一种治疗急性痛风性关节炎的药物及制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种中药复方制剂， 尤其是涉及一种治疗急性痛风性关节炎的药物。 本发明还涉及制备上述药物的方法。背景技术 痛风 (GOUT) 是一种与遗传有关的长期嘌呤代谢障碍或尿酸排泄障碍， 导致血尿 酸持续增高和尿酸盐结晶沉积， 引起组织损伤的一组临床综合征。痛风病临床特点是高尿 酸血症， 以及由此引起的痛风性急性关节炎反复发作、 痛风石沉积、 痛风石慢性关节炎和关 节畸形， 常累及肾脏引起慢性间质性肾炎和尿酸肾结石形成。 随着人们生活方式的改变， 痛 风患病率有明显上升趋势， 痛风在我国发病率不断上升， 南方和沿海经济发达地区发病率 尤高， 因此越来越受到医学界的重视。 痛风不仅能引起关节肿胀， 而且可诱发和加重脂代谢 紊乱、 糖尿病及心血管疾病等， 增加心脑血管疾病、 代谢综合征及肾脏疾病病人的病死率。 因此， 痛风已成为严重威胁人类健康的常见病、 多发病。
目前， 秋水仙碱是临床常用治疗痛风的药物， 但其严重的副作用 ( 如恶心、 呕吐、 水样腹泻、 肝细胞损伤、 骨髓抑制、 脱发和肾衰竭等 ) 使临床应用受到一定限制。非甾体抗 炎药、 肾上腺糖皮质激素及别嘌呤醇等的副反应也较为明显， 如可引起发热、 过敏性皮疹、 腹痛、 腹泻、 白细胞及血小板减少， 甚而肝肾功能损害等。而对高尿酸血症和痛风采取中西 医结合治疗可使我国传统医学和西方先进医疗技术互为补充， 达到标本兼治的目的越来越 受到人们的重视。目前中药治疗痛风主要分为内服和外敷， 内服药物大多以虎杖、 牛膝、 防 风、 土茯苓、 苍术、 羌活等为主要通过祛风除湿治疗痛风 ； 外敷药物大多以黄柏、 生大黄、 生 半夏、 乳香、 没药等为主组方通过清热解毒、 活血化瘀达到治疗痛风的目的。但大多研究集 中在抗炎、 镇痛、 对急性痛风动物模型的治疗作用等方面， 深入的分子学和机制研究较少。 故急需疗效确切、 作用机制明确、 安全性高的药物应用于临床。
发明内容 本发明的目的在于提供一种治疗急性痛风性关节炎的药物。
本发明的又一目的在于提供制备上述药物的方法。
为实现上述目的， 本发明提供的治疗急性痛风性关节炎的药物， 由下述重量配比 的原料制成的药剂 ：
穿 山 龙 13-17， 虎 杖 13-17， 忍 冬 藤 27-33， 防 风 13-17， 威 灵 仙 13-17， 土茯苓 13-17， 川牛膝 13-17， 川芎 13-17， 甘草 4-7。
所述治疗急性痛风性关节炎的药物， 其中优选各原料的重量配比是 ：
穿山龙 15， 虎杖 15， 忍冬藤 30， 防风 15， 威灵仙 15， 土茯苓 15， 川牛膝 15， 川芎 15， 甘草 6。
所述治疗急性痛风性关节炎的药物， 其中， 所述的药剂为液体。
本发明提供的制备上述治疗急性痛风性关节炎的药物的制备方法， 是将穿山龙、
虎杖、 忍冬藤、 防风、 威灵仙、 土茯苓、 川牛膝、 川芎和甘草加水煎煮两次， 合并煎液、 过滤， 取 滤液得到治疗急性痛风性关节炎的药物。
所述治疗急性痛风性关节炎的药物的制备方法， 其中， 第一次煎煮 1.5-2.5 小时， 第二次煎煮 0.5-1.5 小时。
所述治疗急性痛风性关节炎的药物的制备方法， 其中， 过滤后的滤液进行浓缩得 到治疗急性痛风性关节炎的药物。
本发明提供的药物具有祛风除湿、 活血化瘀、 通络止痛的作用， 可用于治疗急性痛 风性关节炎。
本发明除治疗急性痛风性关节炎的同时还可以改善血管内皮细胞功能、 减轻胰岛 素抵抗、 调节脂代谢和降低血尿酸。 附图说明
图 1 是本发明的药物对尿酸盐刺激血管内皮细胞 IL-1β 的影响。 图 2 是本发明的药物对尿酸盐刺激血管内皮细胞 TNF-α 影响。 图 3 是倒置显微镜下 3T3-L1 前体脂肪细胞。图 4 是倒置星显徽镜下 3T3-L1 前体脂肪细胞完全汇合。
图 5 是 3T3-L1 前体脂肪细胞未分化。
图 6 是 3T3-L1 前体脂肪细胞分化第 6 天。
图 7 是成熟脂肪细胞。
图 8 是 TFC 油红 O 染色后成熟脂肪细胞。
图 9 是穿山龙、 罗格列酮及胰岛素对成熟脂肪细胞糖摄取的影响。
图 10 是穿山龙对成熟脂肪细胞 NF-κB 表达的影响，
图 11 是 MSG 造模后 12w 龄大鼠图片 ： 右为 MSG 组大鼠 ； 左为正常组大鼠。
图 12 是 MSG 造模后 12w 龄大鼠图片 ： 前为 MSG 组大鼠 ； 后为正常组大鼠。
图 13 是肉眼观察灌胃治疗后各实验组大鼠肾周脂肪组织 ： (a) 为正常对照组 ： (b) 为穿山龙总皂苷组 ； (c) 为文迪雅组， (d) 为模型对照组。
图 14 是肝脏组织 IIE 染色 ： (a) 为模型对照组 ： (b) 为穿山龙总皂苷组 ； (c) 为文 迪雅组， (d) 为正常组。
图 15 是 Wista 大鼠痛风性关节炎造模前同一天上下午踝关节周径。
图 16 是本发明的药物对痛风性关节炎大鼠灌胃第 3 天体质量增加的影响。
图 17 是本发明的药物对痛风性关节炎大鼠造模前后体质量增加的影响。
图 18 是本发明的药物对痛风性关节炎大鼠造模后不同时间点关节肿胀度的影 响。
图 19 是各组灌胃 72h 后对痛风性关节炎大鼠血浆白细胞计数的影响。
图 20 是各组灌胃 72h 后对痛风性关节炎大鼠血清中 IL-1β 水平。
图 21 是对照组急性痛风性关节炎大鼠滑膜组织病理学切片。
图 22 是模型组急性痛风性关节炎大鼠滑膜组织病理学切片。
图 23 是本发明的药物高浓度组对急性痛风性关节炎大鼠滑膜组织病理学切片。
图 24 是本发明的药物中浓度组对急性痛风性关节炎大鼠滑膜组织病理学切片。图 25 是本发明的药物低浓度组对急性痛风性关节炎大鼠滑膜组织病理学切片。 图 26 是本发明的药物低浓度组对急性痛风性关节炎大鼠滑膜组织病理学切片。 图 27 是本发明的药物中浓度组对急性痛风性关节炎大鼠滑膜组织病理学切片。 图 28 是本发明的药物高浓度组对急性痛风性关节炎大鼠滑膜组织病理学切片。 图 29 是西药组对急性痛风性关节炎大鼠滑膜组织病理学切片。 图 30 是本发明的药物指纹图谱 3D 扫描图。 图 31 是本发明的药物色谱图。 图 32 是本发明的药物原始积分图。具体实施方式
本发明的技术方案是基于我国中医学对急性痛风性关节炎发病机理的认识及治 疗原则， 筛选出具有祛风除湿、 活血化瘀、 通络止痛作用的食用植物药， 使其改善血管内皮 细胞功能、 减轻胰岛素抵抗、 调节脂代谢和降低血尿酸。
本发明的药物是由下列组分制成的 ( 用量是重量份 ) ：
穿 山 龙 13-17， 虎 杖 13-17， 忍 冬 藤 27-33， 防 风 13-17， 威 灵 仙 13-17， 土茯苓 13-17， 川牛膝 13-17， 川芎 13-17， 甘草 4-7。
本发明优选的重量配比是 ：
穿山龙 15， 虎杖 15， 忍冬藤 30， 防风 15， 威灵仙 15， 土茯苓 15， 川牛膝 15， 川芎 15， 甘草 6。
将上述各组分制成本发明药物的方法是 ：
将穿山龙、 虎杖、 忍冬藤、 防风、 威灵仙、 土茯苓、 川牛膝、 川芎和甘草按以上重量比 加水煎煮两次， 合并煎液、 过滤， 取滤液得到治疗急性痛风性关节炎的药物， 过滤后的滤液 可以再浓缩。按正常用量计， 第一次煎煮时间为 1.5-2.5 小时， 第二次煎煮时间为 0.5-1.5 小时。
为了更好的阐述本发明的实质， 下面将用本发明的药物的细胞实验、 动物实验、 临 床观察、 急性毒理试验及质量标准来说明在治疗急性痛风性关节炎中的作用。
一、 本发明的临床观察 ：
1. 对象与方法
1.1 对象及选择
