利培酮免疫测定.pdf

衍生自利培酮的新的缀合物和免疫原，并且由这些免疫原产生的抗体可用于量化和监测生物液体中的利培酮和帕潘立酮的免疫测定。

权利要求书用于检测选自利培酮、帕潘立酮及其混合物的活性药用抗精神病药物的免疫测定法，包括提供含有样品、与所述药用抗精神病药选择性反应的抗体以及载体与下式配体的缀合物的混合物：

其中B是：

或
Y是有机间隔基团；
X是能结合载体的末端官能团；并且
p是0‑1的整数；
使所述样品中的所述药用活性抗精神病药物和所述缀合物结合所述抗体，随后测定所述样品中结合或未结合所述抗体的所述缀合物的量，从而检测所述样品中是否存在所述抗精神病药物。
权利要求1的免疫测定法，其中所述抗体与利培酮和帕潘立酮反应，而几乎不与无药用活性的利培酮和帕潘立酮代谢物7‑羟基‑利培酮反应，并且几乎不与其他无药用活性的利培酮和帕潘立酮代谢物发生交叉反应。
权利要求2的免疫测定法，其中所述抗体与7‑羟基‑利培酮的反应性低于40%，所述抗体与其他无药用活性的代谢物的交叉反应性低于5%，所述反应性和交叉反应性是基于所述抗体与利培酮和帕潘立酮的组合反应性。
权利要求3的免疫测定法，其中所述样品是人样品。
权利要求4的免疫测定法，其中所述药用活性抗精神病药物通过测定结合或未结合所述抗体的缀合物的量进行量化。
权利要求5的免疫测定法，其中所述药用活性抗精神病药物选自利培酮和帕潘立酮。
权利要求6的免疫测定法，其中所述人样品取自用利培酮治疗的患者，并且所述免疫测定法测定所述样品中利培酮和帕潘立酮的量。
权利要求6的免疫测定法，其中所述人样品取自用帕潘立酮治疗的患者，并且所述免疫测定法测定所述样品中帕潘立酮的量。
权利要求3的免疫测定法，其中所述抗体由包含免疫原性载体的免疫原产生，所述免疫原性载体包含与下式配体缀合的多胺聚合物：

其中Y、X和B如前所述。
权利要求5的免疫测定法，其中所述抗体附着在固相支持物上。
权利要求10的免疫测定法，其中所述固相支持物是微量滴定板。
权利要求10的免疫测定法，其中所述固相支持物是纳米颗粒。
权利要求9的免疫测定法，其中所述抗体来自小鼠、兔、绵羊或大鼠。
权利要求13的免疫测定法，其中所述抗体是单克隆抗体。
与选自利培酮、帕潘立酮及其混合物的药用活性抗精神病药物选择性反应的抗体，其中所述抗体与利培酮和帕潘立酮反应，而几乎不与无药用活性的利培酮和帕潘立酮代谢物7‑羟基‑利培酮反应，并且几乎不与其他无药用活性的利培酮和帕潘立酮代谢物发生交叉反应。
权利要求15的抗体，其中所述抗体与所述7‑羟基‑利培酮的反应性低于40%，所述与其他无药用活性代谢物的交叉反应性低于5%，所述反应性和交叉反应性是基于所述抗体与利培酮和帕潘立酮的组合反应性。
权利要求16的抗体，其中所述抗体由包含免疫原性载体的免疫原产生，所述免疫原性载体包含与下式配体缀合的多胺聚合物：

其中B是：

或
Y是有机间隔基团；
X是能结合包含多胺聚合物的免疫原性载体的末端官能团；并且
p是0‑1的整数。
权利要求17的抗体，其中所述抗体来自小鼠、兔、绵羊或大鼠。
权利要求17的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
下式的化合物:

其中Y、B、X和p如前所述；
其中B是：

或
Y是有机间隔基团；
X是能结合载体的末端官能团；并且
p是0‑1的整数。
权利要求20的化合物，其中p是0。
权利要求21的化合物，其中X是或‑N＝C＝R4，其中R3是氢、卤化物、羟基或与其连接的氧原子一起形成反应性酯，R4是氧或硫。
权利要求22的化合物，其中X是
权利要求22的化合物，其中X是或
权利要求22的化合物，其中X是并且R3是羟基。
权利要求22的化合物，其中X是并且R3形成反应性酯。
权利要求26的化合物，其中所形成的酯是低级烷基酯、亚氨酸酯或氨基酯。
权利要求20的化合物，其中p是1。
权利要求28的化合物，其中X是或‑N=C=R4，其中R3是氢、卤化物、羟基或与其连接的氧原子一起形成反应性酯，且R4是氧或硫。
权利要求29的化合物，其中Y是包含1‑10个碳原子的亚烷基、或
其中n和o是0‑6的整数，以及m是1‑6的整数。
权利要求30的化合物，其中Y是含有1‑6个碳原子的低级亚烷基。
权利要求31的化合物，其中X是而R3如前所述。
权利要求30的化合物，其中Y是其中m和o如前所述。
权利要求33的化合物，其中X是而R3如前所述。
包含与下式配体缀合的载体的缀合物：

其中B是：

或
Y是有机间隔基团；
X是能连接载体的官能连接基团；并且
p是0‑1的整数。
权利要求35的缀合物，其中所述载体包含多胺聚合物。
权利要求36的缀合物，其中p是0。
权利要求37的缀合物，其中X是或‑N=C=R4，其中R3是氢、卤化物、羟基或与其连接的氧原子一起形成反应性酯，且R4是氧或硫。
权利要求36的缀合物，其中p是1。
权利要求39的缀合物，其中Y是包含1‑10个碳原子的亚烷基、或
其中n和o是0‑6的整数，且m是1‑6的整数。
权利要求40的缀合物，其中X是或‑N=C=R4，其中R3是氢、卤化物、羟基或与其连接的氧原子一起形成反应性酯，且R4是氧或硫。
权利要求36的缀合物，其中所述多胺聚合物是免疫原性聚合物。
权利要求42的缀合物，其中Y是包含1‑6个碳原子的亚烷基。
权利要求43的缀合物，其中X是而R3如前所述。
权利要求39的缀合物，其中Y是其中m和o如前所述。
权利要求45的缀合物，其中X是而R3如前所述。
用于确定患者样品中是否存在选自利培酮和帕潘立酮的药用活性抗精神病药物的试剂盒，包括包装在独立容器中的独立试剂，所述试剂之一为载体与下式配体的缀合物，

其中B是：

或
Y是有机间隔基团；
X是能结合载体的末端官能团；并且
p是0‑1的整数；
而另一种试剂为与选自利培酮和帕潘立酮的药用活性抗精神病药物选择性反应的抗体，其中所述抗体与利培酮和帕潘立酮反应，而几乎不与无药用活性的利培酮和帕潘立酮代谢物7‑羟基‑利培酮反应，并且几乎不与其他无药用活性利培酮和帕潘立酮代谢物发生交叉反应。
权利要求47的试剂盒，其中p是1。
权利要求48的试剂盒，其中B是‑O‑CH2‑。
权利要求49的试剂盒，其中Y是低级亚烷基。
权利要求50的试剂盒，其中X是或‑N=C=R4，其中R3是氢、卤化物、羟基或与其连接的氧原子一起形成反应性酯，而R4是氧或硫。
权利要求48的试剂盒，其中X是而R3如前所述。
权利要求47的试剂盒，其中Y是
或

权利要求49的试剂盒，其中Y是其中m和o如前所述。

说明书利培酮免疫测定
技术领域
本发明涉及免疫测定领域，用于确定人生物液体中利培酮及其药物活性代谢物帕潘立酮的存在和/或对其定量，以在治疗期间快速确定药物的最佳浓度。
背景技术
精神分裂症是困扰世界约1％人口的严重的精神疾病。精神分裂症的临床症状包括妄想、听幻觉、思绪紊乱和语言、社交恐惧症、缺乏动力、以及认知障碍，例如思考紊乱和记忆损伤。该病症被认为由多个神经缺陷的组合所引起，包括多巴胺和5‑羟色胺水平缺陷以及抑制性中间神经元缺陷(Freedman，2003，New Eng.J.Med.，349(18)：1738‑1749)。精神分裂症可使用靶向神经递质和受体的药物，通常指抗精神病药物或神经阻滞药物的治疗。
称为“非典型抗精神病药”或“第二代抗精神病药”的一类抗精神病药物包括苯异恶唑衍生物利培酮(I)。美国杨森药厂商标名为维思通的利培酮靶向5‑羟色胺(5‑HT2A)和多巴胺(D2)受体，阻断其各自的神经递质吸收(Package‑Insert‑Risperdal，2009，Janssen Cilag)。利培酮在人体内由细胞色素P450异构体CYP2D6代谢为生物活性的9‑羟基代谢物帕潘立酮(II)。由于两者在体外具有类似的效果，其共同组成“活性部分”，应当进行共同监测(Mannens等.，1993，Drug Met.& Disp.，21(6)：1134‑1141)。帕潘立酮本身已经FDA批准用于精神分裂症的治疗，由杨森制药上市，商品名为(Package‑Insert‑Invega，2009，Janssen Pharmaceutica)。
利培酮具有以下结构：

