一种高纯度牛磺熊去氧胆酸及其制备方法 技术领域 本发明涉及一种医药原料药及其制备方法， 具体涉及一种高纯度牛磺熊去氧胆酸 及其制备方法。
技术背景 牛磺熊去氧胆酸 (tauroursodeoxycholicacid) 化学名为 2-[[(3α， 5β， 7β)-3， 7- 二羟基 -24- 氧代胆甾烷 -24- 基 ] 氨基 ] 乙烷磺酸二水合物， 1902 年自熊胆中发现， 其 为熊胆中主要胆汁酸， 具有解痉、 抗惊厥、 抗炎及溶胆石等作用。牛磺熊去氧胆酸可增加胆 汁酸的分泌， 导致胆汁酸成分的变化， 使其在胆汁中含量增加。 牛磺熊去氧胆酸还可以抑制 肝脏胆固醇的合成， 降低胆汁中胆固醇及胆固醇酯的量和胆固醇的饱和指数， 从而有利于 胆汁中胆固醇逐渐溶解。
牛磺熊去氧胆酸最早由意大利 Bruschettini S.r.l. 大药厂研制， 于 1991 年首次 在意大利上市， 2007 年以商品名滔罗特 (taurolite) 获准在中国销售， 临床主要用于治疗 胆囊胆固醇结石、 原发硬化性胆管炎、 原发胆汁性肝硬化和慢性丙型病毒性肝炎等。
杂质的研究是药品研发的一项重要内容， 这一研究贯穿于药品研发的整个过程。 由于药品在临床使用中产生的不良反应除了与药品本身的药理活性有关外， 有时与药品中 存在的杂质也有很大关系。 因此规范地进行杂质的研究， 并将其控制在一个安全、 合理的限 度范围之内， 将直接关系到上市药品的质量及安全性。2005 年 3 月由国家食品药品监督管 理局发布的 《化学药物杂质研究的技术指导原则》 中明确规定， 对于最大日剂量≤ 2g 的原 料药， 最大单杂量的质控限度为 0.15％， 对于最大日剂量在 100mg 到 2g 的药物制剂， 最大单 杂量的质控限度为 0.2％。目前， 市售的滔罗特胶囊质量标准中没有对最大单杂量进行限 制， 仅仅是以薄层色谱法限制韬罗特中除牛磺酸、 熊去氧胆酸、 牛磺鹅去氧胆酸外的其他总 单杂量不得过 0.5％。
目前制备牛磺熊去氧胆酸所使用的起始原料为熊去氧胆酸， 一般通过两种途径获 得： 一是动物体内提取， 主要是熊胆汁提取， 这种方法因来源限制， 成本很高且成分复杂， 一 般采用 较少。 另一种方法是化学合成， 主要以动物胆酸类物质， 比如猪去氧胆酸， 鹅去氧胆 酸为原料进行合成。其中， 以鹅去氧胆酸为原料合成熊去氧胆酸是目前市场上纯度较高的 熊去氧胆酸的主要来源。但是， 通过这样途径制备的熊去氧胆酸不可避免的含有一定量的 鹅去氧胆酸， 同样在牛磺熊去氧胆酸的制备过程中， 会产生一定量的牛磺鹅去氧胆酸， 而牛
磺鹅去氧胆酸在小肠内可部分水解回复为游离型鹅去氧胆酸。 鹅去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆 酸虽然也具有一定的药理作用， 但同时也具有一定的毒性， 能使人体内谷氨酰转移酶 (ALT) 升高， 引起细胞凋亡而造成严重的肝组织损伤， 最终发展成肝硬化 ( 郑兴等 《熊去氧胆酸与 鹅去氧胆酸的对比研究》 )。 国外试验进一步证明， 胆汁酸的毒性作用取决于它们的疏水性， 一般说来， 疏水性越强， 对肝细胞的毒性越大。 牛磺鹅去氧胆酸疏水性指数 HI 为 0.46， 而牛 磺熊去氧胆酸是亲水性的， HI 为一 0.4， 是无毒的 ( 何秀玲等 《牛磺鹅去氧胆酸研究进展》 )。 因此， 严格控制牛磺熊去氧胆酸中牛磺鹅去氧胆酸的含量， 避免肝毒性的出现， 是十分重要 的。
