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增强子 Hr3 在促进 hycu-ep32 蛋白增量表达中的应用
    【技术领域】
     本发明涉及基因领域， 特别涉及家蚕的转基因技术。背景技术 转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中， 由于导入基因 的表达， 引起生物体的性状的可遗传的修饰。转基因技术是现代生物学研究中的一项重要 的技术， 在功能基因研究、 生物素材创新、 现代遗传育种等方面发挥着重要的作用。
     家蚕是具有重要经济价值的鳞翅目昆虫， 蚕丝业每年为蚕农创收 100 多亿元， 蚕 丝业为世界经济、 文化、 社会发展作出了重要贡献。 但是， 当家蚕遭遇病毒侵害， 通常会造成 蚕业的巨大损失。 据统计， 我国养蚕业最为发达的几个主产区， 每年因病毒性疾病所造成的 损失， 约占总蚕病损失的 70-80%。 其中家蚕核型多角体病毒病又是三大病毒病中最常见﹑ 危害最严重的一类蚕病 , 该病传染性极强， 难以控制。
     引起核型多角体病毒病的病原为家蚕核型多角体病毒 (Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus,BmNPV), BmNPV 属于杆状病毒科， 真杆状病毒亚科 , 核型多角体病毒 属 , 病毒粒子呈杆状， 全基因组大小为 128413bp ； 病毒结构主要由外层的囊膜和内层的核 衣壳组成， 在不同感染时期分别以出芽型病毒粒子 (budded virus,BV) 和包埋型病毒粒子 (occluded virus,OV) 两种形态存在， 而多角体是在感染细胞的核或质中产生的包含和保 护病毒粒子的一种蛋白质结晶， 很稳定。多角体病毒对不良环境﹑消毒药剂等有较强的抵 抗性， 在环境中可以长期存活， 但极易溶于碱性溶液 ； 当家蚕食下多角体病毒， 在中肠强碱 性消化液 (pH9.2 ～ 9.4) 作用下多角体被溶解， 释放的病毒粒子 OV 借囊膜与中肠上皮细胞 微绒毛膜的融合作用脱去囊膜， 核衣壳进入中肠细胞开始原发感染 (Primary infection)， 在细胞内复制核衣壳并通过 “出芽” 方式产生 BV 进入血体腔， 继而感染其他组织细胞。最 终， 蚕体多以体壁破裂， 流出病毒多角体浓汁而死。病毒多角体浓汁中含有大量的病毒粒 子， 污染蚕座环境， 使得周围健康蚕感染病毒。可见， 家蚕核型多角体病毒病是蚕业生产中 的一个重要的危害原， 一旦产生， 极易爆发。
     由于家蚕核型多角体病毒病在蚕业生产中危害重大， 蚕业界一直希望能够培育出 对此病毒具有较高抗性的蚕品种。 但是， 由于目前病毒致病分子机制研究较少， 加之抗性品 种培育手段多采用传统的遗传筛选的办法， 周期长而且定向性差， 所以收效甚微。
     转基因技术在生物素材创新、 现代遗传育种等方面发挥着重要的作用， 自 2000 年 日本科学家报道首次成功培育转基因家蚕以来， 国内外已陆续报道转基因家蚕成功的消 息。目前已经有报道外国学者尝试通过转基因干涉病毒基因的方法来提高家蚕的抗性， 他 们利用的是家蚕多化性品系的非滞育卵， 主要是因为多化性家蚕品种所产的卵为生种卵， 其不需要任何的人工处理便能够在适当的温湿度下连续发育直至孵化， 这个特点极大地方 便了转基因实验中的操作控制。但是， 通过转基因干涉利用多化性家蚕品种制备的抗病毒 品系具有以下两个方面明显的缺陷 ： ①生产用种普遍为二化性滞育种， 用多化性家蚕品种 制备的抗病毒品系不利于生产推广， 同时与滞育性的家蚕品种相比较， 多化性家蚕品种不
     具有滞育期， 对其继代维持只能依靠连续的饲养繁殖， 这样需要耗费大量的人力物力对获 得的转基因家蚕品系进行维持和继代， 同时也大大增加了获得的转基因家蚕品种资源丢失 的风险。②转基因干涉品系只能在 mRNA 水平发挥作用， 不能在病毒 DNA 复制和蛋白合成水 平发挥作用。因此， 利用家蚕滞育品种， 制备一种能在病毒 DNA 复制和蛋白合成水平抑制病 毒增殖的转基因品系是一个有效可取的方法。
     先前的研究结果显示， 当家蚕核型多角体病毒 （BmNPV） 和美国白蛾核型多角体病 毒 （HycuNPV） 共转染 BmN-4 细胞， BmNPV 在 BmN-4 细胞中的增殖将受到抑制， HycuNPV 编码 的 hycu-ep 32 基因与 BmNPV 的增殖被抑制有关。家蚕自身抗性的有限导致宿主对抗性蛋白 的大量需求。然而， 遗憾的是， 家蚕自身体内并不存在 Hycu-EP32 蛋白。BmNPV 的同源重复 区 (homologous regions， hr3) 具有复制起始位点的功能， 可以对启动子行使增强子功能。 在细胞水平， Hr3 增强子能使启动子的活性增强几倍， 而 Hr3+BmNPV 的 IE1 蛋白能使启动子 的活性增强上千倍。BmNPV 的 39kP 启动子具有明显的 BmNPV 诱导启动活性， 能使家蚕在受 到 BmNPV 侵染的时候启动下游基因的表达。
