢杆菌 CSY1-3-10-1 株作为菌种。 0026 实施例 1 培养基的制备 0027 配方一 ： 产乳酸枯草芽孢杆菌的培养基配方， 按重量份计具体由以下组分组成 ： 蛋白胨 1 份， 牛肉膏 1 份， 酵母提取物 1 份， 氯化钠 15 份， 果寡糖 100 份。 0028 配方二 ： 产乳酸枯草芽孢杆菌的培养基配方。
16、， 按重量份计具体由以下组分组成 ： 说 明 书 CN 102845614 A 4 3/5 页 5 蛋白胨 5 份， 牛肉膏 3 份， 酵母提取物 10 份， 氯化钠 5 份， 果寡糖 10 份。 0029 配方三 ： 产乳酸枯草芽孢杆菌的培养基配方， 按重量份计具体由以下组分组成 ： 蛋白胨 3 份， 牛肉膏 2 份， 酵母提取物 7 份， 氯化钠 11 份， 果寡糖 75 份。 0030 将上述三种配方按以下步骤制备 ： 取配方量的蛋白胨、 牛肉膏、 酵母提取物及氯化 钠， 加入适量的水使蛋白胨的质量体积分数为 3g/L(1-5g/L 均可 )， 并使各组分充分溶解， 得混合液体 ； 将所。
17、述混合液体灭菌， 加入配方量的果寡糖混合均匀， 配方一、 二和三依次得 培养基一、 培养基二和培养基三。 0031 实施例 2 培养基的应用 0032 一 0033 所述的培养基生产产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液的方法， 具体 包括以下步骤 ： 将生产产乳酸枯草芽孢杆菌种子液 ( 浓度为 3108cfu/mL) 接种到装有 所述培养基 ( 配方三 ) 的发酵罐中进行 10 转 / 分钟动态发酵， 发酵条件为 ： 30连续培 养 24 小时后， 再静置培养 96 小时， 得产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液。经 计数， 产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液中产乳酸枯草芽孢杆菌。
18、的含菌数大于 1.801010CFU/mL。 0034 二 0035 将产乳酸枯草芽孢杆菌菌种接入所述培养基 ( 配方二 )， 371培养 24 小时 ； 然 后划线接种在营养琼脂平板上， 在生化培养箱中， 在 371条件下培养 24-48 小时， 选典 型菌落接种营养琼脂斜面， 置 371、 生化培养箱中培养 24 小时， 作为一级种子。 0036 三 0037 取一级种子接种于所述培养基 ( 配方一 )， 置 371生化培养箱中培养 24 小时， 得二级种子。 0038 实施例 3 生产产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液的方法 0039 1 二级种子液的获得方法 0040 具体包括以。
19、下步骤 ： 0041 A) 一级种子液的获得 0042 将产乳酸枯草芽孢杆菌菌种接入营养肉汤 ( 接种量 1ml/100mL)， 371培养 24 小时 ； 然后划线接种在营养琼脂平板上， 在生化培养箱中， 经 37、 48 小时培养后选典型菌 落接种营养琼脂斜面若干支， 置37、 生化培养箱中培养24小时， 作为一级种子液(浓度为 3108cfu/mL) ； 0043 B) 二级种子液的获得 0044 取一级种子接种于营养肉汤 ( 接种量 2ml/100mL)， 置 371生化培养箱中培养 24 小时， 得二级种子液 ( 浓度为 15108cfu/mL)。 0045 2 产乳酸枯草芽孢杆菌合。
20、生元饲料添加剂用菌液的方法 0046 具体包括以下步骤 ： 将生产产乳酸枯草芽孢杆菌的所述二级种子接种到装有所述 培养基(实施例1中的所述培养基三)的发酵罐中进行动态发酵， 发酵条件为 ： 37连续培 养 (2-20 转 / 分钟动态搅拌发酵， 通气量为 0.1-0.5V/Vmin)72 小时后， 再静置培养 120 小时， 得产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液。所述种子液和培养基的体积比为 410， 所述发酵罐的装液量为20ml/100mL。 经计数， 产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加 说 明 书 CN 102845614 A 5 4/5 页 6 剂用菌液中产乳酸枯草芽孢杆菌的含菌数大。
21、于 2.201010CFU/mL。 0047 实施例 4 0048 用实施例 3 的方法制备生产产乳酸枯草芽孢杆菌合生元饲料添加剂用菌液， 经喷 雾干燥等 ( 参数 ： 干燥能力 ： 0.1-2.0Kg 水 / 小时 ； 干燥时间 ： 1.0-1.5 秒 ； 最大空气流量 ： 35m3/h ； 压缩空气流量 ： 1000-3000L/h ； 温度 ： 90-220； 加热控温精度 ： 2 ) 最后制成产 乳酸枯草芽孢杆菌微生态合生元饲料添加剂。 0049 实验室试制生产了 5 批共 100 千克实验室制微生态合生元饲料添加剂， 批号分别 为2011001、 2011002、 2011003、 。
22、2011004、 2011005。 添加剂生产过程中， 严格按半成品和成品 检验规定进行检验， 半成品生产和检验报告结果见表 1， 成品质量检验情况见表 2(5 批实验 室试制产品成品的原始检验报告详见后 )。 0050 表 1 乳酸枯草芽孢杆菌微生态合生元饲料添加剂半成品生产和检验结果 0051 0052 表 2 2011001-2011005 批乳酸枯草芽孢杆菌微生态合生元饲料添加剂实验室成 品检验结果 0053 0054 上述 5 批实验室制乳酸枯草芽孢杆菌微生态合生元饲料添加剂 (20110011、 20110021、 20110031、 20110041、 20110051)。在整个。
23、生产过程中安全、 顺畅。半成品及成品 各检验项目均达到 微生态饲料添加剂 ( 企业 ) 质量标准 的各项指标之上。充分证明了 本添加剂生产工艺稳定， 按照 微生态饲料添加剂生产规范 ( 草案 ) 所制定的添加剂质量 稳定、 安全有效， 可进行规模化生产。 0055 最后说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管参照较 说 明 书 CN 102845614 A 6 5/5 页 7 佳实施例对本发明进行了详细说明， 本领域的普通技术人员应当理解， 可以对本发明的技 术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围， 其均应涵盖在本 发明的权利要求范围当中。 说 明 书 CN 102845614 A 7 。