帕潘立酮具有以下结构:

已显示，利培酮和帕潘立酮的“活性部分”的血浆稳态浓度的患者间差异可高达13倍，该差异将影响效果和安全性(Spina et al.,2001,Psychopharmacol.,153(2):238‑243;Aravagiri et al.,2003,Ther.Drug Monitor.,25(6):657‑664;Riedel et al.,2005,Eur.Arch.Psych,and Clin.Neurosci.,255(4):261‑268)。
由于利培酮和帕潘立酮的效果在较高的水平下得以改善，且所述药物在患者之间具有广泛的药代动力学变化，监测血中的药物浓度并调节至目的水平对于提高有效性和最小化毒性是有用的(Raggi等,2004,Med.Chem.Rev.,1:299‑316;Musenga等,2009,Curr.Med..Chem.,16(12):1463‑1481).据报道，利培酮及其衍生物的个体内和个体间药代动力学变化为13倍，且受到很多因素的影响，包括：
年龄，
体重，
器官功能，
药物‑药物相互作用，
遗传调节，
顺应性。
这些差异的结果是，在不同的个体中，等量的相同药物可以导致显著不同的临床结果。根据患者中个体药物的清除率和最终的血清药物浓度，相同剂量的利培酮和帕潘立酮的效果显著不同。治疗性药物的管理使得临床医生可以洞察施用时患者的差异。当进行治疗性药物的管理时，药物剂量对于患者可以是适应于个体需要的，有效治疗所述疾病而没有不想要的副作用的机会将会高得多。
此外，利培酮和帕潘立酮的治疗性药物管理是保证以实际的处方剂量施用抗精神病药物的顺应性的良好工具(Valenstein等,2006,J.Clin.Psych.,67(10):1542‑1550;Treur等,2009,BMC Health Serv.Res.,9:9)，以及确保达到有效的血清浓度水平的良好工具。利培酮和帕潘立酮的常规治疗性药物管理需要简单的自动试验以适应通常的实验室设备的有效性。已描述了使用液相色谱(LC)和UV或质谱检测来确定利培酮和帕潘立酮在人血液和血浆中的浓度(Balant‑Gorgia,等,1999,Ther.Drug Monitor.,21(1):105‑115;Schatz等,2000,Pharmacol.,60(1):51‑56;Frahnert等,2003,J.Chrom.B,794(1):35‑47;Zhang等,2008,Biomed.Chrom.,22(7):671‑687)。这些方法耗费人力，需要液液或固相萃取，其使用昂贵的设备，且不能满足常规临床试验使用的要求。目前还没有用于检测用这些抗精神病药物治疗的患者生物液体中利培酮和/或帕潘立酮的免疫测定方法。
如前所述，还没有用于检测人生物液体中利培酮和帕潘立酮存在和/或其量的免疫测定方法。通过免疫测定的常规利培酮和帕潘立酮治疗性药物管理提供了简单的自动的试验以适应标准的实验室设备。然而，为提供所述免疫测定，必需产生选择性的利培酮和帕潘立酮抗体。该测定中使用的衍生物和免疫原必需通过所述抗体对利培酮和帕潘立酮具有选择性反应性，而与利培酮和帕潘立酮的其他治疗活性或非活性，或药用活性或非活性代谢物之间无交叉反应性。为有效监测药物水平，抗体必需对利培酮和帕潘立酮具有选择性，并且不与利培酮和帕潘立酮的药用或无药用活性代谢物交叉反应。主要的药用或无药用活性代谢物有7‑羟基‑利培酮(V)或N‑脱烷基‑利培酮(VI)(Mannens,等,1993,Drug Met.& Disp.,21(6):1134‑1141;He等,1995,Int.Clin.PsychopharmacoL,10(1):19‑30)，所述代谢物具有下式结构：

为有效进行免疫测定，这些抗体应当对药用或无药用活性代谢物7‑羟基‑利培酮(V)具有相当低的反应性，而基本上与其他药用或无药用活性代谢物，尤其是N‑脱烷基‑利培酮(VI)无反应性。因为利培酮和帕潘立酮产生的代谢物7‑羟基‑利培酮(V)的量很少。
发明内容
根据本发明，制备了一类新的抗体，其基本上选择性地与利培酮和帕潘立酮反应，即选择性地与利培酮和帕潘立酮反应，而几乎不与其药用或无药用活性代谢物7‑羟基‑利培酮反应，并且与它们的其他药用或无药用活性代谢物，例如N‑脱烷基‑利培酮无任何交叉反应性。“选择性的反应性”表示该抗体与利培酮和帕潘立酮反应，而几乎不与无药用活性的利培酮和帕潘立酮代谢物7‑羟基‑利培酮反应，并且与其他无药用活性的利培酮和帕潘立酮代谢物，尤其是N‑脱烷基‑利培酮无任何交叉反应性。这些性质对于提供本发明的免疫测定是重要的，因为利培酮和帕潘立酮产生的代谢物7‑羟基‑利培酮(V)的量很少，低于用于形成该代谢物的利培酮和帕潘立酮重量的5wt.%(Mannens,等,1993,Drug Met.& Disp.,21(6):1134‑1141)。因此，当对人液体样本进行所述免疫测定时，即使在用利培酮和帕潘立酮治疗的患者的样品中存在7‑羟基‑利培酮，其量也很少。由于这些抗体对于利培酮和帕潘立酮的非药用或药用活性代谢物的反应性和交叉反应性，这些代谢物不会干扰免疫测定的人生物液体中利培酮和帕潘立酮量的精确结果。
已发现使用免疫原性多胺聚合物与下式化合物的缀合物作为免疫原：