     在棉花、 玉米和水稻等物种中已经有利用转基因增量表达抗性基因来培育抗性品 种的相关报道。到目前为止， 利用滞育性家蚕品种增量表达外源抗病毒蛋白的方法和转基 因品系在国内外还未见报道。 因此， 探索利用家蚕滞育品种， 转基因增量表达外源抗病毒基 因， 抑制病毒在家蚕细胞中的增殖来提高家蚕的抗性是培育抗性品种的必然选择， 也是加 速科技成果实用化的要求。
     发明内容 本发明的目的在于提供增强子 Hr3 的新应用， 该应用为提高家蚕核型多角体病 毒抗性提供了新的思路。本发明的目的之二在于提供一种增量表达载体， 其能显著提高 hycu-ep 32 蛋白的表达量 ； 本发明的目的之三在于提供所述增量表达载体的制备方法， 该 方法操作简单， 适用于大规模运用， 其稳定性佳 ； 本发明的目的之四在于提供所述增量表达 载体的应用， 该应用降低了家蚕感染核型多角体病毒的风险。
     本发明增强子 Hr3 在促进 hycu-ep32 蛋白增量表达中的应用， 利用转基因增量表 达外源抗病毒蛋白来制备抗 BmNPV 家蚕品种的方法， 依次通过以下步骤实现 ： (1) 利用转座载体 pBac[3×P3-EGFP afm] 构建包含病毒 39kP 启动子、 hycu-ep 32 基 因全长序列和终止信号序列 SV40 片段的增量表达载体 pBac[39kP-hycu-ep 32-SV40-3×P3 -EGFP afm] (pb-EKG) 以及包含增强子 Hr3、 39kP 启动子、 hycu-ep 32 基因全长序列和终止 信号序列 SV40 片段的增量表达载体 pBac[Hr3-39kP- hycu-ep 32-SV40-3×P3-EGFP afm] (pb-HEKG) ； (2) 将家蚕 932 品种通过 15℃低温催青解除滞育， 将产下的非滞育蚕卵收集好， 在蚕卵 产后 2h-4h 用显微注射仪内将 3-4nl、 总浓度为 400ng/ul 的混合质粒 （增量表达载体和辅助 质粒按 1:1 混合） 注射进蚕卵蚕卵， 然后用无毒胶水将注射孔封住。
     (3) 将完成注射的蚕卵在 35% 的甲醛蒸汽中消毒 4min 后 , 置于 25℃、 相对湿度为 80% 的环境中进行催青直到孵化， 将孵化的蚁蚕置于标准条件中饲养， 将当代 （G0） 的蚕蛾 进行自交或者回交， 将滞育性的 G1 代蚕卵即时浸酸解除滞育， 胚胎发育第六天在荧光显微
     镜下面筛选转基因阳性个体， 将获得的转基因个体单蛾区正常饲养， 继代扩大群体数量。
     (4) 通过 RT-PCR 检测转基因系统中 hycu-ep 32 的表达量， 确定 hycu-ep 32 确实在 所获得的转基因系统中表达。
     (5) 将转基因系统 EKG、 HEKG 和正常 932 在 3 龄起蚕， 用半致死剂量的 BmNPV 病毒 通过经口感染， 设置不添食的转基因和正常 932 对照， 连续 10 天统计死亡率。结果显示转 基因系统 HEKG 对 BmNPV 病毒的抗性明显提高。
     (6) 通过荧光定量 PCR 检测 hycu-ep 32 在攻毒后的表达量变化情况， 确定在 HEKG 系统中， hycu-ep 32 的表达量在攻毒后大大增加。
     (7) 在攻毒后 24h， EKG、 HEKG 和正常 932 各取 10 头蚕提取总 DNA， 通过荧光定量 PCR 检测 BmNPV 病毒的拷贝数， 证明 HEKG 中的病毒含量确实远低于正常 932。
     (8) 调查 EKG、 HEKG 和正常 932 的经济性状， 各系统雌雄各随机抽取 15 颗茧， 分别 称取每颗茧的全茧量和茧壳量， 计算茧层率， 确定转基因系统的经济性状没有受到影响。
     本发明的技术方案为 ： 增强子 Hr3 在提高 hycu-ep32 蛋白表达量中的应用， 所述增强子 Hr3 的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。
     优选的， 增强子 Hr3 在介导 39kP 启动子提高 hycu-ep32 蛋白表达量中的应 用， 所述 39kP 启动子的核苷酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。
     增量表达载体， 所述增量表达载体以转座载体 pBac[3×P3-EGFP afm] 为基础载 体， 依次连接有增强子 Hr3、 39kP 启动子、 hycu-ep 32 基因和终止信号序列。
     优选的， 所述hycu-ep 32 基因为hycu-ep 32 基因全长序列， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO:3 所示。