现有技术中与牛磺熊去氧胆酸化学合成技术有关的报道及被普遍采用用于合成 牛磺熊去氧胆酸的方法主要包括 ：
US5565587 报道了用熊去氧胆酸与氯甲酸乙酯或特戊酰氯在二氧六环作溶剂的反 应条件下反应形成混合酸酐， 再在碱性条件下与牛磺酸反应， 得到的相品经离子交换柱纯 化制得牛磺熊去氧胆酸。但该法使用二氧六环作为溶剂， 二氧六环又称二恶烷， 毒性较大， 有致癌性， 并且能够在体内积蓄。同时， 本法采用离子交换柱纯化， 操作复杂， 成本高， 不利 于工业化生产。王海龙等 (《中国医药工业杂志》 2009， 40) 报道了该法的改进方法， 即以熊 去氧胆酸与 2， 2′ - 二硫二苯并噻唑反应制得熊去氧胆酸 -2- 苯并噻唑硫酯， 再经丙酮 - 水 (12 ∶ 1) 重结晶得纯品， 无需离子交换柱纯化。但该法放大试验后收率低下， 导致能耗很 高， 其成本是工业化生产所不能承受的。
Dayal B 等 (Bioorg Med Chem， 1996， 4) 报道了熊去氧胆酸和牛磺酸在碱性条件下 分别在 N- 乙氧羰基 -2- 乙氧基 -1， 2- 二氢喹啉 (EEDQ) 或氰基磷酸二乙酯 (DEPC) 作用下 直接缩合得牛磺熊去氧胆酸， 但此法试剂价昂贵。
US5362891 报道了熊去氧胆酸和氯甲酸乙酯形成混合酸酐后， 与对羟基苯丙酮缩 合， 得熊去氧胆酸的活性酚酯， 再与牛磺酸反应制得牛磺熊去氧胆酸， 但此法反应步骤较 多， 总收率较低。
而且现有技术中的牛磺熊去氧胆酸合成方法， 均不能有效去除原料中带入的牛黄 鹅去氧胆酸， 为牛磺熊去氧胆酸的使用带来了一定的安全隐患。 发明内容 本发明的目的之一是获得一种牛磺鹅去氧胆酸含量极低的牛磺熊去氧胆酸。
本发明的另一目的是在保证牛磺熊去氧胆酸中牛磺鹅去氧胆酸含量极低的前提 下， 控制除牛磺酸、 熊去氧胆酸、 牛磺鹅去氧胆酸外的其他最大单杂的含量。
本发明的再一目的是提供一种高纯度牛磺熊去氧胆酸的制备方法。
本发明的又一个目的是提供一种以高纯度牛磺熊去氧胆酸作为活性成分的药物 组合物。
为了实现上述目的， 本发明提供了一种高纯度的牛磺熊去氧胆酸， 其特征在于该 牛磺熊去氧胆酸所含的牛磺鹅去氧胆酸以液相色谱条件和方法测定不大于 0.7％ ； 优选所 含的牛磺鹅去氧胆酸以液相色谱条件和方法测定不大于 0.5％， 更优选为前述牛磺熊去氧 胆酸中除牛磺酸、 熊去氧胆酸、 牛磺鹅去氧胆酸外的最大单杂以液相色谱条件和方法测定 少于 0.15％ ； 最优选为前述牛磺熊去氧胆酸中除牛磺酸、 熊去氧胆酸、 牛磺鹅去氧胆酸外的
最大单杂以液相色谱条件和方法测定少于 0.1％。