其中B是：

Y是有机间隔基团；
X是能结合载体的末端官能团；并且
P是0‑1的整数。
产生对利培酮和帕潘立酮选择性的抗体，其几乎不与无药用活性利培酮和帕潘立酮代谢物7‑羟基‑利培酮反应，并且与它们的其他无药用活性利培酮和帕潘立酮代谢物，尤其是N‑脱烷基‑利培酮无任何交叉反应性。
如前所述，提供了这些基本上与利培酮和帕潘立酮选择性反应，而与无药用活性利培酮和帕潘立酮代谢物几乎不反应或无交叉反应性的抗体，这使得人们可以进行特异性检测和量化的免疫测定，以监测使用利培酮和帕潘立酮治疗的患者液体样本中的利培酮和帕潘立酮。本发明还包括所述免疫测定的试剂和试剂盒。
具体实施方式
根据本发明，提供了一类新的抗体，其基本上选择性地与利培酮和帕潘立酮反应，而基本上不与上述代谢产物反应或交叉反应。已发现通过使用式III的利培酮的衍生物作为免疫原，提供了本发明的新一类抗体。通过使用该抗体，发展出了免疫测定法，包括用于在血液、血浆或其他体液样本中检测和/或定量利培酮和帕潘立酮的免疫测定的试剂和试剂盒。通过使用该免疫测定，可以检测和/或定量在所治疗患者体液样本中利培酮和帕潘立酮的存在和量。在该方法中，可以在治疗期间监测用利培酮和帕潘立酮治疗的患者，并根据所述的监测来调整其治疗。通过本发明的方法，人们可以实现利培酮和/或帕潘立酮的治疗性药物管理，尤其是使用利培酮或帕潘立酮作为治疗性抗精神病药物治疗的精神分裂症患者。所检测的治疗性抗精神病药物是式I的利培酮和/或其药物活性代谢物，即式II的帕潘立酮。
本发明的抗体提供了用于检测活性药用抗精神病药物利培酮和帕潘立酮的方法。由于本发明的抗体可与利培酮和帕潘立酮反应，其可用于检测利培酮和帕潘立酮。因此人们可将其用于使用利培酮和帕潘立酮治疗的患者的免疫测定，以监测这些抗精神病药物中任一种的施用。由于帕潘立酮是利培酮的药物活性代谢物，这一点是毫无疑义的。据此，可监测使用利培酮治疗的患者以确定患者样本中是否含有利培酮或帕潘立酮或两者皆有。使用利培酮治疗的患者的患者样本中这些药物的量化将确定施用给患者的利培酮的量以及如何控制利培酮治疗。对于帕潘立酮而言，由于其是利培酮的代谢产物，使用帕潘立酮治疗的患者样本中几乎没有利培酮。因此通过该免疫测定，可监测使用帕潘立酮治疗的患者以确定其患者样本中是否存在帕潘立酮。同样，使用帕潘立酮治疗的患者的样本中帕潘立酮的量化将确定应施用给患者的帕潘立酮的量以及如何控制帕潘立酮治疗。
本发明的免疫测定通过提供含有用一种或两种所述抗精神病药物治疗的患者样本的混合物以及提供含有该样本和本发明的抗体与式III配体载体的缀合物的混合物进行。据此，药物活性的抗精神病药和所述样本中的缀合物将结合抗体，根据该结合和确定缀合物的量，可以计算患者样本中抗精神病药的量。
可使用任何患者的样本，通常优选样本为取自用一种或两种所述药物治疗患者的血液样本。这方便连续监测所述抗精神病药物的治疗。
本发明分析中所用的试剂是聚合载体与式III化合物的缀合物。这些缀合物是样本中利培酮和帕潘立酮的竞争性结合伙伴，用于结合本发明的抗体。因此，结合抗体的缀合试剂的量与样本中利培酮和帕潘立酮的量呈反比。根据本发明，该测定使用检测和测定所述缀合物量的任何常规测定方法，所述缀合物结合或未结合抗体。通过使用所述方法，可确定结合或未结合的缀合物的量。通常，通过将样本中利培酮和帕潘立酮产生的结合或未结合的缀合物的量与含有已知量的利培酮和/或帕潘立酮样本获得的标准或校准曲线确定的结合或未结合缀合物的值进行关联，以确定样本中利培酮和帕潘立酮的量，所述已知量在被测样本的期望范围内。用与使用样本时相同的免疫测定方法来确定用于产生校正曲线的研究。
定义
通过本说明，将会理解下列的定义：
本申请中术语“Ph”表示苯基。术语“亚烷基”表示含有1‑10个碳原子的二价饱和直链或支链的烃取代基。
术语“免疫原”和“免疫原的”涉及能在生物体中引起、导致或产生免疫应答的物质。
术语“缀合物”表示由两部分结合在一起形成的任何物质。本发明有代表性的缀合物包括由小分子例如式III的化合物与大分子例如载体和多胺聚合物，特别是蛋白质结合在一起形成的缀合物。在缀合物中，小分子可以在大分子的一个或多个活性部位结合。术语缀合物包括了术语免疫原。
“半抗原”为部分或不完全抗原。它们是大部分为低分子量物质的无蛋白质的物质，它们不能刺激抗体形成，但它们与抗体反应。后者通过将半抗原偶联到高分子量免疫原性载体上，然后将这种偶联的产物即免疫原注射入人体或动物而形成。本发明的半抗原是利培酮。
本文所使用的“间隔基团”或者“间隔子”表示连接两种或更多种亚结构诸如半抗原、载体、免疫原、标记或示踪物的化学结构的一部分。这些间隔基团将在本说明书的下文中列举。间隔基团的原子和间隔基团中链的原子本身通过化学键连接。其中，优选的间隔子为直链或支链、饱和或不饱和的碳链。这些碳链可以包括在链内或在链的末端的一个或多个杂原子。“杂原子”表示除了碳以外选自由氧、氮和硫所组成的组的原子。间隔基团还可以包括环基团或芳香基团作为链的部分或作为在链中一个原子上的取代。
通过计算氢以外的原子数来确定间隔基团中原子的数量。通过沿着被连接的亚结构之间的最短路线计算除了氢以外的原子数来确定间隔基团内链中的原子数。官能连接基团可以用于活化(例如，提供可用的官能部位)半抗原或间隔基团，以合成半抗原与标记或载体或多胺聚合物的缀合物。
本文使用的“免疫原性载体”是这样的免疫物质，其能在一个或多个位点与半抗原（本案中为利培酮）结合，由此能使这些半抗原衍生物诱导免疫反应，并引发能与这些半抗原特异结合的抗体的产生，其通常为蛋白质。免疫原性载体和连接基团将在本说明书的下文中列举。其中免疫原性载体物质包括被认定为是外源并由此引发宿主免疫应答的蛋白质、糖蛋白、复合多氨基多糖、粒子和核酸。多氨基多糖可以使用任何已知的常规制备手段由多糖来制备。
而且，各种蛋白类型都可以用作聚(氨基酸)免疫原性载体。这些类型包括白蛋白、血清蛋白、脂蛋白等。用作说明的蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、卵白蛋白、牛甲状腺球蛋白(BTG)等。可选择地，可以使用合成的聚(氨基酸)。
免疫原性载体还可以包括聚氨基多糖，该聚氨基多糖是通过单糖的重复缩合而构建成的高分子量聚合物。多糖的例子为淀粉、糖原、纤维素、碳水化合物胶如阿拉伯胶、琼脂等。多糖还含有聚(氨基酸)残基和/或脂残基。
免疫原性载体还可以为或者单独或者缀合到一个上述聚(氨基酸)或多糖的聚(核酸)。
免疫原性载体还可以包括固体粒子。该粒子的直径一般至少约0.02微米(μm)且不超过约100μm，通常直径约0.05‑10μm。该粒子可以为有机或无机的、可膨胀的或不可膨胀的、多孔或非多孔的，最佳为接近于水的密度，一般为约0.7‑1.5g/mL，且由可以是透明的、部分透明的或不透明的材料构成。该粒子可以为生物材料，例如细胞和微生物，包括非限制的例子如红细胞、白细胞、淋巴细胞、杂交瘤、链球菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(E.coli)和病毒。该粒子也可以由有机和无机聚合物、脂质体、胶乳、磷脂小泡或脂蛋白组成。
“聚(氨基酸)”或“多肽”是由氨基酸形成的聚酰胺。聚(氨基酸)的分子量一般为约2000，没有分子量的上限，正常的为小于10,000,000，通常不大于约600,000道尔顿。取决于包括免疫原性载体还是酶，通常有不同的范围。
“肽”是由通过酰胺(肽)键链接两个或更多个氨基酸而形成的任何化合物，通常为α‑氨基酸的聚合物，其中每个氨基酸残基的α‑氨基(除了NH2末端)连接到直链中下一个残基的α‑羧基上。术语肽、多肽和聚(氨基酸)在本文中同义使用，表示这类化合物不受大小的限制。这个种类的最大成员是蛋白质。
“标记物”、“检测器分子”或“示踪物”是产生或能诱导产生可检测信号的任何分子。标记物可以缀合到分析物、免疫原、抗体或其它分子如受体或能结合受体的分子如配体特别是半抗原。标记物的非限制的例子包括放射性同位素、酶、酶片段、酶底物、酶抑制剂、辅酶、催化剂、荧光团、染料、化学发光剂、发光剂(luminescer)或敏化剂；非磁性或磁性粒子、固相支持体、脂质体、配体或受体。
术语“抗体”表示抗原的特异性蛋白结合配偶体，且为对抗原具有而对其它物质没有特异结合亲和力的任何物质或物质的组。广义的术语抗体包含多克隆抗体、单克隆抗体和抗体片段。
术语“衍生物”表示通过一个或多个化学反应由母体化合物制成的化合物或分子。
术语“载体”表示固体粒子和/或聚合的聚合物，例如如上述提到的免疫原性聚合物。当载体是固体粒子时，固体粒子可以是结合、包被或附着到多胺聚合物以提供用于结合式III的化合物中末端官能团X的一个或多个反应部位。
术语“试剂盒”或“测试试剂盒”表示用于分析的材料组件。试剂可以提供在相同或分开的容器中的包装组合中，这取决于它们的交叉反应性和稳定性以及液体还是冻干形式。可以选择提供在试剂盒中的试剂的量和比例以提供特殊应用的最佳结果。体现本发明特征的试剂盒包括特异于利培酮和帕潘立酮的抗体。试剂盒还可以包括分析物的配体以及校准和对照材料。试剂可以以液体形式保持或者被冻干。
短语“校准和对照材料”表示含有待测的已知量的药物的任何标准的或参考材料。通过比较未知样品获得的结果与标准样品获得的结果来计算药物浓度。这通常通过建立校准曲线来进行。
术语“生物学样品”包括但不限于任意量的来自生物或以前的生物的物质。这样的生物包括但不限于人、小鼠、猴子、大鼠、兔子、马和其它动物。这样的物质包括但不限于血液、血清、血浆、尿、细胞、器官、组织、骨骼、骨髓、淋巴、淋巴结、滑膜组织、软骨细胞、滑液巨噬细胞、内皮细胞和皮肤。
试剂和免疫原
在基于抗体的免疫测定中，构建利培酮的缀合物与样本中的利培酮和帕潘立酮竞争抗体结合位点。在本发明的免疫测定中，式III的试剂是式II的帕潘立酮9‑羟基上形成的氧取代的利培酮衍生物。在式III的化合物中，接头间隔子构成该分子的"Y‑X"部分。这些接头X和间隔子Y是在制备免疫测定的缀合物和产生抗体的免疫原中常规的。用来制备用于免疫测定的缀合物和免疫原的任何常规间隔子连接基团可以用在式III的化合物中。这样的常规接头和间隔子在美国专利5,501,987和5,101,015中有公开。
缀合物和免疫原从式II的化合物制备。在载体与半抗原的缀合物或免疫原中，载体在其多胺聚合物部分所含的一个或多个反应性氨基基团的一个或多个位点与半抗原连接，具有下列结构：