     优选的， 所述终止信号序列为 SV40， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO:4 所示。
     所述的增量表达载体的制备方法， 具体包括以下步骤 ： A） 39kP-1180 载体的构建 将如 SEQ ID NO:2 所示的 39kP 启动子用 Sal Ⅰ 和 BamH Ⅰ 进行双酶切， 得 39kP 启动 子酶切片段， 同时用 Sal Ⅰ 和 BamH Ⅰ 酶切 pSLfa1180fa 载体， 得 pSLfa1180fa 载体酶切片 段， 连接 39kP 酶切片段和 pSLfa1180fa 载体酶切片段， 得 39kP-1180 载体 ； B ） 39kP-hycu-ep 32-1180 载体的构建 将 核 苷 酸 序 列 如 SEQ ID NO:3 所 示 的 hycu-ep 32 基 因 分 别 用 BamH Ⅰ 和 Not Ⅰ 进行双酶切， 得 hycu-ep 32 酶切片段， 同时用 BamH Ⅰ 和 Not Ⅰ 酶切 39kP-1180 载体， 得 pSLfa1180fa-39kP 载体酶切片段， 连接hycu-ep 32 酶切片段和 pSLfa1180fa-39kP 载体酶切 片段， 得 39kP-hycu-ep 32-1180 载体 ； C ) 39kP-hycu-ep 32-SV40-1180 载体的构建 Not Ⅰ 和 Hind Ⅲ 双酶切含有如 SEQ ID NO:4 所示的终止信号的 1180 载体， 得到终止 信号酶切片段， 同时用 Not Ⅰ 和 Hind Ⅲ 双酶切步骤 B 所得 39kP-hycu-ep 32-1180 载体， 得 到 39kP-hycu-ep 32-1180 酶切片段， 将终止信号酶切片段和 39kP-hycu-ep 32-1180 酶切片 段进行连接， 得 39kP-hycu-ep 32-SV40-1180 ； D) Hr3-39kP-hycu-ep 32-SV40-1180 将 如 SEQ ID NO:1 所 示 增 强 子 Hr3 用 Nco Ⅰ 进 行 单 酶 切， 得 增 强 子 Hr3 酶切 片 段，同 时 将 步 骤 C 所 得 的 39kP-hycu-ep 32-SV40-1180 用 Nco Ⅰ 进 行 单 酶 切，得 39kP-hycu-ep 32-SV40-1180 酶 切 片 段，将 所 述 增 强 子 Hr3 酶 切 片 段 和 39kP-hycu-ep 32-SV40-1180 酶切片段进行连接， 得 Hr3-39kP-hycu-ep 32-SV40-1180 ； E) pBac[Hr3-39kP-hycu-ep 32-SV40-3×P3-EGFP afm] 的构建 用 限 制 性 内 切 酶 Asc Ⅰ 酶 切 步 骤 D 所 得 Hr3-39kP-hycu-ep 32-SV40-1180 载 体， 得 Hr3-39kP-hycu-ep 32-SV40 片 段 ； 同 时 用 内 切 酶 Asc Ⅰ 单 酶 切 piggyBac[3×p3 EGFP afm]， 得 piggyBac[3×p3 EGFP afm] 线 性 片 段， 将 Hr3-39kP-hycu-ep 32-SV40 片 段 和 piggyBac[3×p3 EGFP afm] 连接， 得增量表达载体， 命名为 pBac[Hr3-39kP-hycu-ep 32-SV4 0-3×P3-EGFP afm]。
     优选的， 步骤 A) 中， 如 SEQ ID NO:2 所示的 39kP 启动子的获得方式如下 ： 设计特 异引物， 39kP 的上游引物为 : 5'acgcgtcgaccttgacccgaagcgaaat3', 39kP 的下游引物为 ： R:5' cgcggatcctgttgctccggcatgttt 3' ； 以 BmNPV 基因组为模板进行 PCR 扩增， PCR 反应 条件为 ： 94℃预变性 4 分钟， 然后 94℃变性 40 秒、 55℃退火 40 秒、 72℃延伸 20 秒， 共 30 个 循环， 最后 72℃延伸 10 分钟。
     优 选 的， 步 骤 B) 中， 如 SEQ ID NO:3 所 示 的 hycu-ep 32 的 获 得 方 式 如 下 ：hycu-ep 32 基因序列设计特异引物， 上游引物为 ： 5' cgggatccatgaagaaccaacaacag 3'，下游引物为 ： 5' atagtttagcggccgcttaatttattaacatatcaaag 3' ； 以 HycuNPV 基因组 为模板进行 PCR 扩增， PCR 反应条件为 ： 94℃预变性 4 分钟， 然后 94℃变性 40 秒、 44℃退火 40 秒、 72℃延伸 50 秒， 共 30 个循环， 最后 72℃延伸 10 分钟。
     所述的增量表达载体在制备家蚕核型多角体病毒抗性增效剂中的应用。