1.1.1 纳入标准
符合原发性急性痛风性关节炎诊断标准， 中医风湿郁热症辨证标准。主症为关节 发红、 肿胀、 疼痛、 活动受限 ； 次症为口渴喜饮、 小便黄、 舌质红、 苔黄、 脉滑数。发作病程在 48h 以内。
1.1.2 排除标准
(1) 继发性痛风， 如类风湿性关节炎、 化脓性关节炎、 创伤性关节炎等 ；
(2) 痛风发作间歇期、 慢性痛风石性关节炎 ；
(3) 服用以下药物 ： 利尿剂、 吡嗪酰胺、 阿司匹林等 ；
(4) 妊娠期、 哺乳期妇女 ；
(5) 急性心、 脑血管病病人、 有严重外伤或接受手术者 ；(6) 严重感染者 ；
(7) 有明显肝胆疾病症状和体征或丙氨酸转氨酶或天冬氨酸转氨酶高于正常上限 的 2 倍者 ；
(8) 血清肌酐大于正常上限者 ；
(9) 严重慢性胃肠道疾病病人 ；
(10) 有明显血液系统疾病者 ；
(11) 有内分泌系统疾病， 如甲状腺功能亢进、 皮质醇增多症等 ；
(12) 有精神疾患药物或其他物品滥用者 ；
(13) 正在接受恶性肿瘤治疗者 ；
(14) 接受类固醇激素治疗者 ；
(15) 已知对本药组成成分过敏者。
1.1.3 分组
采用随机平行对照试验， 在门诊随机选取痛风急性期病人 75 例。按统计学随机数 字表出现的随机数字将患者随机分为治疗组和对照组， 秋水仙碱组 35 例， 其中 34 例男性， 1 例女性， 平均年龄 53.74±14.74 ； 本发明药物组 40 例， 其中 39 例男性， 1 例女性， 平均年龄 50.28±12.21。两组性别、 年龄、 BMI、 病情程度差别无统计学意义 (P ＞ 0.05)。 1.2 方法
1.2.1 基础治疗
(1) 卧床休息， 提高患肢， 避免过度劳累、 紧张、 受冷 ；
(2) 低嘌呤饮食， 禁止吸烟、 饮酒及进食动物内脏、 蛤、 蟹、 鱼虾、 肉类食物， 避免大 量进食黄豆类、 面粉类食物 ；
(3) 饮足够水， 每日 1500ml-2000ml ；
(4) 碱化尿液 ： 碳酸氢钠 1.0g， 日 3 次口服 ；
(5) 非甾体抗炎药物治疗 ： 双氯芬酸钠 75mg 或安康信 60mg， 日一次口服。
1.2.2 药物治疗
本发明药物组给予中药水煎剂 250ml( 同一产地， 统一熬制 )， 日二次， 疗程为 14 天。秋水仙碱组给予秋水仙碱 ( 每片 0.5mg)， 0.5mg 日二次， 连服 3 天， 后改为 0.5mg 日一 次， 疗程为 14 天。
1.2.3 观察指标
(1) 关节疼痛评分 ： 无压痛 0 分 ； 轻度压痛 3 分 ； 中度压痛， 尚能忍受 6 分 ； 重度压 痛， 痛不可触 9 分。
(2) 关节肿胀积分 ： 皮肤纹理、 骨突无改变， 关节无积液 0 分 ； 皮肤纹理变浅、 附近 骨突清晰可见， 关节积液少量 1 分 ； 皮肤纹理基本消失、 肿胀与骨突相平， 骨突标志不明显， 关节积液中等 2 分 ； 皮肤纹理完全消失、 肿胀高出骨突， 骨突标志消失， 关节积液多， 影响功 能活动 3 分。
(3) 关节活动受限 ： 关节活动自由 0 分 ； 活动受限， 但仍可从事正常活动 1 分 ； 活动 明显受限， 不能从事一般活动， 但能生活自理 2 分 ； 活动时疼痛难忍， 卧床， 生活不能自理 3 分。
(4) 实验室检查 ： 晨空腹检查血糖、 血脂 (TG、 TC)、 肝功 (ALT、 AST)、 肾功 (BUN、
Cr)、 血尿酸、 血常规、 C- 反应蛋白 (CRP)、 血沉 (ESR)， 以及利用酶联免疫法检测血清白介素 1-β(IL-1β)、 肿瘤坏死因子 -α(TNF-α)。
2. 结果
2.1 描述性结果
本发明药物组服药后 2-6h 疼痛症状缓解 ； 3-7 天红肿及活动受限减轻， 并逐渐消 失； 睡眠较前明显好转。
2.2 客观指标评定
2.2.1 关节疼痛、 肿胀及活动受限评分变化
两组关节疼痛及肿胀评分治疗前后差值比较均无显著性差异 (P ＞ 0.05)( 见表 1)。
2.2.2 生化指标比较
本发明药物组血 UA 和 AST 下降较秋水仙碱组明显 (P ＜ 0.05)， 余指标变化差值比 较无显著性差异 (P ＞ 0.05)( 见表 2)。
2.2.3 炎症指标变化
本发明药物组 IL-1β 下降较秋水仙碱组明显 (P ＜ 0.05)， WBC、 ESR、 CRP、 TNF-α 下降差值比较均无差异 (P ＞ 0.05)( 见表 3)。 2.3 不良反应
本发明药物组服药后无恶心、 呕吐， 个别患者大便次数 2-3 次 / 日， 无其他不良反 应发生。
3. 结论 ： 本发明药物通过减少 IL-1β 的分泌缓解炎症来达到治疗急性痛风性关 节炎的目的， 此作用机制不同于秋水仙碱但疗效与秋水仙碱相当， 且其降低尿酸和谷草转 氨酶作用优于秋水仙碱， 不良反应发生率低， 安全性较高。
二、 本发明的细胞实验 ：
1. 改善血管内皮细胞功能 ：
(1) 研究对象
①实验细胞 ： 人脐静脉血管内皮细胞株购买于 ATCC， 于青岛大学附属医院痛风病 实验室培养。
②实验动物 ： 健康健康雄性 Wistar 大鼠 36 只， 10 周龄， 体质量 (200±20)g， 由青 岛实验动物和动物实验中心提供 ( 质量合格证号 ： SCXK( 鲁 )20090007)， 饲养于青岛大学医 学院附属医院动物实验中心， 使用前适应性喂养 1 周， 饮食、 饮水、 活动正常， 无不良反应即 开始实验。整个实验过程中自由摄食和饮水。
(2) 实验方法
①含药血清的制备
采用公知的痛风合剂 ( 忍冬藤 30g、 虎杖 15g、 土茯苓 15g、 威灵仙 15g、 川芎 15g、 防 风 15g， 川牛膝 15g、 甘草 6g) ； 本发明药物 ( 穿山龙 15g、 忍冬藤 30g、 虎杖 15g、 土茯苓 15g、 威灵仙 15g、 川芎 15g、 防风 15g、 川牛膝 15g、 甘草 6g) 均由同仁堂药店熬制， 实验过程中所 用中药均一次性采购， 各生药混匀加水煎煮 2 遍， 取两次溶液混匀制成含生药 0.567g/ml、 0.635g/ml 的药液后浓缩成高浓度。 ( 人鼠体表换算后 10 倍浓度 )， 大鼠用高浓度痛风合剂 及优化方灌胃， 早晚各 1 次， 共 7 天， 末次灌胃后 1 小时处死大鼠， 3000r/min 离心 10min， 共
2 次， 分离血清， 直径 0.22μm 过滤器过滤， 56℃， 30min 灭活， -20℃保存。用培养基分别将 含药血清稀释成高、 中、 低 (80％、 40％、 10％倍 ) 浓度待用。
②尿酸盐溶液的制备
194mL 蒸馏水中加 6mLNaOH(1mmol/L)， 煮沸后加 1g 尿酸， 使尿酸钠完全溶解， 搅 拌， 自然降温， 用 1mmol/LHCI 调 PH 至 7.2， 搅拌冷却， 贮存于 4℃冰箱中 24h， 弃上清液， 用 滤纸将沉淀物水份吸干， 放入干燥箱， 70 ℃烘 2h， 取出刮下粉末， 研钵内研成细末， 用孔径 250μm 的金属筛过筛， 装瓶备用。 取出少许尿酸钠结晶于干燥箱 180℃高温 3h， 然后用 95％ 酒精洗涤离心 3000r/min， 3 次， 室温自然干燥。 将制好的尿酸盐 4mg， 加不含血清 RPMI-1640 40ml， pH 值 7.2 ～ 7.4mol/L， 配制 100μg/ml 的尿酸溶液。
③细胞的培养