其中X'是‑CH2或功能性连接基团，B、p和Y如前所述。
优选的间隔物基团包括上述提到的间隔基团。特别优选的间隔基团是含有1‑10个碳原子的亚烷基，

其中n和o是0‑6的整数，m是1‑10的整数，亚烷基是特别优选的间隔基团。
在式IV的化合物中，X’是连接间隔物的官能团，优选通过聚合载体上的反应性胺基团进行。基团X’是式III化合物的末端官能团X结合载体或免疫原的多胺聚合物中的反应性氨基后形成。任何能与氨基反应的末端官能团可用作式III化合物中的官能团X。优选在X内包括的这些末端官能团为：
或‑N＝C＝R4
其中R3是氢、卤素、羟基或与其连接的氧原子一起形成反应性酯，R4是氧或硫。基团‑N=C=R4可以为异氰酸酯或异硫氰酸酯。由R3形成的活化酯包括亚氨酸酯，例如N‑羟基琥珀酰胺、1‑羟基苯并三唑和对硝基苯酯。然而可以使用能与胺基反应的任何活化酯。
通过常规手段将羧基和活化酯偶联到载体或免疫原性聚合物上。多胺聚合物例如蛋白质上的胺基产生了将间隔子连接到聚合物、免疫原或载体和/或本发明的缀合物的酰胺基。
在本发明的免疫原和缀合物中，在载体或免疫原上含羧基的式III半抗原与多胺聚合物上的氨基之间的化学键可以用本领域技术人员公知的各种方法来建立。经常优选形成酰胺键。首先通过活化形成式III化合物中X的羧酸部分，随后通过羧基与离去基团试剂(例如，N‑羟基琥珀酰亚胺、1‑羟基苯并三唑、对硝基苯酚等)反应来形成酰胺键。可以使用活化试剂如二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺等。形成式III化合物X的羧酸部分也可通过转化成相应的酸卤化物活化，例如使用亚硫酰氯、亚硫酰溴等。式III的利培酮半抗原中羧酸基团的活化形式随后与含有载体的缓冲溶液经反应性氨基进行反应。
当式III化合物中的X含有醛基时，这些化合物可与载体上的多胺多肽上的游离氨基经还原性胺化后形成的胺键连接。可使用任何缩合醛与胺的常规方法，例如通过还原性胺化形成该连接。本案中，式IV的配体部分的X'是‑CH2‑。
另一方面，当X是式III化合物中的末端异氰酸酯或硫异氰酸酯基团时，当与多胺聚合物的自由胺反应的这些基团产生了式IV的缀合物或免疫原，其中X'与多胺载体或免疫原多肽上的氨基连接。
式III的化合物可通过与含有多胺或多肽的载体反应转化成本发明的免疫原和/或缀合物试剂。同一多肽可用作载体和本发明免疫原中的免疫原性聚合物，条件是多胺或多肽是免疫活化的。然而，为形成缀合物，这些聚合物不必产生免疫原所需要的免疫应答。根据本发明，式III化合物中由X代表的不同官能团可与含有带反应性氨基的聚合物的载体通过将官能团附着到聚合物中所含的氨基的常规方法缀合。根据一个优选的实施方案，式III的化合物中X是羧酸基团或其活性酯。
式III的化合物可从下式化合物形成：