     本发明增强子 Hr3 在促进 hycu-ep32 蛋白增量表达中的应用， 利用转基因增量表 达外源抗病毒蛋白提高家蚕对 BmNPV 抗性的方法， 首次通过在滞育家蚕品种中转基因增量 表达外源抗性蛋白来显著提高家蚕的抗性。 与其他方法相比， 本发明具有以下优势 ： ①使家 蚕在发育的各个时期均能表达 Hycu- EP32 蛋白， 克服正常家蚕不表达 Hycu- EP32 的缺陷， 有 利于家蚕在各个时期都能利用 Hycu- EP32 蛋白来抑制病毒的增殖 ； ②巧妙的利用诱导型启 动子 39kP 和增强子 Hr3 的组合， 使转基因家蚕在正常情况下基本不表达 Hycu- EP32 蛋白， 当 BmNPV 侵染家蚕的时候才表达该蛋白， 而且利用病毒增殖产生的 IE1 蛋白激活 Hr3 增强 子来大量表达该蛋白， 使该蛋白的表达量随着病毒量的增加而增加， 所以能最大程度减少 表达外源蛋白对家蚕正常生理活动和经济性状的影响， 同时还能显著提高家蚕的抗性 ； ③ 滞育性转基因系统不需要连续饲养， 保存和管理方便， 而且品种资源丢失的风险低 ； ④和传 统育种手段相比， 本发明通过转基因制备抗性品种不但效果好而且周期短。 附图说明 图 1 为增量表达 hycu-ep 32 的转基因载体 pb-EKG、 pb-HEKG 的结构示意图。
     图 2 为 RT-PCR 检测 hycu-ep 32 在 EKG、 HEKG-A、 HEKG-B 和正常 932 中的表达量的 琼脂糖凝胶电泳图 ;ep32 代表 hycu-ep 32， sw22934 代表内参基因 ； PCR 检测同一个模板， ep32 扩增 28 个循环， sw22934 扩增 25 个循环。
     图 3 为 EKG、 HEKG-A、 HEKG-B、 正常 932 品种和不攻毒对照的死亡率统计结果 ; 各 5 系统在 3 龄起蚕以半致死剂量 （3×10 多角体 / 头） 单头经口添食 BmNPV 病毒。
     图 4 为 EKG、 HEKG-B 和正常 932 品种添食病毒后 0h 和 48h，hycu-ep 32 在各系统 中表达量的定量 PCR 检测结果。
     图 5 为攻毒后 48h， EKG、 HEKG-B 和正常 932 各系统体内 BmNPV 病毒含量的定量 PCR 检测结果。
     图 6 为 EKG、 HEKG-A、 HEKG-B 和正常 932 各系统雌雄全茧量统计结果。
     图 7 为 EKG、 HEKG-A、 HEKG-B 和正常 932 各系统雌雄茧层率统计结果。 具体实施方式
     就分子生物学领域中， 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。应理解， 这些实 施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中为注明具体条件的实验 方法， 通常按照常规条件如 Sambrook 等人， 分子克隆 ： 实验室指南 （New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989） 中所述的条件， 或按照制造商所建议的条件。 除非另外说 明， 否则百分比和份数按重量计算。
     本发明通过构建病毒 39kP 诱导型启动子以及 39kP 启动子 +Hr3 增强子分别介导 hycu-ep 32 基因的增量表达载体 ； 结合蚕卵低温催青解除滞育方法， 利用家蚕胚胎显微注 射技术， 制备了 3 个家蚕实用品种转基因系统 ； 通过 RT-PCR 检测证明外源 hycu-ep 32 基因 在 3 个转基因系统中成功表达， 而正常家蚕品种中没有该基因 ； 通过经口添食病毒的抗性 检测方法， 结果发现和正常 932 系统相比， EKG 系统 （使用 39kP 启动子） 没有降低死亡率， 而 HEKG 系统 （使用 39kP 启动子 +Hr3 增强子） 则降低了 30% 左右的死亡率， 抗性效果明显 ； 通 过定量定 PCR 检测发现， 在正常情况下， hycu-ep 32 基因在 HEKG 系统中的表达量是 EKG 系统 中的 11.9， 在攻毒后 48h， hycu-ep 32 在 HEKG 系统中的表达为 EKG 系统中的 48.5 倍， HEKG 系统中 hycu-ep 32 的表达量能够随着病毒的增殖而增加， 而 EKG 系统中 hycu-ep 32 的表达 量基本不受病毒的诱导 ； 通过定量定量 PCR 检测发现， 在食下病毒量一致的情况下， 在攻毒 后 48h， BmNPV 病毒的拷贝数在 EKG 和正常 932 中没有明显区别， 而在 HEKG-B 中的含量仅为 正常 932 中的 30% 左右 ； 经济性状调查结果显示， EKG、 HEKG 和正常 932 各个系统的全茧量 没有区别， 茧层率也没有区别， 说明表达外源 hycu-ep 32 基因没有影响家蚕的经济性状。本 发明通过使用 39kP 启动子 +Hr3 增强子， 成功表达外源 hycu-ep 32， 并且使 hycu-ep 32 的表 达量随着病毒含量的增加而增加， 在显著提高家蚕抗性的同时没有影响其经济性状。