液 氮 中 取 出 HUEVC， 放 入 37 ℃ 水 浴 箱， 待 融 开 后 移 入 15ml 离 心 管， 加 入 4ml RPMI-1640 培养液， 1000r/min、 5min， 弃上清液， 加入 10％的完全培养基 2ml 吹打均匀， 移入 预先加入 3ml 完全培养基的培养瓶中， 放入 37℃， 5％ CO2 培养箱。每 24 小时换液 1 次， 待 细胞生长至 80％ -90％融合， 经胰酶消化， 含 10％胎牛血清 RPMI-1640 培养液 3ml 中和， 轻 轻吹打几十下， 吸入 15ml 离心管离心， 去上清液， 加 10％胎牛血清 RPMI-1640 培养液 6ml， 打匀成悬液， 移入 50ml 细胞培养瓶中传代培养。 ④实验的分组和干预
细胞接板厚分为 12 组， 正常对照组、 模型组、 公知的痛风合剂组、 本发明药物组， 每组根据加入干预的血清。
浓度分为高、 中、 低三个剂量组。 待细胞融合达 80％以上， 加入 3ml 胰酶， 将细胞消 化下后， 加入 4ml 完全培养基， 1000r/min， 10min， 弃上清液， 用 10％的培养基将细胞稀释成 5 1×10 /ml， 接种于 48 孔板 (400μl)， 待细胞融合后， 吸取上清液， 然后 ：
对照组加入 1640 培养液和高、 中、 低浓度的 80％、 40％、 10％正常大鼠血清， 共培 养 48h ；
模型组加入 100μg/ml 尿酸盐溶液和高、 中、 低浓度的 80％、 40％、 10％正常大鼠 血清， 共培养 48h ；
痛风合剂组加入 100μg/ml 尿酸盐溶液和高、 中、 低浓度的 80％、 40％、 10％含药 血清， 共培养 48h ；
本发明药物组加入 100μg/ml 尿酸盐溶液和高、 中、 低浓度的 80％、 40％、 10％含 药血清， 共培养 48h。
⑤ MTT( 四唑盐比色法 )
培养 48h 后， 吸出上清液， 在每孔中加入 0.5mg/mlMTT 200μl， 孵育 4h 后弃上清 液， 加入 200μlDMSO， 在摇床上低速震荡 10min 后取出， 在多功能分析仪 485nm 处测 OD 值。
⑥ TNF-α 和 IL-1β 的检测 ( 严格按照说明书进行检测 )
吸出的上清液， 3000r/min， 15min 后， 提取上清液待测， 在 TNF-α 和 IL-1β 酶标包 被板上均先加样品稀释液 40μL， 然后再加待测样品 10μL， 轻轻晃动混匀， 37℃温育 30 分 钟。弃去液体， 甩干， 洗板。每孔加入酶标试剂 50μL， 轻轻晃动混匀， 37℃温育 30 分钟后洗 板。每孔先加入显色剂 A50μL， 再加入显色剂 B50μL， 轻轻震荡混匀， 37℃避光显色 10 分 钟。取出酶标板， 每孔加终止液 50μL， 终止反应 ( 此时蓝色立转黄色 )。在 450nm 波长下
测量各孔的吸光度值。 每个孔中 TNF-α、 IL-1β 吸光度分别除以相应的孔中 MTT 结果的 OD 值， 即为最终的 TNF-α、 IL-1β 水平。
(3) 实验结果 ：
1.MTT 结果
高、 中、 低 浓 度 模 型 组 中 细 胞 的 吸 光 度 显 著 低 于 相 应 浓 度 的 正 常 对 照 组 (P ＜ 0.05)， 各浓度组痛风合剂及本发明药物各组中， 痛风合剂低浓度组细胞的吸光度高于模 型组， 存在差异 (P ＜ 0.05)， 见表 4。
2. 痛风合剂及本发明药物对尿酸盐刺激血管内皮细胞 TNF-α 和 IL-1β 的影响
高、 中、 低浓度模型组中的 TNF-α 和 IL-1β 水平显著高于相应浓度的对照组 (P ＜ 0.05)， 痛风合剂及本发明药物各组中 TNF-α 水平和模型组相比无显著差异 (P ＞ 0.05)， 本发明药物高、 中浓度组中 IL-1β 显著低于模型组 (P ＜ 0.05)， 见表 5、 图 1、 图 2。
(4) 结论 ： 本发明药物含药血清抑制 IL-1β 的作用是减轻尿酸盐诱导的人血管内 皮细胞炎症损伤的机制之一。
2. 减轻胰岛素抵抗 ：
(1) 研究对象
中科院上海细胞库购得 ATCC 建系的 3T3-L1 小鼠脂肪前体细胞株， L1 是通过克隆 分离得到的 3T3(SwiSS 小白鼠 ) 的连续亚株。当细胞从快速分裂到长满且接触抑制时， 该 细胞经过前脂肪向脂肪样逆转。是国际上公认的研究脂肪细胞分化的细胞模型。
(2) 实验方法
① 3T3-L1 前体脂肪细胞传代培养 ：
待 3T3-L1 前体脂肪细胞铺满培养瓶底壁， 吸出培养瓶中的培养液， 加入含 0.25％ 胰蛋白酶的消化液 ( 用无 Ca2+、 M92+ 的 D-Hanks 液配制， 调 pH 值至 7.2-7.4)， 消化液的用 量以能覆盖细胞为度。置 37℃恒温箱中作用 2-3 分钟。消化过程中， 在光镜下监视细胞状 态， 一见细胞质回缩， 胞体趋于变圆， 即立即终止消化。吸出消化液， 用 PBS 液洗 1-2 次， 用 吸管轻缓吹打， 使细胞脱落。收集细胞于离心管中， 以 1000rpm 离心 5 分钟， 弃上清液。再 重复洗涤离心 1 次， 给细胞沉淀加入一定量的培养液， 轻轻吹打， 制成单细胞悬液。根据细 胞的密度按 1 ∶ 2 或 1 ∶ 3 比例接种于培养瓶中， 置 5％ cO2、 37℃细胞培养箱中静置培养。
② 3T3-L1 前体脂肪细胞诱导分化培养 ：
将 3T3-L1 脂肪前体细胞培养于含 10 ％胎牛血清的 DMEM 高糖培养液， 37 ℃ 5 ％ C02 培养箱孵育， 每 2d 换液。待细胞完全融合 48h 后开始诱导， 加含 0.5mmol/L 3 一异 丁基 -1- 甲基黄嘌呤， 1μmol/L 地塞米松， 10mg/L 胰岛素的完全培养液培养 48h， 换以含 10mg/L 胰岛素的培养液再培养 48h， 后换完全培养液继续培养， 2 天换液 1 次。诱导分化 8-12 天的 3T3 一 L1 细胞， 90％多呈脂肪细胞表型用于实验。
③油红 0 染色鉴定 ：
移去诱导分化结束的细胞培养基， 用 PBS 洗 3 次。 用 10％甲醛室温下固定细胞 1h， 弃去固定液。PBS 洗 3 次， 然后将细胞晾干 20rain。加入油红 O 溶液， 室温下染色 2h。弃去 染色剂， 用异丙醇洗去未着色的染剂， 然后用苏木精复染细胞核， 倒置显微镜下观察， 成熟 的脂肪细胞出现脂滴， 染色后呈红色， 细胞核呈蓝色。
④实验分组所有实验均在体外培养的经 3T3-L1 细胞诱导的脂肪细胞上进行。将造模成功的 细胞加入含 0.2％ BSA 的无血清培养液培养 12h 后， 细胞计数， 分组进行处理， 设空白对照 组、 模型组、 阳性对照组 ( 罗格列酮 )， 穿山龙水提物处理组 ( 高、 中、 低浓度 )， 上述各组分 别不加胰岛素处理和加胰岛素 (10μmol/L) 处理。因国内外尚无穿山龙及罗格列酮作用于 3T3-L1 细胞的相关文献， 穿山龙及罗格列酮浓度的设定参考国内外其在其他细胞培养中的 相关浓度。
空白对照组 Normal
模型组 Model
阳性对照组 ( 罗格列酮 )Ros
穿山龙水提物处理组 ( 高浓度 )DNM.H
穿山龙水提物处理组 ( 中浓度 )DNM.M
穿山龙水提物处理组 ( 低浓度 )DNM.L
⑤脂肪细胞糖摄取的分析
(1) 将 3T3-L1 细胞培养于 24 孔板， 诱导成功后， 将培养液更换为含 0.2％ BSA 的 无血清培养液培养 12h。 (2) 按分组将药物加入各组细胞， 孵育 48h。
(3) 将细胞置于含 0.2％ BSA 的 KRB 缓冲液中 37。C 平衡 2h。
(4) 非特异摄取孔加入细胞松弛素 B(25mmol/L)0.5μl 孵育 5 分钟后每孔加入含 5μCi2- 脱氧 3[H] 葡萄糖的 2- 脱氧葡萄糖混和液 25μl 准确计时孵育 5 分钟。
(5) 迅速吸去全部孵育液中止反应， 冰 PBS 洗涤细胞 3 次， 吸去洗涤液。
(6) 室温下干燥后每孔加入 500μlTriton-10030 分钟裂解细胞， 取 400μl 细胞裂 解液， 液闪计数器读数。