式III的化合物从下式化合物形成：

其中B、Y和X如前所述。
当将式IX‑A的化合物转化为式X化合物的衍生物（其中B为‑O‑CH2‑）时，将式IX‑A的化合物与下式的化合物反应，
卤代‑CH2‑(Y)p‑X XI‑A
其中p、Y和X如前所述。
形成这些衍生物时，可使用任何使醇反应形成醚的常规方法缩合式XI‑A的卤代化合物和式IX‑A化合物的羟基。式XI‑A化合物中使用卤化物提供了通过缩合醇形成醚的有效方法。另一方面是式XI‑A的化合物含有能干扰该反应形成所述衍生物的官能团，这些官能团可通过适当的保护基团保护，所述保护基团可在该反应后如前所述去除。
其中B是的式X的化合物中，利用任何常规的酯化方法，使式IX‑A的化合物中的游离羟基与式的化合物XI‑B反应，其中Y、X和p如前所述。
在酯化前，式IX‑A上的氨基可使用任何常规的氨基保护基团保护。
其中B是的式X化合物的衍生物是如下制备的：在用前述的任何常规的羧化物活化的方法首先激活式IX‑C化合物上的羧基后，将式IX‑B化合物上的羧基与式IX‑C的氨基化合物反应，
NH2‑CH2‑(Y)p‑X XI‑C
其中X、Y和p如前所述。在该反应之前，式XI‑C的化合物上的反应性基团可如前所述使用常规的保护基团保护。这些保护基团可在该酰胺化反应后通过常规方法去除，例如前文所述的那些。任何保护氨基的方法可用于式X的化合物。氨基保护基团可通过常规方法去除。
其中B是的式X化合物的衍生物是如下制备的：在用前述的任何常规的羧化物活化的方法首先激活式IX‑B化合物上的羧基后，将式IX‑B的化合物上的羧基与下式的羟基化合物反应，
HO‑CH2‑(Y)p‑X XI‑D
其中X、Y和p如前所述。在该反应之前，式XI‑D的化合物上的反应性基团可如前所述使用常规的保护基团保护。这些保护基团可在该酯化反应后通过常规方法去除，例如前文所述的那些。任何保护氨基的方法可用于式X的化合物。氨基保护基团可通过常规方法去除。
其中B是的式X化合物的衍生物是如下制备的：将式IX‑C的化合物上的胺基与含有下式羧化物的化合物反应：
HOOC‑CH2‑(Y)p‑X XI‑E
其中X、Y和p如前所述。在反应前，式IX‑C化合物上的邻位的胺可选择地的用常规保护基团保护。用前述的任何常规的羧化物活化的方法，首先激活式XI‑E的羧化物后进行酰胺化反应。在该反应之前，式XI‑E的化合物上的反应性基团可如前所述使用常规的保护基团保护。这些保护基团可在该酰胺化反应后通过常规方法去除，例如前文所述的那些。
其中B是或的式X化合物的衍生物是如下制备的：将式IX‑C的化合物上的胺基基团与含有下式的异氰酸酯或硫异氰酸酯反应：
R4＝C＝N‑(Y)p‑X XI‑F
其中X、Y和p如前所述，R4是O或S。在反应前，式IX‑C化合物上的邻位的胺必需选择地的用常规保护基团保护。向式IX‑C的缓冲溶液中加入式XI‑F后进行缩合反应。在该反应前，式XI‑F的化合物上的反应性基团可如前所述用常规保护基团保护。这些保护基团可在该缩合反应后通过常规方法去除，例如前文所述的那些。
式X的化合物可使用任何从式IX的化合物合成帕潘立酮的方法转化为式III的化合物。该过程中式X化合物的官能团X由适当的保护基团保护，形成式III的化合物后，保护基团可通过常规方法去除。
抗体
本发明还涉及包括通过使用前述免疫原产生的利培酮和帕潘立酮的单克隆抗体的新型抗体。根据本发明，已经发现这些本发明产生的抗体与利培酮和帕潘立酮具有选择性的反应性，选择性反应性表示抗体与利培酮和帕潘立酮反应，而基本上不与无药用活性的利培酮和帕潘立酮代谢物7‑羟基‑利培酮反应，其反应性低于与利培酮和帕潘立酮反应性的40%，优选低于25%，并且基本不与其他无药用活性利培酮和帕潘立酮代谢物，尤其是N‑脱烷基‑利培酮无交叉反应性，其中基本上无交叉反应性低于其与利培酮和帕潘立酮反应性的5%。这些选择性的性质提供了精确检测患者体液样本中利培酮和帕潘立酮存在和/或量化的免疫测定的抗体。
本发明涉及利培酮和帕潘立酮的新的抗体和单克隆抗体。本发明的抗血清可通过使用本发明的免疫原免疫宿主动物而常规产生。合适的宿主动物包括啮齿类，例如小鼠、大鼠、兔子、豚鼠等，或者较高等的哺乳动物，例如山羊、绵羊、马等。根据用于引发动物中的免疫反应的接受的规程，给以初始剂量、出血和加强注射，例如，在优选实施方式中，小鼠接受100μg免疫原/小鼠初始剂量，i.p.和随后两次或多次50‑100μg免疫原/小鼠加强注射进行六个月以上。通过周期性的出血，利用常规的免疫测定观察免疫小鼠的血液样品以发展对抗利培酮和帕潘立酮的免疫反应。这些方法提供了筛选产生了具有需要活性的抗血清的宿主的方便方法。同样筛选了利培酮和帕潘立酮主要代谢产物的抗体，显示了与所述化合物的显著结合。
与利培酮和帕潘立酮选择性反应的抗体基本上不与无药用活性的利培酮和帕潘立酮代谢物7‑羟基‑利培酮反应，其反应性低于与利培酮和帕潘立酮反应性的40%，优选低于25%，并且基本不与其他无药用活性利培酮和帕潘立酮代谢物，尤其是N‑脱烷基‑利培酮具有交叉反应性，其中基本上无交叉反应性低于其与利培酮和帕潘立酮反应性的5%。所述抗体可利用式III的免疫原通过下文公开的筛选方法产生。该筛选方法可用于获得能与利培酮和帕潘立酮化学治疗剂反应的抗体，其是特异性的，并且对这些化疗剂具有选择性，具有任何对于这些化疗剂所需要的相对反应性。
在制备这些抗体时，免疫原性载体可与式III的免疫原缀合，用于免疫宿主动物，包括啮齿类，例如小鼠、大鼠、兔子、豚鼠等，或者较高等的哺乳动物，例如山羊、绵羊、马等。对式III化合物的免疫应答可通过ELISA，使用包被BSA和式III化合物的缀合物的微量滴定板监测。一旦免疫应答充分，可分离宿主动物的脾细胞，并与无限增殖化细胞系融合。在单克隆抗体的制备中，融合的细胞可平铺于96孔板上，在选择性培养基的存在下生长以选择杂交瘤细胞。对杂交瘤上清和抗血清进行测定，通过ELISA检测抗利培酮抗体的存在。来自具有ELISA阳性孔中的抗体可通过间接竞争性微量滴定板试验测定利培酮和帕潘立酮的结合。分析物例如利培酮、帕潘立酮及其代谢物的IC50值可通过该试验计算。测定中分析物的IC50(50%抑制浓度)是样品中分析物的浓度，该浓度下测定中的信号是在无该分析物的抑制测定中全信号的50%。分析物的选择性反应性以IC50的比值表示如下：a%:100%‑([IC50‑分析物/(IC50‑利培酮+IC50‑帕潘立酮)]x100)。IC50的计算根据免疫测定手册(pp 108‑110,3rdedition,D.Wild编辑，Elsevier出版,Amsterdam,2005)中所述的方法进行。如上式中所示，分析物的IC50值与分析物的反应性成反比。100%或接近100%的孔中的细胞可通过限制性稀释亚克隆，以分离产生单克隆抗利培酮抗体的克隆。来自具有需要的利培酮和帕潘立酮相对反应性的孔中的细胞可通过限制性稀释亚克隆，以分离产生单克隆抗利培酮抗体的克隆，其足以与帕潘立酮交叉反应，对所述药物是选择性的。