本发明还提供了一种高含量牛磺熊去氧胆酸的制备方法， 是由熊去氧胆酸与氯甲 酸乙酯的成混合酸酐， 再与牛磺酸进行反应得牛磺熊去氧胆酸粗品， 粗品再进行重结晶而 得， 其特征在于整个工艺只使用丙酮、 水两种溶剂 ； 其中混合酸酐的制备方法优选为 ： 在反 应釜中， 加入熊去氧胆酸和丙酮， 搅拌下加入三乙胺， 开启制冷， 降温至 -10--5℃， 流加氯甲 酸乙酯， 控制加入速度使反应液温度不超过 5℃， 约 15-30 分钟加完， 继续保温搅拌 20-40 分 钟； 其中重结晶工艺优选为
(1) 将牛磺熊去氧胆酸粗品投入反应釜中， 加入丙酮和水， 加热搅拌至全部溶解 ；
(2) 搅拌下冷却至 -5-5℃， 析晶 30-48 小时 ；
(3) 放料至过滤器中抽滤， 抽干后用冰水 (-5-5℃ ) 淋洗滤饼， 再次抽干。
其中， 丙酮和水的体积 / 重量比为 1 ∶ 7 ～ 1 ∶ 12， 优选为 1 ∶ 10。
本发明还提供了一种药物组合物， 其含有高纯度牛磺熊去氧胆酸和药学上可以接 受的载体或赋形剂。 其中载体或赋形剂可以为乳糖、 微晶纤维素、 淀粉、 硬脂酸镁、 PVP、 羧甲 基淀粉钠、 交联聚维酮、 羟丙纤维素、 二氧化硅和乙醇， 该药物组合物可以为用于口服的胶 囊； 优选为每 1000 粒中含有以下组分 ： 高纯度牛磺熊去氧胆酸 250g、 乳糖 36g、 微晶纤维素 20g、 淀粉 10g、 硬脂酸镁 4g、 以及适量的聚维酮 K30 和 95％乙醇。 本发明与现有技术相比其优势在于 ：
1、 本发明的牛磺熊去氧胆酸纯度高， 所含牛磺鹅去氧胆酸及最大单杂量极少， 因 此， 在临床使用中安全性更高， 几乎无任何毒副反应。
2、 高纯度牛磺熊去氧胆酸的工艺简单、 成本低、 环境友好， 更适于工业化生产。
发明人通过大量的实验研究得知在熊去氧胆酸与氯甲酸乙酯形成的混合酸酐的 过程中， 如果流加氯甲酸乙酯前的起始反应温度在 -10℃以下， 将使得反应难以进行， 当起 始温度大于 -5℃时， 将使得反应出现较多的反应副产物和杂质。 在流加氯甲酸乙酯时， 反应 会释放出大量热量， 如果流入氯甲酸乙酯速度过快， 使得反应液温度超过 5℃， 或流加氯甲 酸乙酯的速度过慢， 反应时间超过 70 分钟， 均会导致反应出现较多的副产物和杂质。
在牛磺熊去氧胆酸的精制中， 因为牛磺熊去氧胆酸在水和丙酮中均有一定的溶解 性， 现有技术一般均采用离子交换柱纯化或采用以丙酮为主的溶剂体系重结晶牛磺熊去氧 胆酸得纯品。但发明人经过大量研究得知， 在牛磺熊去氧胆酸的精制中， 如果采用以水为 主的溶剂体系， 在丙酮加入量为一定比例时， 会使牛磺熊去氧胆酸以较好的晶形大量析出， 并且析晶所需的时间较短， 仅需要重结晶一到二次即能有效去除杂质， 提高纯度， 去除无机 盐， 大大节省了精制纯化所需的工业原料丙酮以及纯化时间和纯化步骤， 使得工业化精制 变得更加简便、 可行。