⑥细胞核蛋白的提取
按照细胞核蛋白提取试剂盒操作说明进行
(1) 取干预结束的细胞， 4 ℃离心， 500g， 3 分钟收集细胞， 弃去培养液， 用预冷的 PBS 洗涤两遍。
(2) 用移液枪取去上清， 估计细胞压积。
(3) 每 20μL 细胞压积中， 加入 200μl 预冷的 Buffer A， 最大转速涡旋剧烈振荡 15 秒， 放置冰上 10-15 分钟。
(4) 加入 11μl 冷 Buffer B， 最大转速涡旋剧烈振荡 5 秒， 放置冰上 1 分钟。
(5) 再次最大转速涡旋剧烈振荡 5 秒后， 4℃离心， 16000g， 5 分钟。
(6) 弃去上清， 将离心沉淀物中加入 100μL 预冷的 Buffer C， 最大转速涡旋剧烈 振荡 15 秒， 放置冰上 4 分钟， 每间隔 10 分钟涡旋剧烈振荡 15 秒。
(7)4℃离心， 16000g， 10 分钟， 将上清转入预冷的洁净微量离心管， 即得核蛋白。
⑦细胞核蛋白浓度的测定
按照 BCA 蛋白浓度测定试剂盒操作说明进行
(1) 配制工作液 ： 根据标准品和样品数量， 按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试 剂 B(50 ∶ 1) 配制适量 BCh 工作液， 充分混匀。
(2) 稀释标准品 ： 取 10 微升标准品用 PBS 稀释至 100μl( 标准品一般可用 PBS 稀
释 )， 使终浓度为 0.5mg/ml。将标准品按 0、 1、 2、 4、 8、 12、 16、 20μl 加到 96 孔板的蛋白标准 品孔中， 加 PBS 补足到 20μl。
(3) 加 4μl 体积样品到 96 孔板的样品孔中， 补加 PBS 到 20μl。
(4) 各孔加入 200μlBCA 工作液， 37℃放置 30 分钟。
(5) 冷却到室温， 用酶标仪测定 A562， 根据标准曲线计算出蛋白浓度。
⑧ EMSA 步骤 ：
按照 EMSA 试剂盒操作说明进行
NF-κB1 出 DNA 探针序列 ： 5’ -AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’ ； 3’ -TCAACT CCC CTC AAA GGG TCC G-5’
(1) 准备结合反应体系 ： 解冻反应试剂并将其与核蛋白分别置于冰上， 同时预冷 DNA 探针。根据说明书配置结合反应体系， 室温下平衡 20 分钟。每 20μl 反应体系加入 5μl 5X Loading Buffer， 吹打均匀。
(2) 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ： 制备 6％聚丙烯酰胺凝胶， 用预冷的 0.25XTBE 在冰上 100V 预电泳 1 小时， 上样前用电泳缓冲液冲洗加样孔 3-5 次 / 孔。将样品加于样品孔中， 低 温下 180V， 电泳 (3) 电转移 ： 将尼龙膜浸于 0.5XTBE 中 10 分钟， 将凝胶与尼龙膜装配进电转移夹， 并置于电转移槽， 在 0.5X TBE 中， 380mA 电转移 30 分钟。
(4) 交联固定 DNA ： 电转移完后， 移走滤纸。将结合膜取出。结合面朝上、 置紫外灯 下约 10cm 处交联 10 分钟。
(5) 化学发光反应 ： 从 4℃取出封闭液与 5x 洗涤液， 置于 37℃温浴使其溶解。将 结合膜浸于 20ml 1X 封闭液中， 室温孵育 15 分钟。弃封闭液， 将结合膜与新配制的 20ml Streptavidin-HRP 反应液在室温孵育 20 分钟。弃反应液， 用 1X 洗涤液室温洗膜 4 次， 每次 20ml， 每次 5 分钟。后将结合膜置于 30ml 平衡液在室温平衡 5 分钟。将结合膜从平衡液中 移出， 放于不吸水的平面上， 结合面为上面。将底物液均匀覆盖于膜的表面， 平衡 5 分钟后， 曝光， 成像。
(2) 实验结果 ：
1. 普通光镜下 3T3-L1 脂肪前体细胞形态倒置显微镜下， 3T3-L1 前体脂肪细胞呈 典型的梭形， 胞浆中无脂滴 . 形态与成纤维细胞相似 ( 图 3)， 当细胞完全汇合后， 处于生长 停滞， 但未见处于明显分裂相的细胞 ( 图 4)。
2. 细胞的诱导
3T3-L1 前体脂肪细胞发生融合和接触抑制的时候加以促分化液可以完成前脂肪 细胞向脂肪细胞的转化。3T3-L1 前脂肪细胞在分化培养基中诱导分化至第 2 天细胞体积 开始变丈， 局部出现小膨出， 随着时间的延长， 膨出越来越大， 膨出数目也逐渐增多， 诱导分 化第 4 天时， 细胞变大、 变固 . 胞质内可以观察到脂质小滴， 并随着分化的进展 . 胞质内的 脂漓迅速增多， 大小不等且多数在， 脂滴分弁于核周围， 形成 “戒环样” 结构。分化的 12-14 天大部分分化的脂肪细胞出现了小脂滴大量融合成大脂滴的情况， 细胞核被推向细胞的边 缘， 成为成熟的脂肪细胞。( 图 5、 图 6)
3. 细胞的鉴定
诱导分化后细胞， 倒置显微镜下所见大量变圆并有脂滴样物质形成的细胞， 使用
油红 0 染色的方法可以使分化的脂肪细胞内的脂质特异性的着色， 可见被染成亮红色的脂 肪滴， 而未分化的细胞和细胞内非脂质聚集的部分不能着色。( 图 7、 图 8)
4. 糖摄取
用药干预后， 穿山龙水提物处理组 ( 低浓度、 中浓度、 高浓度 ) 糖摄取率有逐渐增 高的趋势， 组间比较无明显差异， 且均明显高于模型组 (P 均＜ 0 05)， 与罗格列酮组比较差 异无显著性 (P ＞ 0 05)。同时在胰岛素的作用下， 各组的糖摄取率明显增加。( 见图 9)
5.NF-κB 的影响
用药干预后， EMSA 实验提示未加胰岛素处理时， 穿山龙水提物处理组 ( 低浓度、 中 浓度、 高浓度 ) 活化的核转录因子 NF-κB 表达量有逐渐减少的趋势， 且均明显低于模型组 (P 均＜ 0 05)， 与罗格列酮组比较差异无显著性 (P ＞ 0 05)。( 见图 10)
(3) 结论 ：
1. 穿山龙水提物可抑制成熟脂肪细胞细胞核内活化的核转录因子 NF-κB 的表 达。
2. 穿山龙水提物可促进成熟脂肪细胞的糖摄取。
3. 穿山龙可能具有改善胰岛素抵抗的作用， 其机制可能是通过抑制脂肪细胞中核 转录因子 NF-κB 的活化， 进而抑制炎症反应来实现的。 三、 本发明的动物实验 ：
1. 改善脂代谢 ：
(1) 实验药物 ：
穿山龙为薯蓣科植物穿龙薯蓣的干燥根茎， 又名野山药具有活血舒筋、 消食利水、 祛痰截疟之功效， 本实验用其水提物， 主要成分穿山龙总皂苷， 含量 90％， 其余成分为糖类 及黄酮等， 水煮醇沉法提取。
(2) 实验动物 ：
雌性 SPF 级 Wistar 孕鼠 8 只， 体重 430 士 20g， 购自青岛市实验动物和动物实验中 心， 质量合格证号 SCXK( 鲁 )20030010。饲养于青岛大学医学院附属医院动物实验中心， 清 洁级饲养， 整个饲养过程中保持温度 18-22℃， 湿度 40％ -60％， 人工光照， 明暗各 12h/d， 自 由摄食、 摄水。基础饲料热卡配比 ： 碳水化合物占 60％， 蛋白质占 25％， 脂肪占 100,6( 植物 脂肪为主 )， 维生素及矿物质等成分占 5％。
(3) 实验方法
①造模及治疗方法