     实施例 1 ： 构 建 转 基 因 增 量 表 达 载 体 pBac[39kP-hycu-ep 32-SV40-3×P3-EGFP afm] 和 pBac[Hr3-39kP-hycu-ep 32-SV40-3×P3-EGFP afm] (1) 根 据 已 经 报 道 的 BmNPV 39kP 启 动 子 序 列 （如 SEQ ID NO:2 所 示）设 计 特 异 引 物，引 物 序 列 如 下 ： 39kP F: 5'acgcgtcgaccttgacccgaagcgaaat3', 39kP R:5' cgcggatcctgttgctccggcatgttt 3'， 设计的引物委托生工生物工程 （上海） 有限公司进行合 成。 以 BmNPV 基因组为模板， 以设计的 39kP F 和 39kP R 为上下游引物进行 PCR 扩增， PCR 反 应条件为 ： 94℃预变性 4 分钟， 然后 94℃变性 40 秒、 55℃退火 40 秒、 72℃延伸 20 秒， 共 30 个 循环， 最后 72℃延伸 10 分钟 ； PCR 产物 （如 SEQ ID NO:2 所示） 用 Sal Ⅰ 和 BamH Ⅰ 进行双酶 切， 经琼脂糖电泳鉴定并回收， 得 39kP 酶切片段， 同时用 Sal Ⅰ 和 BamH Ⅰ 酶切 pSLfa1180fa 载体， 琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收， 得 pSLfa1180fa 载体酶切片段， 连接 39kP 酶切片段和 pSLfa1180fa 载体酶切片段， 连接反应在 T4 DNA 连接酶作用下， 16℃过夜连接， 连接产物转化大肠杆菌 DH5a， 在含有氨苄青霉素的 LB 平板筛选阳性克隆， 提取质粒， 酶切鉴定片段大 小， 得含有 39kP 的 pSLfa1180fa 载体 （简称 39kP-1180） 。
     (2) 根据 hycu-ep 32 基因序列设计特异引物， 引物序列如下 ： hycu-ep 32 F: 5' cgggatccatgaagaaccaacaacag 3'， hycu-ep 32 R: 5' atagtttagcggccgcttaatttattaac atatcaaag 3'， 设计的引物委托生工生物工程 （上海） 有限公司进行合成。以 HycuNPV 基 因组为模板， 以设计的 hycu-ep 32 F、 hycu-ep 32R 为上下游引物进行 PCR 扩增， PCR 反应条 件为 ： 94 ℃预变性 4 分钟， 然后 94 ℃变性 40 秒、 44 ℃退火 40 秒、 72 ℃延伸 50 秒， 共 30 个 循环， 最后 72℃延伸 10 分钟 ； PCR 产物 （如 SEQ ID NO:3 所示） 分别用 BamH Ⅰ 和 Not Ⅰ 进 行双酶切， 经琼脂糖电泳鉴定并回收， 得 hycu-ep 32 酶切片段， 同时用 BamH Ⅰ 和 Not Ⅰ 酶 切 39kP-1180 载体， 琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收， 得 pSLfa1180fa-39kP 载体酶切片段， 连 接 hycu-ep 32 酶切片段和 pSLfa1180fa-39kP 载体酶切片段， 转化后筛选阳性克隆， 得含有 hycu-ep 32 基因和 39kP 启动子的 pSLfa1180fa 载体 （简称 39kP-hycu-ep 32-1180） 。
     (3) 用 Not Ⅰ 和 Hind Ⅲ 双酶切已经含有 SV40 终止信号 （如 SEQ ID NO:4 所示） 的 1180 载体得到 SV40 酶切片段， 同时用 Not Ⅰ 和 Hind Ⅲ 双酶切 39kP-hycu-ep 32-1180 载体 得到 39kP-hycu-ep 32-1180 酶切片段， 将 SV40 酶切片段和 39kP-hycu-ep 32-1180 酶切片 段进行连接转化， 筛选阳性克隆得到含有 39kP 启动子、 hycu-ep 32 基因和 SV40 终止信号的 pSLfa1180fa 载体 （简称 39kP-hycu-ep 32-SV40-1180） 。
     (4) 将 增 强 子 Hr3 序 列 （如 SEQ ID NO:1 所 示）用 Nco Ⅰ 进 行 单 酶 切， 回收得 到 Hr3 酶 切 片 段， 同 时 将 39kP-hycu-ep 32-SV40-1180 用 Nco Ⅰ 进 行 单 酶 切 回 收 得 到 39kP-hycu-ep 32-SV40-1180 酶切片段， 将 Hr3 酶切片段和 39kP-hycu-ep 32-SV40-1180 酶切 片段进行连接转化， 筛选阳性克隆， 得到 Hr3 增强子、 39kP 启动子、 hycu-ep 32 基因和 SV40 终止信号的 pSLfa1180fa 载体 （简称 Hr3-39kP-hycu-ep 32-SV40-1180） 。