根据上述计划接着给小鼠i.p.或i.v.注射100μg免疫原连续三天，在细胞融合三或四天前开始，通过免疫Balb/c小鼠方便地产生单克隆抗体。当然也可以利用抗体领域中公知的其它方法。本文中详细的完全免疫方法提供了用于利培酮或其药物活性代谢物帕潘立酮抗体的血清抗体反应的最佳方法。
从宿主的脾脏、外周血液、淋巴结或其它组织获得的B淋巴细胞可以用作单克隆抗体产生细胞。最优选的是从脾脏得到的B淋巴细胞。通过将这种B淋巴细胞与无限增殖细胞系融合得到能产生本发明需要的单克隆抗体的杂交瘤，该无限增殖细胞系为在杂交细胞上给予长期组织培养稳定性的细胞系。在本发明优选的实施方式中，无限增殖细胞可以为类淋巴母细胞或者浆细胞瘤细胞如骨髓瘤细胞，其自身是抗体产生细胞而且是恶性的。产生利培酮或其药物活性代谢物帕潘立酮的单克隆抗体的鼠类杂交瘤是通过融合小鼠骨髓瘤细胞和来自免疫了利培酮蛋白质缀合物的小鼠的脾细胞而形成的。嵌合的和人源化的单克隆抗体可以通过克隆来自杂交瘤细胞的抗体表达基因，并使用现在本领域公知的重组DNA方法，将小鼠可变区连接到人恒定区或者将人框架区与来自供体小鼠或大鼠免疫球蛋白的互补决定区(CDR)组合来产生。实施鼠类单克隆抗体人源化的改进方法在国际专利申请WO92/11018中有阐述，其提供了增强亲和力的抗体。
可以产生仅含有部分初级抗体结构的多肽片段，该片段拥有一种或多种免疫球蛋白活性。这些多肽片段可以使用本领域公知的方法通过完整抗体的蛋白酶裂解来生产，或者使用定向诱变在含有抗体基因的表达载体中需要的位置插入终止密码子来产生Fab片段或(Fab’)2片段。单链抗体可以通过将VL和VH区域与DNA接头结合产生(见Huston等，1988,Proc.NatlAcad.Sci.U.SA.,85:5879‑5883和Bird等,1988,Science,242:423‑426)。
本发明的抗体与利培酮和帕潘立酮具有选择性反应性，而基本上不与其药用或无药用活性代谢物7‑羟基‑利培酮反应，并且基本与其他药用或无药用活性代谢物，例如N‑脱烷基‑利培酮无交叉反应性。“基本上不与其药用或无药用活性代谢物7‑羟基‑利培酮反应”表示本发明的抗体与7‑羟基‑利培酮的反应性低于与利培酮和帕潘立酮组合反应性的40%，优选低于25%；“基本与除7‑羟基‑利培酮以外的药用或无药用活性代谢物无交叉反应性”表示本发明的抗体与这些其他药用或无药用活性代谢物，例如N‑脱烷基‑利培酮的交叉反应性低于其与利培酮和帕潘立酮组合反应性的5%，优选低于2%。
免疫测定
根据本发明，由式III的这些化合物的免疫原产生的前述缀合物和抗体可以用作确定患者样品中利培酮和帕潘立酮的试剂。这种测定通过免疫测定进行。由式III的化合物形成的试剂缀合物与样品中的利培酮和帕潘立酮竞争本发明产生的抗体上的结合部位的任何免疫测定可以用于确定患者样品中利培酮和帕潘立酮的存在。在怀疑含有利培酮和帕潘立酮的样品中进行这种分析利培酮和帕潘立酮的方法，其包括组合(a)含水介质样品，(b)本发明产生的利培酮和帕潘立酮抗体和(c)由式III的化合物或其混合物形成的缀合物。样品中利培酮和帕潘立酮的量可以通过测量结合添加到样品和抗体的混合物中的已知量的缀合物的特异抗体的抑制来确定。将通过未知样品抑制已知量缀合物的这种结合的结果与通过利用已知利培酮标准溶液的相同分析所得到的结果比较。在确定未知样品中利培酮和帕潘立酮的量时，可以以任何顺序添加样品、由式III的化合物形成的缀合物以及抗体。
可以采用多种方法来测量结合到抗体的、由式III的化合物形成的缀合物的量。一种方法是缀合物与抗体的结合引起了荧光基团缀合物旋转速率的降低。在液体混合物中荧光基团缀合物旋转速率的降低量可以通过荧光极化技术来检测，例如美国专利No.4,269,511和4,420,568所公开。
另一方面，抗体可以包被或吸收在纳米粒子上，使得这些粒子与由式V的化合物形成的利培酮缀合物反应时，这些纳米粒子形成聚集体。然而，当包被或吸收纳米粒子的抗体与样品中的利培酮和帕潘立酮反应时，来自结合到这些纳米粒子的样品的利培酮和帕潘立酮不产生抗体纳米粒子的聚集。通过吸光度在分析混合物中可以测量聚集或凝聚的量。
另一方面，可以通过将抗体或者利培酮缀合物附着到如微量滴定板的固相载体或者任何其它包括固体粒子的常规固相载体上来进行这些分析。将抗体和蛋白附着到这种固体粒子上是本领域公知的。可以利用任何常规方法来进行这种附着。在许多情况下，为了有助于测量，可以将标记放置在抗体、缀合物或者固体粒子上，所述标记例如放射性标记或酶标记，用作辅助检测与抗体结合或未结合的由式III的化合物形成的缀合物的量。其它合适的标记包括发色团、荧光基团等。
为方便起见，本发明的分析组分可以在试剂盒中提供，与预定量的用于分析利培酮和帕潘立酮的新试剂包装组合。这些试剂包括本发明的抗体，还有由式V的化合物形成的缀合物。
除了这些必需的试剂，可以包括添加剂如辅助试剂，例如稳定剂、缓冲剂等。各种试剂的相对量可以广泛变化，以提供基本上使分析敏感性最佳化的试剂在溶液中的浓度。试剂可以在溶液中或者作为干粉，通常是冻干的，包括赋形剂，其在溶解时提供具有进行分析的合适浓度的试剂溶液。
实施例
在实施例中，指定使用下列缩写：
MsCl   甲磺酰氯
DIPEA  N,N’‑二异丙基乙胺
THF    四氢呋喃
TFA    三氟乙酸
pTSA  对甲苯磺酸
HATU O‑(7‑氮杂苯并三唑‑1‑基)‑N,N,N’,N’‑四甲基脲六氟磷酸酯
DMF    二甲基甲酰胺
DMSO   二甲基亚砜
s‑NHS  硫代‑N‑羟基琥珀酰亚胺
EDC    1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳化二亚胺盐酸盐
KLH    钥孔戚血蓝素
BSA    牛血清白蛋白
PBS    磷酸盐缓冲盐水
NaCl   氯化钠
HRP    辣根过氧化物酶
ANS    8‑苯胺基‑1‑萘磺酸
TMB    3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺
TRIS   三羟甲基氨基甲烷盐酸盐
diH2O  去离子水
磷酸盐缓冲液组合物具有含下述成分的溶液：
15.4mM磷酸氢二钠(Na2HPO4)
4.6mM磷酸二氢钠(NaH2PO4)
pH=7.2±0.10
在实施例中，下述方案1‑2给出了制备的特定化合物，并通过实施例中的编号表示。方案如下：
方案1