将 8 只 Wistar 孕鼠分笼饲养， 每笼一只， 等待产仔。孕 28-40 天时， 8 只大鼠产仔 共 96 只， 新生鼠于出生第 2 天起， 分为两组， 一组皮下注射 L- 谷氨酸钠 4g.kg-1.d-1， 即 MSG 模型组 ； 一组注射等量生理盐水， 作为正常对照组。连续 7d。21d 后断乳， 定期记录体重， 观 察体型变化。 两组一直饲以普通饲料。 4w 龄时将雌性、 雄性大鼠分笼饲养。 12W 龄时测量体 重， 体长， 计算 Lee’ s 指数。20w 龄时挑选体重增长较大雄性大鼠 30 只随机分为穿山龙总 皂苷组 (n ＝ 10)、 文迪雅组 (n ＝ 10)、 模型对照组 (n ＝ 10)， 将正常对照组 7 只大鼠一起纳 入本研究。称体重， 量体长， 过夜空腹， 在乙醚麻醉下经内眦静脉丛取血测高密度脂蛋白胆 固醇 (HDL-C)， 总胆固醇 (TC)、 甘油三酯 (TG)、 胰岛素 (Ins)， 强生血糖仪测空腹血糖 (FBG)。 以与正常组差别有统计学意义为造模成功。 各指标测定质控值 TG 为 1.49±0.06mmol/l， TC
为 5.51±0.20mmol/l， Ins 批内差异＜ 5％， 批间差异＜ 10％。穿山龙总皂苷组给予穿山龙 总皂苷 + 二甲基亚砜、 将其配制成总皂苷浓度为 4mg/ml 溶液， 文迪雅组文迪雅 + 二甲基亚 砜， 将文迪雅配制为 3.3％混合溶液， 每日灌胃一次。模型对照组、 正常对照组按 1ml/100g 分别予以蒸馏水 + 二甲基亚砜灌胃。至总灌胃 8w 时再次测体重、 量体长， 过夜空腹， 在乙醚 麻醉下经内眦静脉丛取血测 HDL-C、 TC、 TG、 Ins， 血糖仪 FBG， 1％的戊巴比妥钠以 20mg/kg 体 重腹腔注射麻醉处死， 剥离肾周及腹膜后脂肪， 称取其重量。留取肝脏、 肾脏、 胰腺、 脂肪组 织以液氮保存。并留取肝脏、 胰腺以 10％中性福尔马林固定。采用 HE 染色对肝脏进行组 织形态学观察。整个实验过程中除自然死亡的大鼠外， 数据保留完整的大鼠分别为正常组 7 只、 穿山龙总皂苷组 7 只、 文迪雅组 7 只、 模型对照组 8 只。
②胰岛素放射免疫分析技术实验方法 ：
(1)Ins 标准品的配制 ： 向各标准瓶中分别准确地加入 1ml 缓冲液溶解。 溶解 15 分 钟后摇匀方可使用。溶解后各标准浓度分别为 5、 10、 20、 40、 80、 160Uiu/ml。 125
(2) I-Ins 以 5ml 缓冲液溶解。豚抗 -Ins. 抗体以 10ml 缓冲液溶解。
(3) 在 NSB 管中加入缓冲液 200μl， 零管中加入缓冲液 100μl。
(4) 在各标准管 (S1-S6) 中分别加入标准品 100μl。
(5) 在各样品管中分别加入待测血清 100pl。
(6) 各管 ( 包括总 T 管 ) 加入 125I-Ins 100μl。
(7) 除总 T 管、 NSB 管外， 各管加入豚抗 -Ins 抗体 100μl。
(8) 混匀， 37℃孵育 120 分钟。
(9) 除总 T 管外， 各管加入驴抗豚免疫分离剂 500μl。
(10) 充分摇匀后， 室温放置 15 分钟， 3500 转 / 分钟离心 15 分钟， 吸弃上清， 测各 管沉淀的放射性计数 (cpm)。
③切片
(1) 挂胶 ： 用丙酮将 AEPC 1 ∶ 50 稀释， 将玻片浸入其中片刻， 取出后在丙酮中浸 泡 2-3 分钟， 取出晾干， 标号， 以备制片。
(2) 切片 ： 将蜡块固定于切片机上， 切片厚度为 3-5μm， 切好后在温水槽中展片， 用已挂胶的玻片捞出 ( 普通 HE 染色的病理切片则用未挂胶的玻片直接捞出 )。 置烤片机上 烤干。
④ HE 染色
(1) 脱蜡 ： 将玻片置于二甲苯 I 中 5 分钟→二甲苯 II5 分钟。
(2) 水化 ： 100％乙醇 1 分钟→ 95％乙醇 I 1 分钟→ 95％乙醇 II1 分钟→ 85％乙 醇 1 分钟→水冲洗 4-5 分钟。
(3)HE 染色 ： 明矾苏木素 4-5 分钟→ 1 ％盐酸酒精蘸洗， 时间以片子颜色而定 → 1％氨水片刻→水冲洗 4-5 分钟→ 85％乙醇 1-2 分钟→伊红 2.3 分钟。
(4) 脱水 ： 95％乙醇 I 20-30 秒→ 95％乙醇 II 20-30 秒→ 100％乙醇 20-30 秒。
(5) 透明 ： 石碳酸二甲苯 20-30 秒→二甲苯 I 20-30 秒→二甲苯 II20-30 秒。
(6) 中性树胶封片。
(4) 实验结果 ：
1. 模型制备及药物干预(1)12w 龄时 MSG 组大鼠体重明显高于正常对照组， 尾短， 体型也表现出明显的向 心性肥胖 ( 见图 11-12)。16w 龄时 MSG 组大鼠除了体重明显高于正常对照组， 明显的腹型 肥胖外， Lee’ s 指数也明显的高于正常对照组 (P ＜ 0.01)( 见表 6)。肉眼观察 MSG 组皮下 脂肪也相当肥厚。
(2)20w 时各组大鼠血生化、 Lee’ S 指数和 IRI 的比较 ： 各实验组大鼠 TG、 TC、 Ins、 HDL.C、 BG 及 Lee’ S 指数与对照组差别有明显意义 (P ＜ 0.01)， 反映胰岛素抵抗性的胰岛 素抵抗指数 (IRI) 在实验组和正常对照组之间差别也具有统计学意义 (P ＜ 0.01)。 各实验 组之间各指标差别无显著性 (P ＞ 0.05)。( 见表 7、 表 8)。
2. 各组大鼠用药后的疗效
肉眼观察灌胃治疗后各实验组大鼠体型无明显改变， 仍为明显的向心性肥胖， 体 重、 皮下脂肪含量 ( 见图 13) 均较治疗前增加。实验室测得指标如下 ：
(1) 胰岛素水平变化 ： 治疗前后正常组胰岛素水平无明显变化 (P ＞ 0.05)， 模型对 照组胰岛素进一步升高， 为 18.06±6.73μU/ml( 约 33.58％ )(P ＜ 0.01)， 文迪雅组和穿山 龙总皂苷组胰岛素水平较对照组有所恢复， 但未恢复到正常水平， 其中穿山龙总皂苷组药 物治疗两月后胰岛素较治疗前减少 14.22 士 7.08μU/ml( 约 25.58％ )(P ＜ 0.01)， 文迪雅 组胰岛素减少 16.78 士 10.65μU/ml( 约 27.31％ )(P ＜ 0.01)， 但两组差值比较无统计学 意义 (P ＞ 0.05)。
(2)TG、 TC、 HDL-C 变化 ： 治疗后穿山龙总皂苷组和文迪雅组 TG 分别下降 1.24 士 0.69mmol/L( 约 51％ ) 和 1.22 士 0.63mmol/L( 约 51％ )， 与治疗前相比差异有显著性 (P ＜ 0.01)， 两组比较差别亦无统计学意义 ((P ＞ 0.05) ； 模型对照组进一步升高， 升高了 1.07 士 0.5mmol/L(P ＜ O.01) ； 正常组稍有升高， 但升高不明显， 升高了 0.03 士 0.01mmol/ L(P ＞ 0.05)。
药 物 治 疗 两 月 后 穿 山 龙 总 皂 苷 组 TC 较 治 疗 前 下 降 0.35 士 0.18mmol/L( 约 14.89％ )， 与治疗前相比差异有显著性 (P ＜ 0.05)， 文迪雅组下降 0.25 士 0.34mmol/L( 约 10.55％ )(P ＞ 0.05)， 但两组差值比较无统计学意义 (P ＞ 0.05) ； 而对照组升高了 0.15 士 0.37mmol/L(P ＞ 0.05)。
HDL-C 变化 ： 治疗后穿山龙总皂苷组和文迪雅组 HDL-C 分别升高 0.44±0.42mmol/ L( 约 40.74 ％ ) 和 0.40±0.23mmol/L( 约 35.40 ％ )， 与 治 疗 前 相 比 差 异 有 显 著 性 (P ＜ 0.01)， 但两组差值比较无统计学意义 (P ＞ 0.05) ； 模型对照组进一步下降， 下降了 0.35 士 0.38mmol/L(P ＜ 0.05) ； 正常组稍有下降， 下降了 0.01 士 0.20mmol/L(P ＞ 0.05)。