     (5) 用 限 制 性 内 切 酶 Asc Ⅰ 分 别 酶 切 39kP-hycu-ep 32-SV40-1180 和 Hr3-39kP-hycu-ep 32-SV40-1180 载 体，琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 鉴 定 并 回 收，得 39kP-hycu-ep 32-SV40 和 Hr3-39kP-hycu-ep 32-SV40 片 段 ； 同 时 用 内 切 酶 Asc Ⅰ 单 酶 切 piggyBac[3×p3 EGFP afm]， 的 piggyBac[3×p3 EGFP afm] 线 性 片 段， 然后对获得 piggyBac[3×p3 EGFP afm] 线 性 片 段 5’端 去 磷 酸 化， 连 接 39kP-hycu-ep 32-SV40 和 piggyBac[3×p3 EGFP afm]， 转化后筛选阳性克隆， 得到重组载体 pBac[39kP-hycu-ep 32SV40-3×P3-EGFP afm] (pb-EKG) ； 将 Hr3-39kP-hycu-ep 32-SV40 片段和 piggyBac[3×p3 EGFP afm] 连接转化， 筛选阳性克隆， 得到重组载体 pBac[Hr3-39kP-hycu-ep 32-SV40-3×P3 -EGFP afm] (pb-HEKG) ， 如图 1 所示。
     实施例 2 ： 转基因显微注射和阳性个体的筛选 （1） 将家蚕 932 品种蚕卵浸酸 （所用盐酸比重为 1.073， 温度为 46℃， 时间为 5 分钟） 解 除滞育以后， 放于 15℃和 80% 湿度的黑暗环境中催青 30 天左右直至孵化， 将蚁蚕收好置于 标准环境中饲养 （温度 ： 25℃， 湿度 ： 80%） ， 化蛾以后将雌雄蚕蛾交配 4 小时， 拆对后产下的 蚕卵为非滞育蚕卵， 用于下一步的显微注射 ； （2） 将产下的蚕卵在干净的载玻片上排列整齐， 在蚕卵产后 2 小时用 Eppendorf 显微注 射仪将 pb-EKG 重组载体和辅助质粒 A3H， 一起注射进 91 粒 932 蚕卵中， 用无毒胶水封口以 后置于 25℃、 相对湿度 80% 的环境中催青 10 天左右孵化， 将孵化的 25 头 G0 代蚁蚕用桑叶收集饲养至化蛾， G0 代蚕蛾通过自交或回交共获得 6 蛾圈 G1 代蚕卵， 用 Olympus® 电动宏观荧 光显微镜观察 G1 胚胎筛选并获得 1 个阳性蛾圈， 即 1 个 39kP 启动子介导的外源 Hycu- EP32 蛋白表达的转基因家蚕， 简称 EKG 转基因系统， 转化效率为 16.67% ； 将含有 pb-HEKG 重组载 体和辅助质粒 A3H， 一起注射进 183 粒 932 蚕卵中， 共孵化 47 头 G0 代蚁蚕， 获得 13 蛾圈 G1 代蚕卵， 筛选得到 8 个阳性蛾圈， 即 8 个 Hr3+39kP 启动子介导的外源 Hycu- EP32 蛋白表达 的转基因家蚕， 简称 HEKG 转基因系统， 转化效率为 61.54%。
     （3）将获得的一个 EKG 阳性蛾圈和随机选择的两个 HEKG 阳性蛾圈 （HEKG-A 和 HEKG-B） 各自单蛾圈饲养， 继代扩大。
     实施例 3 ： RT-PCR 检测 hycu-ep 32 在 EKG、 HEKG 和正常 932 中的表达量 （1） 将实施例 2 制备的 EKG、 HEKG-A、 HEKG-B 和正常 932 进行正常饲养， 在 3 龄起蚕、 3 龄眠蚕、 4 龄起蚕和 4 龄眠蚕各取 5 头幼虫提取总 RNA （Total RNA (Mini) Kit ， Watson） ， 用 DNA 酶消化处理后各自取 4μg 的 RNA 反转录成 25μl 的 cDNA， 最后各自稀释到 100μl 用于下步检测。
     （2）利 用 家 蚕 内 参 基 因 特 异 引 物 sw22934 F ： 5' ttcgtactggctcttctcgt 3'， sw22934 R ： 5' caaagttgatagcaattccct 3'， 取上述的 16 个 cDNA 模板各 1μl 进行 RT-PCR 检测， PCR 反应条件为 ： 94℃预变性 4 分钟， 然后 94℃变性 40 秒、 58℃退火 40 秒、 72℃延伸 10 秒， 共 25 个循环， 最后 72℃延伸 10 分钟。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测， 如图 2 所示， 发现各个模板都扩增出目的条带， 而且条带大小粗细程度比较均一， 说明这 16 个 cDNA 模板 是可用的。