方案2

实施例1
利培酮(9‑基氧)戊酸衍生物[9]的制备(方案1)
0℃下，在氮气气氛中将化合物[1](10.0g,90.8mmol)溶于无水DMF(200mL)中。搅拌加入NaH(60%,3.62g,90.8mmol)，将混合物温热至环境温度1小时。向反应混合物中加入5‑溴戊酸甲酯(17.72g,90.80mmol)，继续搅拌过夜。反应混合物用水稀释，EtOAc萃取。萃取物用水洗涤，随后用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，蒸发溶剂分离粗产物[2]。使用20‑90%EtOAc/己烷，通过快速色谱除去杂质分离得到纯化合物[2](12.80g,63%)。
将化合物[2](12.80g,57.14mmol)，化合物[3](8.80g,68.57mmol)和pTSAH2O(2.0g,10.5mmol)溶于二甲苯(300mL)，将所得混合物在Dean‑Stark条件下回流加热12小时。12小时后减压除去二甲苯，向残留物中加入饱和NaHCO3，用EtOAc萃取浆液。有机相用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，蒸发获得粗产物[4]。该物质用1:1的醚/己烷混合物研磨，以分离纯化合物[4](10.40g,55%)。
将化合物[4](9.90g,29.64mmol)和AlCl3(1.98g,14.85mmol)在无水二氯乙烷中的混合物在氮气下在95℃加热6小时，随后向混合物中加入另一批AlCl3(1.0g,7.40mmol)，继续搅拌5小时。将烧瓶中的成分冷却至环境温度，用冰冷的水小心淬灭。加入饱和的NaHCO3，水相用5%MeOH/氯仿萃取，所得有机相用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，蒸发分离粗产品[5]。该粗产品用1:1的醚/己烷混合物研磨，以分离纯化合物[5](5.80g,58%)。
将化合物[5](2.0g,6.0mmol)溶于MeOH(70mL)和6N HCl(10mL)的混合物中，加入Pd‑C(10wt%,0.57g)。向搅拌的混合物中通入氢气，直到反应完全（通过MS监测）。随后用硅藻土板过滤反应混合物除去钯催化剂。蒸发滤液除去甲醇，将酸性水溶液混合物加入饱和NaHCO3中淬灭，随后用10%MeOH/氯仿萃取。有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，蒸发以分离所需产物[6](1.80g,89%)。
0℃下，在氮气气氛中将化合物[6](1.80g,5.32mmol)溶于无水CH2Cl2(30mL)，向搅拌的溶液中加入DIPEA(1.38g,10.64mmol)，随后滴加甲磺酰氯(0.67g,5.85mmol)。将反应混合物在0℃搅拌40分钟，随后除去溶剂获得粗制甲磺酸酯中间体。将该甲磺酸酯中间体溶于无水MeOH(50mL)，向该溶液中加入化合物[7](1.76g,7.95mmol)，随后加入DIPEA(1.80g,5.32mmol)。将该混合物加热回流1.5h，随后减压除去甲醇溶剂，残余物溶于氯仿。氯仿有机相用水和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并蒸发分离粗产物[8]，其通过快速色谱纯化，使用2‑5%MeOH/CHCl3洗脱得到纯产物[8](2.02g,70%)。
0℃下，将酯[8](2.0g,3.70mmol)溶于MeOH/THF的混合物(1:3,24mL)，加入LiOH H2O(0.46g,11.10mmol)的水溶液(6mL)。将混合物温热至环境温度，搅拌2小时。反应溶液用EtOAc稀释，用0.1N HCl洗涤。除去有机相放置在一边，剩余的水相用10%MeOH/CHCl3萃取，萃取物与之前的有机相合并，合并的有机相用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，蒸发以提供白色泡沫状的化合物[9](1.91g,99%)。
实施例2
利培酮(9‑基氧戊氨甲酰基)‑甲基‑苯甲酸衍生物[14]的制备(方案2)
0℃下，将化合物[9](700mg,1.33mmol)、化合物[12](440mg,1.46mmol)和DIPEA(0.86g,1.2mL,6.65mmol)溶于DMF(10mL)。加入HATU(1.21g,3.19mmol)，随后将反应混合物温热至环境温度，搅拌过夜。下一天，将反应混合物用EtOAc稀释，所得有机相用1M的HCl、饱和NaHCO3和水洗涤，干燥(Na2SO4)。除去溶剂后获得粗产物[13]，其通过快速色谱纯化，使用2‑8%MeOH/CHCl3洗脱获得白色固体状的纯产品[13](0.52g,55%)。
0℃下，在氮气气氛下将化合物[13](0.50g,0.7mmol)溶于无水CH2Cl2(10mL)，向该溶液中搅拌加入TFA(10mL)。在0℃继续搅拌3小时，随后在环境温度下搅拌20小时。随后减压蒸发溶剂，将所得残余物混悬于水中，冻干产生粗制酸[14]。将该干燥的材料溶于2%MeOH/CHCl3(5mL)，加入200mL醚，引起酸[14]从溶液中沉淀。过滤沉淀的固体，用醚洗涤，在40℃干燥获得灰白色粉末状的所需化合物[14](0.38g,72%)。
实施例3
从相应的酸[9]&[14]制备s‑NHS活化的药物衍生物的通用方法
利培酮酸衍生物[9]&[14]用EDC和s‑NHS活化，产生s‑NHS活化的利培酮酯[10]&[15]，用于最终的蛋白质缀合(实施例4和5)。
实施例3a
s‑NHS活化的酯利培酮(9‑基氧)戊酸衍生物[10]的制备
将利培酮衍生物[9](实施例1，方案1，(56.8mg))溶于5.68mL DMSO中，加入s‑NHS(66.56mg)和EDC(58.58mg)。将反应混合物在环境温度下在氮气气氛中搅拌20小时，产生s‑NHS活化的利培酮酯[10]。该反应混合物直接用于实施例4和5a。
实施例3b
s‑NHS活化的酯利培酮(9‑基氧戊氨基甲酰基)‑甲基‑苯甲酸衍生物[15]的制备
将利培酮衍生物[14](实施例2、方案2(25.0mg))溶于2.5mL DMSO中，加入s‑NHS(19.9mg)和EDC(17.6mg)。将反应混合物在环境温度下在氮气气氛中搅拌20小时，产生s‑NHS活化的利培酮酯[15]。该反应混合物直接用于实施例5b。
实施例4
带活化半抗原[10]的KLH免疫原的制备
将300mg KLH溶于20ml磷酸盐缓冲液(50mM,pH 7.5)中，随后加入4.85mL实施例3a中制备的s‑NHS活化的利培酮衍生物[10]，以制备KLH的蛋白溶液。将KLH和活化的利培酮衍生物[10]的反应混合物在室温下搅拌20小时产生利培酮[9]‑KLH缀合物。随后在室温下通过用30%DMSO的磷酸缓冲液(50mM,pH 7.5)透析纯化利培酮[9]‑KLH缀合物。随后分步除去DMSO部分：20%、10%和0%。最后在4℃下对磷酸盐缓冲液进行透析。通过紫外可见光谱鉴定利培酮[9]‑KLH缀合物。将所述缀合物稀释至终浓度为2mg/mL的磷酸盐缓冲液(50mM,pH 7.5).
实施例5a
制备BSA与活化半抗原[10]的缀合物
将1g BSA溶于磷酸盐缓冲液(50mM,pH 7.5)至终浓度为50mg/mL，以制备BSA的蛋白溶液。向该蛋白溶液中加入0.83mL实施例3a中制备的s‑NHS活化的利培酮衍生物[10]。加入到BSA蛋白溶液中的s‑NHS活化的利培酮衍生物[10]的量计算为利培酮衍生物[10]和BSA的摩尔比为1:1。将BSA和活化的利培酮衍生物[10]的混合物在室温下搅拌18小时，形成活化的利培酮酯[10]和BSA的缀合物。该缀合物随后用20%DMSO的磷酸缓冲液(50mM,pH 7.5)在室温下透析纯化。随后分步降低DMSO比例：10%和0%。最后在4℃下对磷酸盐缓冲液进行透析。纯化的利培酮[9]‑BSA缀合物通过UV/VIS光谱鉴定。
实施例5b
制备BSA与活化半抗原[15]的缀合物
将1g BSA溶于磷酸盐缓冲液(50mM,pH 7.5)至终浓度为50mg/mL，以制备BSA的蛋白溶液。向10.0mL在冰上搅拌的该蛋白溶液中加入0.620mL实施例3b中制备的s‑NHS活化的利培酮衍生物[15]。加入到BSA蛋白溶液中的s‑NHS活化的利培酮衍生物[15]的量计算为利培酮衍生物[15]和BSA的摩尔比为1:1。将BSA和活化的利培酮衍生物[15]的混合物在室温下搅拌18小时，形成活化的利培酮酯[15]和BSA的缀合物。该缀合物随后用15%DMSO的磷酸缓冲液(50mM,pH 7.5)在室温下透析纯化。随后分步降低DMSO比例：10%、5%和0%。最后在4℃对磷酸盐缓冲液进行透析。纯化的利培酮[14]‑BSA缀合物通过UV/VIS光谱鉴定。
实施例6a
利培酮[9]多克隆抗体的制备
10只雌性BALB/c小鼠用实施例4中制备的完全弗氏佐剂乳化的100μg/小鼠的利培酮[9]‑KLH免疫原进行i.p.免疫。在用以100μg/小鼠在不完全弗氏佐剂中乳化的相同免疫原初次注射后四星期，给小鼠加强一次。加强试验后20天，通过眼窝放血获得从每只小鼠放出的含多克隆抗体的测试用血。通过离心测试用血，获得抗血清。这些测试用血的抗血清含有利培酮[9]‑KLH免疫原的多克隆抗体，其在实施例8a和9中进行评价。
实施例6b
利培酮[9]单克隆抗体的制备