发明人通过大量的实验研究得知， 在丙酮的比例高于 1 ∶ 7 或者低于 1 ∶ 12 时， 牛磺熊去氧胆酸会很难析出来， 且晶体非常细小 ( 收率＜ 50％， 析晶时间大于 50 小时 )， 非 常不利于工业化大生产。但是， 在丙酮 / 水＝ 1 ∶ 7 ～ 1 ∶ 12 之间， 优选 1 ∶ 10 的时候， 牛磺熊去氧胆酸会以较好的晶体形态析出来， 而且收率也相当高 ( ≥ 80％ )， 同时， 仅需重 结晶一到二次， 即可得到纯度大于 99.0％的牛磺熊去氧胆酸终产物， 大大节省了工业原料 丙酮， 简化了对牛磺熊去氧胆酸粗品精制的处理工艺。
附图说明 图 1 测定市售滔罗特及批号为 100801、 100901、 100902 的含有牛磺熊去氧胆酸的 胶囊中有关物质的 HPLC 色谱图。
图 2 测定批号为 100702 的牛磺熊去氧胆酸原料药中有关物质的 HPLC 色谱图。
图 3 测定批号为 100801 的牛磺熊去氧胆酸原料药中有关物质的 HPLC 色谱图。
图 4 测定批号为 100802 的牛磺熊去氧胆酸原料药中有关物质的 HPLC 色谱图。
参考实施例
在相同的试验条件下分别检测了一批市售滔罗特胶囊以及以批号 100801 的牛磺 熊去氧胆酸为原料药所制备的胶囊 ： 批号 100801 ； 以批号 100702 为原料药所制备的胶囊 ： 批号 100901 ； 以批号 100802 为原料药所制备的胶囊 ： 批号 100902( 三批胶囊的制备方法均 是按实施例七制备的 )。
三批自研的牛磺熊去氧胆酸原料药 ( 批号 ： 100702、 100801、 100802)， 其 HPLC 谱图 见图 2、 图 3、 图 4。
测定方法为 ：
取样品适量 ( 含牛磺熊去氧胆酸约 25mg)， 精密称定， 加乙腈 - 水 (1 ∶ 1) 溶解并定 量稀释制成每 1ml 中约含牛磺熊去氧胆酸 5mg 的溶液， 作为供试品溶液 ； 取该溶液 20μl， 注入液相色谱仪， 记录色谱图至主成分峰保留时间的 3.5 倍 ； 供试品溶液色谱图中如有杂 质峰， 按而积归一化法计算。( 注 ： 牛磺熊去氧胆酸峰保留时间约为 21min。)
测定所用的色谱条件为 ：
仪器 ： 岛津 LC-10A 高效液相色谱仪 ；
工作站名称 ： LC-Solutio ；
色谱柱 ： Dikrma C18(4.6×150mm， 5μm) ；
流动相 ： 0.05mol/l 磷酸二氢钠 - 乙腈 (67 ： 33)( 用磷酸调节 pH 值至 4.4) ；
检测波长 ： 202nm ；
流速为 1.0ml/min ；
计算公式如下 ：
公式中， Ai 为单个杂质峰面积 ； ∑ Ai 为杂质峰面积之和 ； 表 1 原料药中有关物质测定结果称样量 25.2mg 25.2mg 25.8mg 总杂质含量％ 0.603 0.714 0.418 牛磺鹅去氧胆酸含量％ 0.361 0.431 0.251 其它单一最大杂质％ 0.087 0.132 0.056样品批号 100702 100801 100802
表 2 胶囊中有关物质测定结果6CN 102477059 A 样品批号 市售滔罗特 100801 100901 100902