(3)BG 变化 ： 治疗后穿山龙总皂苷组血糖下降最为明显， 文迪雅组次之， 两组分别 下降 1.24 士 0.66mmol/L( 约 20.77％ ) 和 1.11 士 0.68mmol/L( 约 18.17％ )， 与治疗前相 比差异均有显著性 (P ＜ 0.01)， 但两组差值比较无统计学意义 (P ＞ 0.05) ； 而正常组和对 照组分别下降 0.77 士 1.49mmol/L 和 0.57 士 0.96mmol/L， 与治疗前相比差异无显著性 (P 均＞ O.05)。
(4) 胰岛素抵抗指数 (IRI) 比较 ： 治疗后穿山龙总皂苷组 Irl8.70 士 2.47， 下降了 约 40.61％， 文迪雅组 IRI 9.42 士 2.09 下降了约 42.10％， 两者相比无差异 (P ＞ 0.05)。 ( 以上指标见表 9、 10)。
3. 肝脏腼染色结果 ( 见图 14)。(5) 结论 ： 穿山龙与文迪雅有相似的胰岛素增敏效果， 并能调脂降糖。穿山龙水提 物其有效成分为穿山龙总皂苷， 能够降低肥胖胰岛素抵抗大鼠的 INS、 TC、 TG、 FBG， 并升高 HDL-C， 降低 IRI。 且试验发现穿山龙总皂苷降低 TC 的作用似乎优于文迪雅， 肝脏 HE 染色显 示穿山龙总皂苷能显著改善脂肪肝， 其作用也优于文迪雅。
2. 有效抑制急性痛风性关节炎发作 ：
(1) 研究对象
实验动物 ： 健康雄性 Wistar 大鼠 54 只， 10 周龄， 雄性， 体质量 (180±20)g， 由青岛 实验动物和动物实验中心提供 ( 质量合格证号 ： SCXK( 鲁 )20100010)， 饲养于青岛大学医学 院附属医院动物实验中心， 使用前适应性喂养 1 周， 饮食、 饮水、 活动正常， 无不良反应即开 始实验。整个实验过程中自由摄食和饮水。
(2) 实验方法
①药物的配置与浓度确定
痛风合剂 ( 忍冬藤 30g、 虎杖 15g、 土茯苓 15g、 威灵仙 15g、 川芎 15g、 防风 15g， 川牛 膝 15g、 甘草 6g)， 本发明药物 ( 穿山龙 15g、 忍冬藤 30g、 虎杖 15g、 土茯苓 15g、 威灵仙 15g、 川芎 15g、 防风 15g、 川牛膝 15g、 甘草 6g) 均由同仁堂药店熬制， 实验过程中所用中药均一 次性采购， 生药混匀加水煎煮 2 遍， 取两次溶液混匀制成含生药 0.567g/ml、 0.635g/ml 的药 液后浓缩成低、 中、 高浓度。( 以人鼠体表面积用药量直接换算后剂量的 2 倍、 5 倍、 10 倍为 低、 中、 高剂量 ) 高温消毒后封瓶， 置冰箱中保存备用。 ②实验分组与给药
54 只大鼠随机分为 9 组 ：
正常对照组 ；
模型组 ；
西药组 ；
痛风合剂高、 中、 低浓度组 ；
本发明药物高、 中、 低浓度组。
每组 6 只。常规饲养 1 周， 灌胃前秤取重量， 按照 0.01mL/g 的剂量正常对照组、 模 型组灌取生理盐水、 西药组灌取吲哚美辛混悬剂 (2.25g/ml) ；
痛风合剂组灌低、 中、 高浓度的痛风合剂汤剂 (1.14g/ml、 2.84g/ml、 5.67g/ml) ；
本发明药物组灌低、 中、 高浓度的汤剂 (1.27g/ml、 3.18g/ml、 6.35g/ml) ；
各组分别灌胃 1 周， 早晚各 1 次。
③尿酸钠溶液的制备
取 194mL 蒸馏水加 6mL NaOH(1mmol/L)， 煮沸后加 1g 尿酸， 用 1mmol/L HCI 调 PH 至 7.2， 搅拌冷却， 贮存于 4oC 冰箱中 24h， 去上清液， 用滤纸将沉淀物水份吸干， 干燥即可得 尿酸钠结晶。实验前尿酸钠结晶 180℃ 3h， 然后用体积分数 95％乙醇洗涤， 3000r/min 离心 15min， 共 3 次， 室温自然干燥， 取 250mg 尿酸钠结晶加 9ml 生理盐水， 1ml 吐温 80， 加热搅拌， 配制成 10ml 25mg/ml 尿酸钠溶液。
④造模方法
灌胃第 4 天 ( 造模前 ) 再次称取体质量， 灌胃后 1h 用缚线法测取右侧距小腿关节 周径 ( 取均值 )， 然后制备痛风模型。 模型组、 西药组组、 痛风合剂的低、 中、 高剂量组和本发
明药物的低、 中、 高剂量组大鼠均酒精消毒右侧距小腿关节， 用 6 号注射针在受试大鼠右侧 距小腿关节背侧从 45℃方向插入胫骨肌腱内侧， 将质量浓度为 25mg/ml(0.05mL) 的尿酸钠 溶液注入距小腿关节腔， 伸曲、 旋转运动 10min。对照组大鼠关节腔注射 0.05mL 生理盐水。
⑤指标测定
造模前一天大鼠上下午关节周径 ： 用缚线法测取右侧距小腿关节同一部位周径 ( 取均值 )。
痛风大鼠体质量增加量 ： 灌药前、 造模前、 造模后 24、 48、 72 小时称重， 并以本次和 前一次的差值作为体质量增加量。
关节肿胀度 ： 造模后 2、 4、 6、 8、 10、 12、 24、 48、 72h 用缚线法测取右侧距小腿关节同 一部位周径 ( 取均值 )， 关节肿胀度以各检测点的周径减去造模前关节周径后除以造模前 周径计算。
血浆白细胞计数 ： 造模后 72 小时后， 取 EDTA 抗凝血， 6 小时内在显微镜下进行白 细胞计数。
IL-1β 水平 ： 造模后 72 小时处死大鼠， 静脉取血， 静止 4h 后， 3000r/min 离心 15min 离心， 取上清液双夹心酶免法检测白细胞介素 1β。 大鼠关节病理改变的观察 ： 造模 72h 后处死各组大鼠， 分别取其踝关节于 10％中 性福尔马林溶液固定， 5％的硝酸脱钙， 常规脱水、 透明、 包埋、 切片和苏木素一伊红染色。 光 镜下观察局部病理组织学变化。
(3) 实验结果 ：
1. 描述性结果
纳入大鼠 54 只， 均进入结果分析， 无脱失。 Wista 大鼠造模后， 随着尿酸盐的浸润， 大鼠关节肿胀逐渐增加， 有明显红、 肿、 热的表现， 并将肿胀的关节抬起 ； 将大鼠放在地面活 动， 出现明显的跛行、 甚至将患肢脱离地面 ； 有的大鼠烦躁不安， 撕咬其他大鼠。 对照组大鼠 无明显躁乱表现， 关节与造模前相比略有增粗， 无明显红热表现， 无跛行。
2. 推断结果
2.1 造模前同一天上下午踝关节周径的比较， 结果显示上下午踝关节无显著差异 (P ＞ 0.05)。( 见表 11， 图 15)
2.2 痛风合剂及本发明药物对痛风性关节炎大鼠体质量增加的影响
灌药前大鼠常规饲养， 体重后无显著差异 (P ＞ 0.05)。造模前 ( 灌胃第四天 )， 痛风合剂及本发明药物高浓度组、 西药组、 痛风合剂低浓度组大鼠体重的增加显著低于其 他组 (P ＜ 0.05)， 造模后第 1、 2 天西药组、 痛风合剂及本发明药物组显著高于模型组 (P ＜ 0.05)， 造模后第 3 天， 与模型组相比体重的增加并无差异， 但均低于对照组 (P ＜ 0.05)。 ( 见表 12， 图 16-17)
2.3 痛风合剂及本发明药物对痛风性关节炎大鼠关节肿胀度的影响
与正常对照组比较， 造模后大鼠关节肿胀度各组均有所增高 (P ＜ 0.05)， 其中 以模型组最为明显， 药物治疗后， 与模型组比较， 用药组肿胀度均下降低， 存在差异 (P ＜ 0.05)， 高浓度组和吲哚美辛效果相当 (P ＞ 0.05)。( 见图 18)
2.4 痛风合剂及本发明药物对痛风性关节炎大鼠血浆白细胞计数的影响
对照组血浆白细胞计数明显低于模型组、 痛风合剂及本发明药物各剂量组 (P
＜ 0.05)， 且以模型组最为显著， 痛风合剂及本发明药物高剂量组与模型组差异明显 (P ＜ 0.05)。( 见图 19)
2.5 痛风合剂及本发明药物对痛风性关节炎大鼠血清 IL-1β 的影响
模型组和痛风合剂及本发明药物低、 中剂量均高于对照组 (P ＜ 0.05)。痛风合剂 及本发明药物高浓度组大鼠血清 IL-1β 水平低于模型组 (P ＜ 0.05)。( 见表 13， 图 20)