     （3） 利用hycu-ep 32 的特异检测引物 ep32 QRT F: 5' acatcagaatacccatcacg 3'， ep32 QRT R: 5' attgttcaatggtaactccc 3'， 取上述的 16 个 cDNA 模板各 1μl 进行 RT-PCR 检测， PCR 反应条件为 ： 94℃预变性 4 分钟， 然后 94℃变性 40 秒、 58℃退火 40 秒、 72℃延伸 10 秒， 共 28 个循环， 最后 72℃延伸 10 分钟。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测， 发现除了正 常 932 的 4 个模板， 在 EKG、 HEKG-A 和 HEKG-B 的所有模板中都扩增出目的条带， 如图 2 所 示。这个结果证明正常家蚕体内确实不含有 hycu-ep 32 基因， 而 hycu-ep 32 基因成功在我 们所制备的转基因系统中表达。
     实施例 4 ： 转基因系统的抗性检测 (1) 取转基因系统 EKG、 HEKG-A、 HEKG-B 和正常 932 品种， 在 3 龄起蚕时期以半致死剂 5 量 （3×10 多角体 / 头） 单头经口添食 BmNPV 病毒， 4 个系统各设置 3 个重复区， 每个重复区 100 头蚕， 同时每个系统设置 3 个不攻毒对照区， 连续 10 天统计死亡率 ； (2) 抗 性 检 测 结 果 如 图 3 所 示， EKG、 HEKG-A、 HEKG-B 和 正 常 932 的 死 亡 率 分 别 为 55.47%、 24.29%、 24.50%、 50.50%。转基因系统 EKG 的死亡率和正常 932 系统没有明显区别 ； 转基因系统 HEKG-A 和 HEKG-B 的死亡率明显低于正常 932 系统， 能降低 26% 左右的死亡率。
     (3) 根据抗性检测结果， 我们发现增量表达外源 Hycu- EP32 蛋白确实能提高家蚕 对 BmNPV 病毒的抗性， 而且 Hr3+39kP 的启动子效率明显优于 39kP 的启动子效率。
     实施例 5 ： 定量 PCR 检测 hycu-ep 32 在攻毒后的的表达量变化情况 （1） 在 3 龄起蚕 （设为攻毒 0h） 和攻毒后 48h， EKG、 HEKG-B 和正常 932 每个系统各取 10 头蚕， 提取总 RNA 然后反转录成 cDNA。 以hycu-ep 32 基因的特异引物 ep32 QRT 进行定量 PCR 检测 （试剂盒为 SYBR Premix Ex Taq Kit， TaKaRa ； 定量 PCR 检测仪器为 ABI StepOnePlusTMReal-Time PCR System， Applied Biosystems ； 按照试剂盒和仪器使用说明书进行操作） ； 以 家蚕看家基因 BGIBMGA003186-TA 作为内参， 检测引物为 sw22934。
     （2）根据定量 PCR 的结果如图 4 所示， 我们发现在正常情况下， hycu-ep 32 在 HEKG-B 中的表达量是 EKG 中的 11.9 倍 ； 在攻毒后 48h， hycu-ep 32 在 EKG 中的表达量为攻毒 前的 1.3 倍， hycu-ep 32 在 HEKG-B 中的表达量为攻毒前的 5.4 倍 ； 在攻毒后 48h， hycu-ep 32 在 HEKG-B 中的表达量为 EKG 中的 48.5 倍。
     （3） 从以上的定量 PCR 结果， 我们可以看出， 39kP 启动子被病毒诱导表达的能力很 弱 （1.3 倍） ， 导致 EKG 不能增强家蚕的抗性， 这说明 39kP 启动子单独作为一个启动子使用 基本不具备应用价值 ； 但是， 如果把 Hr3 增强子和 39kP 启动子联合一起使用 (Hr3+39kP)， 则可以明显提高启动子的活性， 在正常情况下可以比较明显的提高启动子活性 （增强 11.9 倍） ， 更重要的是， Hr3+39kP 在攻毒后的活性大大增加， 达到了 39kP 的 48.5 倍。这些结果 说明由于使用 Hr3+39kP 启动子， 我们的 HEKG 系统在正常情况下可以表达适量的ep 32， 在攻 毒后则随着病毒量的增加而增加 ep 32 的表达量， 这使 HEKG 系统的经济性状没有受到影响， 同时还大大提高了抗性。
     实施例 6 ： 定量 PCR 检测攻毒后各系统中 BmNPV 病毒的含量 （1） 在攻毒后 48h， EKG、 HEKG-B 和正常 932 每个系统各取 10 头蚕提取总 DNA。每个 DNA 模板各取 20 ng， 以 BmNPV 病毒 gp41 基因的特异引物进行定量 PCR 检测， 引物为 GP41 F: 5‘cgtagtagtagtaatcgccgc3’ , GP41 R: 5‘agtcgagtcgcgtcgcttt3’ ， （试剂盒为 SYBR TM Premix Ex Taq Kit， TaKaRa ； 定量 PCR 检测仪器为 ABI StepOnePlus Real-Time PCR System， Applied Biosystems ； 按照试剂盒和仪器使用说明书进行操作） ； 以家蚕看家基因 BmGAPDH 为内参， 引物为 BmGAPDH F: 5‘ gctgcctccttgaccttttgc3 ’ , BmGAPDH R: 5‘ cattccgcgtccctgttgctaat 3’ 。