称样量 32.1mg 32.3mg 33.9mg 34.2mg说总杂质含量％ 1.460 0.760 0.655 0.467明书5/9 页 其它单一最大杂质％ 0.253 0.136 0.096 0.061牛磺鹅去氧胆酸含量％ 0.931 0.456 0.386 0.265以上结果说明， 本发明中牛磺熊去氧胆酸的原料药和制剂中的总杂含量、 牛磺鹅 去氧胆酸含量及除牛磺酸、 熊去氧胆酸、 牛磺鹅去氧胆酸外的其他最大单杂的含量均明显 小于市售滔罗特中上述物质的含量。 具体实施方式
下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不 是对本发明的保护范围的进一步限定。下列实施例中未注明实验条件的， 按照常规条件。
实施例一
本实验对含不同牛磺鹅去氧胆酸杂质量的牛磺熊去氧胆酸样品的肝毒性进行了 研究。
1. 材料和方法 1.1 受试药物 ： 含牛磺鹅去氧胆酸杂质量 2％的牛磺熊去氧胆酸 ( 批号 ： 100810)， 白色粉末， 自制 ； 含牛磺鹅去氧胆酸杂质量 1％的牛磺熊去氧胆酸 ( 批号 ： 100811)， 白色粉 末， 自制 ； 含牛磺鹅去氧胆酸杂质量 0.7％的牛磺熊去氧胆酸 ( 批号 ： 100812)， 白色粉末， 自 制； 含牛磺鹅去氧胆酸杂质量 0.5％的牛磺熊去氧胆酸 ( 批号 ： 100813)， 白色粉末， 自制 ； 以上样品均不溶于水。
1.2 检测试剂 ： 肝功相关检测试剂盒购买自四川迈克生物科技有限公司， 主要包 括： 谷丙转氨酶 (ALT)、 谷草转氨酶 (AST)。
1.3 检测仪器 ： 全波长荧光、 分光检测仪 ( 美国 MD 公司 )
1.4 方法
采用正常 SD 大鼠 60 只， 随机分为 5 组， 分别为含牛磺鹅去氧胆酸杂质量 2％的牛 磺熊去氧胆酸组 (2％组 )、 含牛磺鹅去氧胆酸杂质量 1％的牛磺熊去氧胆酸组 (1％组 )、 含 牛磺鹅去氧胆酸杂质量 0.7％的牛磺熊去氧胆酸组 (0.7％组 )、 含牛磺鹅去氧胆酸杂质量 0.5％的牛磺熊去氧胆酸组 (0.5％组 )、 安慰剂对照组 ( 给予同体积的生理盐水 )， 各药物 组按剂量 50mg/kg 灌胃给药， 每天一次， 连续 20 天 ( 上述剂量是根据临床用量折算而得 )。 试验期间分别于给药第 5、 10、 20 天对大鼠肝功相关生化指标谷丙转氨酶 (ALT)、 谷草转氨 酶 (AST) 进行了检测， 检测方法参照试剂盒提供的方法进行。
2. 结果
观察了灌胃给药 5、 10、 20 天各组大鼠 ALT 和 AST 水平， 结果显示， 给药 5 天， 各组 大鼠 ALT 和 AST 水平没有明显改变 ( 表 3)。但给药 10 天时， 含牛磺鹅去氧胆酸杂质量 2％ 的牛磺熊去氧胆酸组 (2％组 ) 和含牛磺鹅去氧胆酸杂质量 1％的牛磺熊去氧胆酸组 (1％ 组 ) 大鼠的 ALT 和 AST 平均值有明显升高趋势， 与安慰剂组比较有统计学差异 (P ＜ 0.05) ； 其余各药物组与安慰剂对照组比较无显著差异 ( 见表 4)。连续给药至 20 天时， 含牛磺鹅 去氧胆酸杂质量 2％的牛磺熊去氧胆酸组 (2％组 ) 大鼠的 ALT 或 AST 平均值仍维持较高水