2.6 痛风合剂及本发明药物对急性痛风性关节炎大鼠滑膜组织病理学的影响 (HE 染色 ×200)
病理组织学结果显示， 痛风合剂及本发明药物可减轻痛风性关节大鼠踝关节的组 织水肿和炎性细胞浸润， 改善滑膜增生， 且浓度越高作用越明显。( 见图 21-29)
(4) 结论 ： 痛风合剂及本发明药物可以有效抑制急性痛风性关节炎发作， 且该作 用呈一定的剂量依赖性。
四、 本发明的急性毒理试验 ：
1. 材料和方法
1.1 本发明药物浓缩液 125ml/ 瓶， 为棕褐色液体， 密闭， 置 4℃冰箱保存， 本品临床 成人 ( 按 60kg 体重 ) 每日 2 次， 每次 125ml， 即临床人用剂量为 4.17ml/kgBW。
1.2 实验动物 ： 昆明种小鼠， SPF 级， 由青岛市实验动物和动物实验中心提供。 实验 动物生产许可证 ： SCXK( 鲁 )20090007。
1.3 实验方法 ：
1.3.1 预实验
样品制备 ： 由青岛大学医学院附属医院制备的五倍浓缩液， 共 125ml。
称取 18-22g 健康小鼠 4 只， 雌雄各半， 于实验前一天观察一天， 禁食不禁水 16 小 时。于一日内按 0.8ml/20gBW 用浓缩液给小鼠灌胃两次。按体重计算， 剂量为 80ml/kgBW。 一日内小鼠全部成活， 未见异常。
1.3.2 最大耐受量实验
称取 18-22g 健康小鼠 40 只， 雌雄各半， 20 只为给药组， 另 20 只为阴性对照组， 于 实验前一天观察一天， 禁食不禁水 16 小时。于一日内按 0.8ml/20gBW 用浓缩液给给药组小 鼠灌胃两次， 用蒸馏水给对照组小鼠灌胃 2 次。按体重计算， 剂量为 80ml/kgBW。
2. 结果
灌胃后观察每只小鼠均未见异常。 继续观察 14 天， 动物均健康生存。 其外观、 行为 活动、 精神状态、 饮食、 大、 小便及其颜色、 被毛、 呼吸等均正常， 鼻、 眼、 口腔无异常分泌物， 体重增长正常。经解剖观察动物心、 肝、 脾、 肺、 肾等主要脏器均未见异常。
3. 小结
给小鼠灌胃本发明药物， 测得小鼠一日最大耐受量为 80ml/kgBW( 相当于原液 400ml/kgBW)， 为临床人用剂量的 96 倍。
五、 本发明的质量标准 ：
按处方 ： 穿山龙 15g 虎杖 15g 忍冬藤 30g 防风 15g 威灵仙 15g 土茯苓 15g 川牛膝 15g 川芎 15g 甘草 6g 加水煎煮 2 次， 第一次 2 小时， 第二次 1 小时， 合并煎液， 滤 过， 滤液浓缩至 1000ml， 灌封， 灭菌， 即得。
3. 性状 ： 本品为棕褐色液体 ； 味苦。4. 鉴别 ：
(1) 取样品 10ml， 加 2.5mol/L 硫酸溶液 5ml， 水浴加热 30 分钟， 放冷， 用二氯甲烷 提取 2 次， 每次 10ml， 合并二氯甲烷液， 蒸干， 残渣加二氯甲烷 1ml 使溶解， 作为供试品溶液。 另去虎杖对照药材 0.1g， 同法制成对照药材溶液。 再取大黄素对照品， 加甲醛制成每 1ml 含 1mg 的溶液， 作为对照品溶液。照薄层色谱法 ( 中国药典 2010 年版一部附录 VI B) 试验， 吸取上述供试品溶液和对照药材溶液各 2μl、 对照品溶液 1μl， 分别点于同一硅胶 G 薄层 板上， 以石油醚 (30-60℃ )- 甲酸乙酯 - 甲酸 (15 ∶ 5 ∶ 1) 的上层溶液为展开剂， 展开， 取 出， 晾干， 置紫外灯光 (365nm) 下检视。供试品色谱中， 在与对照品色谱相应的位置上， 显相 同颜色的荧光斑点。
(2) 取样本 15ml， 加乙酸乙酯 20ml， 超声处理 5 分钟， 弃取乙酸乙酯液， 残渣自 “加 乙酸乙酯 20ml” 起同法重复处理 1 次。残渣加入稀盐酸溶液 10 滴， 加乙酸乙酯 20ml， 超声 处理 5 分钟， 取乙酸乙酯液， 残渣自 “加乙酸乙酯 20ml” 起同法重复处理 2 次， 合并乙酸乙酯 液， 蒸干， 残渣加 1ml 甲醛溶液， 作为供试品溶液。另取绿原酸对照品， 加甲醛制成每 1ml 含 0.5mg 的溶液， 作为对照品溶液。照薄层色谱法 ( 中国药典 2010 年版一部附录 VI B) 试验， 吸取上述两种溶液各 1μl， 分别点于同一聚酰胺薄膜板上， 以乙酸为展开剂， 展开， 取出， 晒 干， 置紫外光灯 (365nm) 下检视。供试品色谱中， 在与对照品色谱相应的位置上， 显相同颜 色的荧光斑点。
5. 检查 ： 相对密度应不低于 1.02( 中国药典 2010 年版一部附录 VII A)。
pH 值应为 3.5-5.5( 中国药典 2010 年版一部附录 VII G)。
其它应符合合剂项下有关的各项规定 ( 中国药典 2010 年版一部附录 IJ)。
6. 含量测定 ： 大黄素照高效液相色谱法 ( 中国药典 2010 年版一部附录 VID)。
色谱条件与系统适用性试验 ： 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂， 甲醛 -0.1％磷 酸溶液 (80 ∶ 20) 为流动相， 检测波长为 254nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于 3000。
供试品溶液的制备 ： 取样品 10ml， 精密加入二氯甲烷 25ml 和稀盐酸溶液 15ml， 称 取定重量， 置 80℃水浴中加热回流 2 小时， 冷却至室温， 再称定重量， 用二氯甲烷补足减失 的重量， 摇匀。分取二氯甲烷液， 精密量取 10ml， 蒸干， 残渣加甲醛使溶解， 转移至 5ml 量瓶 中， 加甲醛稀释至刻度， 摇匀， 即得。
测量法 ： 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 5μl， 注入液相色谱法仪， 测 定， 即得。
本发明药物每 1ml 含虎杖以大黄素 (C15H10O5) 计， 不得少于 0.04mg。
7. 功能与主治 ： 祛风除湿， 活血化瘀， 通络止痛， 用于痛风性关节炎的急性发作。
8. 用法与用量 ： 口服。一次 125ml， 一日 2 次。
9. 贮存 ： 密封保存。
六、 本发明的指纹图谱
1. 仪器与试药
Agilent1200 高 效 液 相 色 谱 仪 ； 虎 杖 苷， 中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所， 批号 ： 111575-200502 ； 马钱苷， 中国药品生物制品检定所， 批号 ： 11640-200503 ； 绿原酸， 中国药 品生物制品检定所， 批号 ： 110753-200413 ； 乙腈， HPLC/Spectro， TEDIA Company ； 三氟乙 酸， HPLC/Spectro， TEDIA Company ； 本发明药物 (125mL/ 瓶 )， 青岛大学附属医院提供。2. 供试品溶液的制备 本发明药物原液适量， 离心 (10000r/min)， 取上清液过 0.45μm 滤膜， 取续滤液， 3. 色谱条件 色谱柱 ： Waters 公司， Symmetry C18(4.6×250mm， 5μm) ； 流速 ： 1mL/min 柱温 ： 30℃ 进样体积 ： 10μL 检测波长 ： 263nm 流动相 ： 0.02％三氟乙酸 (A 相 ) ∶乙腈 (B 相 ) 进行梯度洗脱。梯度洗脱程序见即得。
表 14. 3.3D 扫描图
根据扫描结果， 在 263nm 下峰数较多， 峰形较好。( 见图 30)
4. 结果
色谱图见图 31， 共确定三个已知峰 ： 虎杖苷、 绿原酸和马钱苷 .