     （2） 定量 PCR 的结果如图 5 所示， 正常 932 体内的病毒含量被设置为 100%， EKG 和 HEKG-B 体内的病毒含量分别为 110.89% 和 28.39%。从该图我们可以发现， 在食下病毒量一 致的情况下， 在攻毒后 48h， BmNPV 病毒的拷贝数在 EKG 和正常 932 中没有明显区别， 而在 HEKG-B 中的含量则远远低于正常 932 中的含量。
     （3） BmNPV 病毒拷贝数的检测结果说明， HEKG-B 系统明显抑制了 BmNPV 病毒在其 体内的复制增殖， 这也解释了为什么 HEKG-B 的死亡率明显降低 ； EKG 不能抑制病毒在其体 内的增殖， 所以不能降低死亡率。
     实施例 7 ： 调查转基因系统的经济性状 （1） EKG、 HEKG-A、 HEKG-B 和正常 932 各系统雌雄各自随机抽取 15 颗茧， 分别称取每颗 茧的全茧量和茧壳量。
     （2） 统计的全茧量结果如图 6 所示 ： EKG、 HEKG-A、 HEKG-B 和正常 932 的全茧量分 别为 1.007g、 1.361g、 1.353、 1.197( 雄 )， 和 1.279g、 1.749g、 1.638g、 1.497g( 雌 )。结果显 示转基因系统和正常 932 之间没有明显区别 （3） 计算出的茧层率结果如图 7 所示 ： EKG、 HEKG-A、 HEKG-B 和正常 932 的茧层率分别 为 22.21%、 23.94%、 24.49%、 23.18% ( 雄 )， 和 19.50%、 19.75%、 21.20%、 20.36%( 雌 )。结果 也显示转基因系统和正常 932 之间没有明显区别。
     （4） 以上调查结果显示转基因增量表达 hycu-ep 32 不会影响家蚕的经济性状。最后说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管通过参 照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述， 但本领域的普通技术人员应当理解， 可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变， 而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。12CN 102492691 A序列表1/5 页<110> <120> <160> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>西南大学 增强子 Hr3 在促进 hycu-ep32 蛋白增量表达中的应用 6 1 959 DNA 家蚕 （Bombyx Batryticatus） 增强子 Hr3 1 agaagccgtg atacaatcgt cgataacaac acaagaagat tcatacttaa aacaaattag atgacatcat tttgaaaaac agccggttca ttctactcgc caaatgacat ggttttgaaa tcttttgatt caaatgacat gttttaaaaa atacgtcgtt cccagtcacg tggttgcacg gaatttaaat tccattgtat tcgtgcgtta tcattattaa ctcttgatta aaatgacatc gttttgaaaa aaagcaagtt catctcttga aacaaatgac gtgttttaca catctcttga acaaatgaca ttgtatttgt tgtacgccaa ctaaaaatga gtaacgtaga aaacatttta caagtagaat acatgttaac tgttttacac atctcttgat acaaatgaca tagttttgaa ttgtgtttta atcatttctt cgtagaattc ttatgtttta tcatcttaga cattgcctct cctgaacacg ccaatacatg atcggataaa tgtcgaaaac tctactcgta aatcgtgtat gtagaattct tatgttttac tcatctcttg aaacaaatga cacgtagaat 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