平， 与安慰剂组比较有统计学差异 (P ＜ 0.05)， 但有下降的趋势 ； 而含牛磺鹅去氧胆酸杂质 量 1％的牛磺熊去氧胆酸组 (1％组 ) 大鼠的 ALT 和 AST 平均值水平则基本恢复正常， 与安 慰剂组比较无统计学差异 (P ＞ 0.05) ； 同时含牛磺鹅去氧胆酸杂质量 0.7％和含牛磺鹅去 氧胆酸杂质量 0.5％的牛磺熊去氧胆酸组 (0.7％组和 0.5％组 ) 大鼠的 ALT 和 AST 平均值 水平正常， 与安慰剂对照组比较无显著差异 ( 见表 5)。
表 3 给药 5 天各试药对大鼠肝功相关生化指标的影响
表 4 给药 10 天各试药对大鼠肝功相关生化指标的影响
* 与安慰剂组大鼠比较， P ＜ 0.05 表 5 给药 20 天各试药对大鼠肝功相关生化指标的影响
* 与安慰剂组大鼠比较， P ＜ 0.05
3. 结论与讨论
含牛磺鹅去氧胆酸杂质量 2％的牛磺熊去氧胆酸组从给药第 10 天起引起大鼠肝 功能指标 ALT 和 AST 平均值升高， 并且持续至第 20 天。含牛磺鹅去氧胆酸杂质量 1％的牛 磺熊去氧胆酸组仅在给药第 10 天引起大鼠 ALT 和 AST 水平升高， 并且在第 20 天时恢复正 常。含牛磺鹅去氧胆酸杂质量 0.7％的牛磺熊去氧胆酸组， 含牛磺鹅去氧胆酸杂质量 0.5％ 的牛磺熊去氧胆酸组在 20 天内 ALT 或 AST 平均值都保持正常水平。 上述结果说明牛磺鹅去 氧胆酸杂质含量高会引起大鼠肝功能损害， 并且这种肝功能损害作用存在剂量依赖关系。 因此控制牛磺熊去氧胆酸中的牛磺鹅去氧胆酸杂质量可以有效地避免肝功能的损害。
实施例二高纯度的牛磺熊去氧胆酸的制备
a) 牛磺熊去氧胆酸粗品的制备， 按以下步骤进行 ：
在反应釜中， 加入 4.0KG 熊去氧胆酸， 加入 19KG 丙酮， 搅拌下加入三乙胺 1650ml， 开启夹套制冷， 将混合液的温度降至 -10℃。流加氯甲酸乙酯 1120ml， 控制氯甲酸乙酯的加 入速度， 使得反应液温度维持在 -5-0℃之间， 30 分钟时加完， 继续维持温度搅拌反应 40 分 钟， 制得熊去氧胆酸与氯甲酸乙酯的混合酸酐， 将上述混合酸酐反应液通过过滤器用氮气 压滤至装有 4.2KG 纯化水， 1.4KG 牛磺酸， 0.4KG 氢氧化钠的 50 升反应釜中， 充分搅拌反应 3 小时， 进一步制得牛磺熊去氧胆酸粗品 4.0KG。 b) 牛磺熊去氧胆酸粗品的精制， 按以下步骤进行 ：
(1) 将 4.0KG 牛磺熊去氧胆酸投入 50L 反应釜中， 加入 4KG 水和 580ml 丙酮， ， 加热 搅拌至全部溶解 ；
(2) 搅拌下冷却至 -5-0℃， 析晶 30 小时 ；
(3) 放料至过滤器中抽滤， 抽干后用冰水 (-3-0℃ ) 淋洗滤饼， 再次抽干， 得牛磺熊 去氧胆酸 3.3KG( 纯度 99.6％， HPLC)， 其中牛磺鹅去氧胆酸的含量为 0.3％， 其他最大单杂 含量 0.05％ ( 液相色谱测定 )
实施例三高纯度的牛磺熊去氧胆酸的制备方法
a) 牛磺熊去氧胆酸粗品的制备， 按以下步骤进行 ：