注： 1 为绿原酸 ； 2 为马钱苷 ； 3 为虎杖苷
本发明药物中， 绿原酸浓度为 205.6μg/mL(25.7mg/ 瓶 )， 马钱苷浓度为 36.2μg/ mL(4.5mg/ 瓶 )， 虎杖苷浓度为 149.2μg/mL(18.6mg/ 瓶 )。
原始积分图 ( 见图 32 及表 15)
临床病例 1 ： 魏 XX， 男， 28 岁， 山东省青岛市人， 2010.9.14 就诊。右足关节反复发 作痛风 3 年余， 加重 3 天。3 天前因进食油腻食物后出现右足背部疼痛， 皮肤发红， 压痛明 显， 夜间明显。查尿酸 499μmol/L。建议低嘌呤饮食， 多饮水， 避免劳累。给予本发明药物 125ml 日二次， 友来特 3g 日二次口服。于 5 天后症状较前明显好转， 治疗同前， 7 天后痊愈， 无不良反应发生。
临床病例 2 ： 孙 XX， 男， 42 岁， 山东省青岛市人， 2011.1.29 就诊。右足背部反复疼 痛 1 年余， 加重 1 天。 1 天前无明显诱因出现右足背部红肿热痛， 有明显压痛， 严重影响行走 及睡眠。有痛风病家族史。给予本发明药物 125ml 日二次， 友来特 3g 日二次， 戴芬 75mg 日 一次口服， 于 7 日后关节肿胀， 疼痛明显好转， 皮肤不红， 仍有轻压痛， 继续给予继续服用本 发明药物， 于 4 日后痊愈， 无不良反应发生。
临床病例 3 ： 张 XX， 男， 67 岁， 山东省青岛市人， 2010.9.14 就诊。双足关节反复发 作痛风 3 月余， 加重 8 天。 3 月前因进食海鲜、 啤酒出现双足背部疼痛， 皮肤发红， 压痛明显， 夜间明显， 严重影响行走和睡眠。 查尿酸 457μmol/L。 建议低嘌呤饮食， 多饮水， 避免劳累。 给予本发明药物 125ml 日二次， 乐松 60mg 日二次， 友来特 3g 日二次口服。于 7 天后症状较 前明显好转， 查尿酸 397μmol/L， 无不良反应发生。
临床病例 4 ： 张 XX， 男， 84 岁， 山东省青岛市人， 2011.5.23 就诊。右足第一跖趾关 节反复肿胀、 疼痛 7 年， 加重 7 天。患者 7 天前无明显诱因出现右足第一跖趾关节肿痛， 无 发热， 查尿酸 468μmol/L， 给予本发明药物 125ml 日二次， 友来特 3g 日二次， 戴芬 75mg 日一 次口服治疗， 6 日后症状明显好转， 据需给予本发明药物 125ml 日二次， 友来特 3g 日二次治 疗， 7 日后痊愈。
表 1 两组治疗前后关节疼痛、 肿胀及活动受限评分差值比较
表 2 两组治疗前后生化指标差值比较
注： GLU 血糖 ； TG 甘油三酯 ； TC 胆固醇 ； AST 谷草转氨酶 ； ALT 谷丙转氨酶 ； BUN 尿素 * ** 氮； Cr 肌酐 ； UA 尿酸。与秋水仙碱组比 P ＜ 0.05 P ＜ 0.01
表 3 两组治疗前后炎症指标差值比较
注： WBC 白细胞数 ； ESR 血沉 ； CRPC- 反应蛋白 ； IL-1β 白介素 -1β * TNF-α 肿瘤坏死因子 -α。与秋水仙碱组比 P ＜ 0.05 表 4 痛 风 合 剂 及 本 发 明 药 物 对 尿 酸 盐 刺 激 血 管 内 皮 细 胞 MTT 的 影 响 (x±s，n)
△ 与对照组比较， P ＜ 0.05 ； 与模型组比较▲ P ＜ 0.05 表 5 痛风合剂及本发明药物对尿酸盐刺激血管内皮细胞 TNF-α 和 IL-1β 的影响 ( 转化成 lnX， 用 X±S， ng/L)
△ 与对照组比较， P ＜ 0.05 ； 与模型组比较▲ P ＜ 0.05 表 6MSG 组大鼠和正常组 (NOR) 大鼠在各实验阶段的体重、 体长及 Lee’ s 指数
注： BG 代表体重 (g)， BL 代表体长 (cm)。 表 720w 龄 ( 干预前 ) 各组大鼠生化指标值
* 注： 与正常组相比， P ＜ 0.05. 表 820w 龄 ( 干预前 ) 各组大鼠体重、 体长及 Lee’ s 指数
* 注： 与正常组相比， P ＜ 0.05。H 代表 Lee’ s 指数方差不齐， 后做秩和检验结果。 表 928w 龄 ( 干预两月后 ) 各组大鼠的生化指标值
○* △ 注： 与正常组相比， P ＜ 0.05 ； 与模型对照组相比， P ＜ 0.05 ； 与文迪雅组相比，P ＜ 0.05 ； 与穿山龙总皂苷组相比， ＜ 0.05。H 代表 IRI 方差不齐， 后做秩和检验结果。表 1028w 龄 ( 干预两月后 ) 各组大鼠的体重、 体长、 Lee’ s 指数及脂肪含量
○* △ 注： 与正常组相比， P ＜ 0.05 ； 与模型对照组相比， P ＜ 0.05 ； 与文迪雅组相比，P ＜ 0.05 ； 与穿山龙总皂苷组相比， ＜ 0.05。 表 11 大鼠造模前同一天上下午踝关节周径 (x±s， n ＝ 6， cm)
表 12 痛风合剂及优化方对痛风性关节炎大鼠体质量增加的影响 (x±s， n ＝ 6， g)
与对照组相比 *p ＜ 0.05， 与模型组相比 **p ＜ 0.05 表 13 72h 大鼠血清中 IL-1β 水平 (x±s， ng/L)
与对照组相比 *P ＜ 0.05， 与模型组相比 **P ＜ 0.05 表 14 溶剂梯度洗脱程序 I
表 15 本发明药物原始积分图参考数据