实施例6a的小鼠用实施例4中制备的利培酮[9]‑KLH免疫以产生单克隆抗体。为了融合前3天开始制备单克隆抗体，给小鼠i.p.注射400μg(融合前3天)、200μg(融合前2天)和200μg(融合前1天)的如实施例4中制备的PBS中的利培酮[9]‑KLH。从挑选的小鼠分离脾细胞，并根据Coligan,J.E.等人,eds.,Current Protocols in Immunology，2.5.1‑2.5.8,(1992),Wiley & Sons,NY的方法，用具有50%聚乙二醇1500的2×107SP2/0细胞融合。将融合的细胞铺板在用20%FetalClone I、2%L‑谷氨酰胺(100mM)和2%50x HAT补充的DMEM/F12中的10个96孔板上。2‑3周后，通过ELISA分析杂交瘤上清抗‑利培酮抗体的存在(实施例8b)。将具有阳性ELISA结果(实施例8b)的孔的细胞平铺到24孔板中。将ELISA阳性的克隆通过Coligan,J.E.等人,eds.,Current Protocols in Immunology，2.5.8‑2.5.17,(1992),Wiley & Sons,NY.中的限制性稀释方法亚克隆2次。含来自选择的亚克隆的单克隆抗体的杂交瘤培养物上清通过竞争性ELISA试验验证了与利培酮的结合（实施例9）。通过实施例9中所述的间接竞争性微量滴定板分析测定了这些单克隆抗体对利培酮的结合和对主要利培酮代谢物7‑羟基‑利培酮的交叉反应性。
实施例7a
利培酮[9]‑BSA缀合物的微量滴定板敏化过程
在为蛋白质结合而优化且每板含有96孔的聚苯乙烯微量滴定板(Nunc MaxiSorp C8或F8Immunomodules)中进行测量利培酮浓度的ELISA方法。通过添加在0.05M pH=9.6的碳酸氢钠中10μg/mL的300μL利培酮[9]‑BSA缀合物并在室温下温育3小时，用利培酮[9]‑BSA缀合物(实施例5a所制备)包被每个孔。用0.05M pH=9.6的碳酸氢钠洗涤孔，接着在室温下用375μL5%的蔗糖、0.2%酪蛋白酸钠溶液阻断30分钟。除去包被后(post‑coat)溶液后，培养板在37℃下干燥过夜。
实施例7b
利培酮[14]‑BSA缀合物的微量滴定板敏化过程
在为蛋白质结合而优化的且每板含有96孔的聚苯乙烯微量滴定板(Nunc MaxiSorp C8或F8Immunomodules)中进行测量利培酮浓度的ELISA方法。通过添加在0.05M pH＝9.6的碳酸氢钠中10μg/mL的300μL利培酮[14]‑BSA缀合物并在室温下温育3小时，用利培酮[9]‑BSA缀合物(实施例5b所制备)包被每个孔。用0.05M pH=9.6的碳酸氢钠洗涤孔，接着在室温下用375μL 5%的蔗糖、0.2%酪蛋白酸钠溶液阻断30分钟。除去包被后(post‑coat)溶液后，培养板在37℃下干燥过夜。
实施例8a
抗体筛查过程‑滴定
该过程是为了获取抗体或抗血清的稀释物，以在实施例9中测试用于替换。使用由实施例7a和7b所制备的利培酮‑BSA缀合物敏化的微量滴定板进行筛查利培酮抗体(在实施例6中制备)的ELISA方法。通过将含有多克隆利培酮抗体的测试血液的小鼠血清（如实施例6）在含有0.1%BSA和0.01%硫柳汞的磷酸盐缓冲盐水中稀释为1:2,000、1:6,000、1:15,000和1:54,000（体积/体积），以进行抗体筛查实验。对于单克隆抗体的评价而言，将实施例6b的杂交瘤上清液（其通过实施例8b的方法鉴定为抗体阳性）在含有0.1%BSA和0.01%硫柳汞的磷酸盐缓冲盐水中稀释为1:2、1:4、1:16等（体积/体积）。向每个利培酮‑BSA敏化的孔(实施例7a、7b所制备)中添加50μl含有0.1%BSA和0.01%硫柳汞的磷酸盐缓冲盐水以及50μl稀释的抗体，在室温下振荡培养10分钟。在此期间，抗体结合被动吸附于孔中的利培酮‑BSA缀合物(实施例7a和7b)。培养板孔用pH 7.8的0.02M TRIS、0.9%NaCl、0.5%Tween‑80和0.001%和硫柳汞洗涤3次，除去任何未结合的抗体。为检测孔中与利培酮‑BSA缀合物结合的利培酮抗体的量，将用0.1%BSA、0.05%ANS、0.01%硫柳汞在PBS中稀释特异活性(约1/3000)、能特异结合鼠类免疫球蛋白并且当用底物（本例中为TMB）温育时可以产生有色产物的100μL的山羊抗小鼠抗体‑HRP酶缀合物(Jackson Immunoresearch)添加到各孔中。在室温下摇动温育10分钟后，在该期间，山羊抗小鼠抗体‑HRP酶缀合物在孔中结合利培酮抗体，再洗涤该板三次以除去未结合的山羊抗小鼠抗体‑HRP酶缀合物。为了显出孔中的可测颜色，洗涤后接着添加100μL用于HRP的底物TMB(TMB Substrate,BioFx)，以在室温下摇动温育10分钟显色。显色温育后，向各孔中添加50μL终止液(在去离子水中1.5%的氟化钠)，以终止显色，摇动20秒后测定650nm时的吸光度(Molecular Devices Plate Reader)。孔中抗体的量与所测的吸光度是成比例的，并表示为产生吸光度为1.5的稀释度(滴度)。通过画出所测抗体(x轴)的对数抗体稀释度与650nm的吸光度(y轴)的图，并推知吸光度为1.5时的滴度。该滴度确定了用于实施例9描述的间接竞争微量滴定板分析的抗体浓度(稀释度)。
实施例8b
抗体筛查过程‑单克隆筛查
使用由实施例7a所描述的利培酮‑BSA敏化的微量滴定板进行筛查利培酮单克隆抗体(在实施例6b中制备)的ELISA方法。向每个利培酮‑BSA敏化的孔(实施例7所制备)中添加含有0.1%BSA和0.01%硫柳汞的磷酸盐缓冲盐水50μL，并接着添加50μL单克隆培养物上清液，在室温下摇动温育10分钟。在此温育过程中，抗体结合孔中的利培酮‑缀合物。用0.02MTRIS、0.9%NaCl、0.5%Tween‑80和0.001%硫柳汞，pH7.8洗涤板孔三次，除去任何未结合的抗体。为了检测孔中结合利培酮‑BSA缀合物的利培酮抗体的量，将用0.1%BSA、0.05%ANS、0.01%硫柳汞在PBS中稀释为约1/3000的、能特异结合鼠类免疫球蛋白并且当用底物（本例中为TMB）温育时产生有色产物的100μL的山羊抗小鼠抗体‑HRP酶缀合物(Jackson Immunoresearch)添加到各孔中。在室温下摇动温育10分钟后，在该期间山羊抗小鼠抗体‑HRP酶缀合物在孔中结合利培酮抗体，再洗涤该板三次以除去未结合的山羊抗小鼠抗体‑HRP酶缀合物。为了显出孔中的可测颜色，洗涤后接着添加100μL用于HRP的底物TMB(TMB Substrate,BioFx,HRP的底物)，以在室温下摇动温育10分钟时显色。显色温育后，向各孔中添加50μL终止液(在去离子水中1.5%的氟化钠)，以终止显色，摇动10秒后测定650nm(Molecular Devices Plate Reader)时的吸光度。孔中抗体的量与所测的吸光度是成比例的。具有大于3倍背景的吸光度的样品指定为阳性。将50份吸光度最高的样本如实施例6b所述铺到24孔培养板中。
实施例9
测定IC50以及抗体与利培酮交叉反应性的间接竞争微量滴定板免疫测定过程
使用由实施例7a和7b描述的利培酮‑BSA缀合物敏化的微量滴定板进来测量IC50值和进行交叉反应性的ELISA方法。将分析物‑利培酮和帕潘立酮及其无活性代谢物7‑羟基‑利培酮和N‑脱烷基‑利培酮在去离子水中稀释，稀释的浓度范围为1‑10,000ng/mL（使用利培酮[9]‑BSA微量滴定板，实施例7a）或0.5‑1,000ng/mL（使用利培酮[14]‑BSA微量滴定板，实施例7b）。通过温育50μL的分析物和50μL选自实施例6a中产生的多克隆抗体的抗血清之一和实施例4的免疫原或50μL实施例6b中产生的单克隆抗体之一，以进行分析。将各孔中抗血清或单克隆抗体的浓度稀释至实施例8a中测定的滴度，以进行分析。在10分钟的温育过程中(室温下，摇动)，抗体竞争结合孔中利培酮‑BSA缀合物（实施例7a和7b中产生）和溶液中的分析物。温育后，用0.02M TRIS、0.9%NaCl、0.5%Tween‑80和0.001%硫柳汞，pH7.8洗涤板孔三次，除去任何未结合的物质。为了检测孔中结合到利培酮BSA缀合物（实施例7a和7b中产生）的利培酮抗体的量，将用0.1%BSA、0.05%ANS、0.01%硫柳汞在PBS中稀释至预定的特别活性（约1/3000）、能特异结合鼠类免疫球蛋白并且当用底物（本例中为TMB）温育时产生有色产物的100μL的山羊抗小鼠抗体‑HRP酶缀合物(Jackson Immunoresearch)添加到各孔中。在室温下摇动温育10分钟后，在该期间山羊抗小鼠抗体‑HRP酶缀合物在孔中结合利培酮抗体，再洗涤该板三次以除去未结合的第二缀合物。为了显出孔中的可测颜色，洗涤后接着添加100μL用于HRP的底物TMB (TMB Substrate，BioFx)，以在室温下摇动温育10分钟显色。显色温育后，向各孔中添加50μL终止液(在去离子水中1.5%的氟化钠)，以终止显色，摇动20秒后测定650nm(Molecular Devices Plate Reader)时的吸光度。孔中抗体的量与所测的吸光度是成比例的，且与样品中利培酮的量成反比。通过用孔中的吸光度对孔中分析物的浓度作图，以构建剂量‑响应曲线确定利培酮和帕潘立酮的IC50。将含有分析物的孔中颜色的吸光度与没有分析物的比较，产生标准曲线。给定分析物的IC50值定义为要求抑制不含有分析物的孔的50%的吸光度的分析物的浓度。交叉反应性计算为利培酮的IC50与帕潘立酮的IC50的比例(以百分比表示)。当使用这些抗体测定时，利培酮相对于帕潘立酮的交叉反应性为100±20%。下表I给出了利培酮多克隆抗体的结果，表II中为利培酮单克隆抗体的结果。
表I
使用利培酮多克隆抗体的竞争性免疫测定的交叉反应性(实施例6a)。

表II
使用利培酮单克隆抗体的竞争性免疫测定的交叉反应性(实施例6b)。

从表中可以看出，本发明的抗体对于利培酮的活性形式基本上是选择性反应的，并且与活性代谢物帕潘立酮具有交叉反应性，与无活性代谢物7‑羟基‑利培酮和N‑脱烷基‑利培酮具有低交叉反应性。