在反应釜中， 加入 40.0KG 熊去氧胆酸， 加入 190KG 丙酮， 搅拌下加入三乙胺 16.5L， 开启夹套制冷， 将混合液的温度降至 -5℃。流加氯甲酸乙酯 11.2L， 控制氯甲酸乙酯的加入 速度， 使得反应液温度维持在 3-5℃之间， 30 分钟时加完， 继续维持温度搅拌反应 30 分钟， 制得熊去氧胆酸与氯甲酸乙酯的混合酸酐， 将上述混合酸酐反应液通过过滤器用氮气压滤 至装 有 42KG 纯化水， 14KG 牛磺酸， 4KG 氢氧化钠的 500 升反应釜中， 充分搅拌反应 3 小时， 进一步制得牛磺熊去氧胆酸粗品 39.8KG。
b) 牛磺熊去氧胆酸粗品的精制， 按以下步骤进行 ：
(1) 将 39.8KG 牛磺熊去氧胆酸投入 500L 反应釜中， 加入 40KG 水和 3334ml 丙酮， ， 加热搅拌至全部溶解 ；
(2) 搅拌下冷却至 3-5℃， 析晶 48 小时 ；
(3) 放料至过滤器中抽滤， 抽干后用冰水 (0-3℃ ) 淋洗滤饼， 再次抽干， 得牛磺熊 去氧胆酸 32.8KG( 纯度 99.2％， HPLC)， 其中牛磺鹅去氧胆酸的含量为 0.6％， 其他最大单杂 含量 0.12％ ( 液相色潜测定 )
实施例四高纯度的牛磺熊去氧胆酸的制备方法
a) 牛磺熊去氧胆酸粗品的制备， 按以下步骤进行 ：
在反应釜中， 加入 30.0KG 熊去氧胆酸， 加入 142.5KG 丙酮， 搅拌下加入三乙胺 12.38L， 开启夹套制冷， 将混合液的温度降至 0℃。流加氯甲酸乙酯 8.4L， 控制氯甲酸乙酯 的加入速度， 使得反应液温度维持在 0-5℃之间， 20 分钟时加完， 继续维持温度搅拌反应 35 分钟， 制得熊去氧胆酸与氯甲酸乙酯的混合酸酐， 将上述混合酸酐反应液通过过滤器用氮 气压滤至装有 31.5KG 纯化水， 10.5KG 牛磺酸， 3KG 氢氧化钠的 500 升反应釜中， 充分搅拌反 应 3 小时， 进一步制得牛磺熊去氧胆酸粗品 28.9KG。
b) 牛磺熊去氧胆酸粗品的精制， 按以下步骤进行 ：
(1) 将 28.9KG 牛磺熊去氧胆酸投入 500L 反应釜中， 加入 30KG 水和 3000ml 丙酮， 加热搅拌至全部溶解 ；
(2) 搅拌下冷却至 0℃， 析晶 35 小时 ；
(3) 放料至过滤器中抽滤， 抽干后用冰水 (0-3℃ ) 淋洗滤饼， 再次抽干， 得牛磺熊 去氧胆酸 23.5KG( 纯度 99.3％， HPLC)， 其中牛磺鹅去氧胆酸的含量为 0.4％， 其他最大单杂 含量 0.09％ ( 液相色谱测定 )
实施例五高纯度的牛磺熊去氧胆酸的制备方法
a) 牛磺熊去氧胆酸粗品的制备， 按以下步骤进行 ：
在反应釜中， 加入 20.0KG 熊去氧胆酸， 加入 95KG 丙酮， 搅拌下加入三乙胺 8.25L， 开启夹套制冷， 将混合液的温度降至 -6℃。流加氯甲酸乙酯 5.6L， 控制氯甲酸乙酯的加入 速度， 使得反应液温度维持在 0-3℃之间， 15 分钟时加完， 继续维持温度搅拌反应 40 分钟， 制得熊去氧胆酸与氯甲酸乙酯的混合酸酐， 将上述混合酸酐反应液通过过滤器用氮气压滤 至装有 21KG 纯化水， 7KG 牛磺酸， 2KG 氢氧化钠的 500 升反应釜中， 充分搅拌反应 3 小时， 进 一 步制得牛磺熊去氧胆酸粗品 18.9KG。
b) 牛磺熊去氧胆酸粗品的精制， 按以下步骤进行 ：
(1) 将 18.9KG 牛磺熊去氧胆酸投入 500L 反应釜中， 加入 20KG 水和 2230ml 丙酮， 加热搅拌至全部溶解 ；
(2) 搅拌下冷却至 -2-1℃， 析晶 35 小时 ；
(3) 放料至过滤器中抽滤， 抽干后用冰水 (0-3℃ ) 淋洗滤饼， 再次抽干， 得牛磺熊 去氧胆酸 15.55KG( 纯度 99.4％， HPLC)， 其中牛磺鹅去氧胆酸的含量为 0.38％， 其他最大单 杂含量 0.09％ ( 液相色谱测定 )
实施例六高纯度的牛磺熊去氧胆酸的制备方法
a) 牛磺熊去氧胆酸粗品的制备， 按以下步骤进行 ：
在反应釜中， 加入 2.0KG 熊去氧胆酸， 加入 9.5KG 丙酮， 搅拌下加入三乙胺 825ml， 开启夹套制冷， 将混合液的温度降至 -6℃。流加氯甲酸乙酯 0.56L， 控制氯甲酸乙酯的加入 速度， 使得反应液温度维持在 0-3℃之间， 30 分钟时加完， 继续维持温度搅拌反应 20 分钟， 制得熊去氧胆酸与氯甲酸乙酯的混合酸酐， 将上述混合酸酐反应液通过过滤器用氮气压滤 至装有 2.1KG 纯化水， 0.7KG 牛磺酸， 0.2KG 氢氧化钠的 50 升反应釜中， 充分搅拌反应 3 小 时， 进一步制得牛磺熊去氧胆酸粗品 2.2KG。
b) 牛磺熊去氧胆酸粗品的精制， 按以下步骤进行 ：(1) 将 2KG 牛磺熊去氧胆酸投入 50L 反应釜中， 加入 2KG 水和 200ml 丙酮， 加热搅 拌至全部溶解 ；
(2) 搅拌下冷却至 -3-0℃， 析晶 40 小时 ；
(3) 放料至过滤器中抽滤， 抽干后用冰水 (0-3℃ ) 淋洗滤饼， 再次抽干， 得牛磺熊 去氧胆酸 1.61KG( 纯度 99.5％， HPLC)， 其中牛磺鹅去氧胆酸的含量为 0.3％， 其他最大单杂 含量 0.08％ ( 液相色谱测定 )
实施例七含高纯度牛磺熊去氧胆酸的药物组合物
每 1000 粒牛磺熊去氧胆酸药物组合物中含有 ：
实施例 2 制备的牛磺熊去氧胆酸 250g
乳糖 36g
微晶纤维素 20g
淀粉 10g
硬脂酸镁 4g
聚维酮 K30 适量
95％乙醇 适量 注： 黏合剂为 5％聚维酮 K30 的 95％乙醇
将实施例 2 制备的高纯度的牛磺熊去氧胆酸、 乳糖、 微晶纤维素、 淀粉、 硬脂酸镁 分别过 80 目筛。再将 250g 牛磺熊去氧胆酸与 36g 乳糖、 20g 微晶纤维素、 10g 淀粉混合， 混 合均匀后用含 5％ PVP 的 95％乙醇溶液制软材 ( 每 64 克约需 7ml 黏合液 )， 然后过 20 目筛 制得湿粒， 将湿粒放置于 50-60℃干燥。将湿粒干燥， 将干粒经 40 目筛整粒后加入 4g 的硬 脂酸镁混合均匀， 装入 0 号胶囊 ( 压制 )。